歐陽(yáng)霖王小光宋馳萍陳明亮張穎華△
(1上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心微檢科 上海 201101;2復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院閔行分院 上海 201101;3上海市疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室 上海 200336)
菌落是單個(gè)菌體或孢子在一定的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖后形成的肉眼可見(jiàn)的微生物聚集體,菌落形態(tài)(大小、形狀、邊緣、顏色等)是辨認(rèn)和鑒定菌種的重要標(biāo)志。研究表明菌落特征與細(xì)菌表型和分子特征相關(guān)[1-2],基因水平的變化會(huì)導(dǎo)致菌落形態(tài)的改變[2-4],同一種屬的病原菌基因型不同,菌落形態(tài)往往也不同,區(qū)別菌落形態(tài)有助于快速鑒別細(xì)菌種屬,甚至輔助鑒別基因型。
化膿性鏈球菌屬A群β溶血鏈球菌,能引起猩紅熱、丹毒、新生兒敗血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。菌落形態(tài)是實(shí)驗(yàn)室初步判斷化膿性鏈球菌的重要依據(jù),化膿性鏈球菌在37℃培養(yǎng)18~24 h后,在血瓊脂平板上一般形成直徑約0.5 mm、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑或略粗糙、半透明或透明、β溶血的灰白色菌落[5]。表型由基因型決定,研究表明一些細(xì)菌基因的變化會(huì)導(dǎo)致同一種屬細(xì)菌的菌落形態(tài)變化[6-7]。目前微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌落的觀察多停留在傳統(tǒng)的認(rèn)知階段,未能更進(jìn)一步區(qū)分菌落形態(tài)的細(xì)微差異,我們?cè)趯?duì)化膿性鏈球菌分離培養(yǎng)鑒定的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同emm基因型分離株的菌落形態(tài)存在明顯差異,各亞菌落特點(diǎn)具有emm基因型特異性,總結(jié)如下。
資料和方法
菌株來(lái)源來(lái)源于上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室2019年1—12月自上海市閔行區(qū)猩紅熱監(jiān)測(cè)點(diǎn)兒童咽拭子標(biāo)本中分離培養(yǎng)的化膿性鏈球菌菌株。
菌落形態(tài)觀察菌株劃線接種于含5%無(wú)菌脫纖維羊血的瓊脂平板(上??片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司),37℃培養(yǎng)18~24 h,觀察并記錄菌落形態(tài)(形狀,大小,溶血等)。
生化確認(rèn)實(shí)驗(yàn)用化膿性鏈球菌的純培養(yǎng)物配置0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?,加入Vietek GP生化鑒定卡(生物梅里埃)進(jìn)行生化鑒定,ID%為99%鑒定為化膿性鏈球菌。
emm基因測(cè)序及分型emm基因擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)按照美國(guó)CDC網(wǎng)站化膿性鏈球菌測(cè)序方案進(jìn)行(https://www.cdc.gov/streplab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html)。以DNA為 模板,用通用引物PCR擴(kuò)增,上游引物:5′-TATT(C/G)GCTTAGAAAATTAA-3′,下游引物:5′-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3′。反應(yīng)體系為qPCR Mix 15 μL,Mg2+(25 mmol/L)上 下 游 引 物 各0.5 μL,DNA模板2 μL,補(bǔ)充ddH2O至30 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃1 min;94℃15 s×15;47℃30 s×15;72℃延伸1 min 15 s×15;94℃15 s×15;47℃30 s×15;72℃延伸1 min 15 s,每個(gè)循環(huán)遞增10 s×15;72℃延伸7 min;4℃保持。委托上海生物人技術(shù)有限公司完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測(cè)序。測(cè)序序列提交至數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)(https://www2a.cdc.gov/ncidod/biotech/strepblast.asp),序列同源性99%判為同一emm基因型。
結(jié)果
菌落形態(tài)179株化膿性鏈球菌在血平板上菌落大小、表面特征和溶血情況存在肉眼可見(jiàn)的差別,據(jù)此分為A、B、C、D 4種菌落形態(tài)(圖1)。A:灰白色,約0.5 mm,表面光滑或粗糙,β溶血;B:灰白色,約1 mm,比A菌落大,表面光滑,β溶血;C:3~4 mm,為所有菌落里最大的,黏液型(這是明顯不同于其他3種菌落的特點(diǎn)),β溶血;D:約0.5 mm,表面光滑或粗糙,溶血現(xiàn)象不同于其他3種菌落,介于α溶血和β溶血之間。
菌落形態(tài)與emm基因型的關(guān)系不同emm基因型的菌落特征明顯不同,同一基因型亞型的菌落特征相同。4種基因型的菌株有與之對(duì)應(yīng)的4種不同的菌落形態(tài)(圖1),分別稱之為emm12,emm1,emm3和emm4型菌落(表1)。
表1 179株四種emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)Tab 1 The colony characteristics of four emm genotypes in 179 S.pyogenes
討論表型由基因型決定,表型差異源于基因水平的差異,菌落形態(tài)的不同也有其分子生物學(xué)基礎(chǔ)。化膿性鏈球菌emm基因編碼膜表面M蛋白,不同emm基因5’端的高變區(qū)堿基組成不同,根據(jù)這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)把化膿性鏈球菌分成不同的emm基因型,也造成了菌落形態(tài)的不同。
化膿性鏈球菌流行emm基因型存在國(guó)家/地區(qū)差異[8-12]。本研究中化膿性鏈球菌emm基因型和國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者的研究結(jié)果相符[13-16],主要為emm12型和emm1型(80%~97%),因此就我國(guó)大部分地區(qū)而言,化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)也以這兩種常見(jiàn)。這兩個(gè)基因型的菌落形態(tài)的明顯區(qū)別在于菌落大小,emm1型(包含3種亞型)菌落較大,約為emm12型(包含9種亞型)菌落的2倍大小,雖然兩種菌落只有0.5 mm的差異,但在血平板上肉眼非常容易觀察出差別,emm1型菌落溶血環(huán)比emm12型菌落大,因此可以憑借菌落大小區(qū)別這兩種常見(jiàn)的emm基因型菌株。除此之外,emm1型均為光滑型,而emm12型有光滑型和粗糙型兩種。
與emm12和emm1不 同,emm3和emm4型 在 我國(guó)少見(jiàn)報(bào)道。和其他emm基因型菌落不同,emm3型菌落屬于黏液型菌落,半透明水滴狀,且菌落是所有化膿性鏈球菌中最大的,約是其他的3倍以上,容易辨別,與Tamayo等[17]對(duì)130株emm3型黏液型菌落的描述相符。黏液型化膿性鏈球菌的這一特征具有時(shí)效性,Crater等[18]研究表明其在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期菌落特征最明顯,到生長(zhǎng)平臺(tái)期這一特征容易消失。我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)這種菌落在培養(yǎng)16~18 h黏液型最明顯,超過(guò)24 h則不明顯。因此我們?cè)诨撔枣溓蚓蛛x培養(yǎng)18 h時(shí)觀察一次。emm3型菌落屬于黏液型,但并不是所有黏液型都是emm3型,個(gè)別黏液型化膿性鏈球菌屬于emm6型[19]。emm3型是歐洲某些國(guó)家比較常見(jiàn)的基因型[10],我國(guó)少見(jiàn)報(bào)道,也有可能是因?yàn)樵摼湫螒B(tài)比較特殊,不符合典型的化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)特征,在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中易被忽略。
emm4型菌落不同于其他化膿性鏈球菌的特征是溶血環(huán),介于α溶血和β溶血之間。emm4型菌落的溶血特征可能是由于emm4型菌株編碼溶血素的基因發(fā)生改變所致。本研究只分離到2株emm4型化膿性鏈球菌,國(guó)內(nèi)也鮮有報(bào)道emm4型分離株,部分原因可能是其非典型的菌落特點(diǎn)導(dǎo)致漏檢。韓國(guó)學(xué)者曾報(bào)道2017年韓國(guó)emm4型化膿性鏈球菌突然增多[20],在化膿性鏈球菌的鑒定過(guò)程中應(yīng)注意觀察具有該特征的菌落,防止emm4型菌落漏檢。
菌落形態(tài)是細(xì)菌鑒定過(guò)程中最早觀察到的特征,根據(jù)特有的菌落特征可以初步鑒別種屬。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和認(rèn)知水平的提高,可以進(jìn)一步細(xì)分同一種屬細(xì)菌不同基因型的菌落特點(diǎn)。本研究中檢測(cè)出4種emm基因型,菌落特點(diǎn)各有不同。由于我國(guó)目前常見(jiàn)的化膿性鏈球菌基因型為emm12和emm1型[13-14],因此我們?cè)诔醪借b別化膿性鏈球菌時(shí),可根據(jù)兩種基因型不同的菌落特點(diǎn)早期辨別emm12和emm1型。
綜上所述,化膿性鏈球菌菌落有明顯的emm基因型特異性,不同emm基因型菌落形態(tài)不同,同一基因型的各亞型菌落特征相同,可根據(jù)菌落形態(tài)的基因型特異性輔助早期辨別化膿性鏈球菌的emm基因型。
作者貢獻(xiàn)聲明歐陽(yáng)霖emm基因測(cè)序,論文撰寫。王小光,宋馳萍,張穎華菌株分離培養(yǎng)。陳明亮,張穎華研究設(shè)計(jì),論文撰寫。
利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。