納豆激酶高產(chǎn)菌株的選育及其酶學(xué)活性研究

陳俊煌

（福建匯盛生物科技有限公司，福建漳州 363099）

納豆激酶是一種含有275 個氨基酸、分子量為27 728 Da 的蛋白酶，具有溶血、抗血小板凝集、溶栓等多種活性特點(diǎn)，有助于預(yù)防高血壓及動脈硬化[1]。納豆激酶除了在預(yù)防、治療心血管疾病方面有重要作用，相較于其他類別藥物，具備更多的優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)酵生產(chǎn)成本低、食用安全、無過敏源性、有靜脈注射或口服供選擇等，在腸道中保持較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，納豆激酶被認(rèn)為是21 世紀(jì)口服溶血栓最具潛力的生物藥物[2-3]。但在現(xiàn)有報(bào)道中納豆激酶液體發(fā)酵酶活相對較低且酶活不穩(wěn)定，制約了工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），是一類有益于人體生命健康的安全菌株，是一種在食品發(fā)酵、酶制劑及藥品原料生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的優(yōu)良菌株[4-5]。周雪琴等[6]從鮮納豆中分離篩選出一株枯草芽孢桿菌，優(yōu)化發(fā)酵條件后生產(chǎn)出的納豆激酶酶活可達(dá)393.09 U/mL。陳曉飛等[2]以保藏的固體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶（NK）高活性菌株作為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外-亞硝基胍-60Co 復(fù)合誘變后，獲得發(fā)酵產(chǎn)NK 高活性的菌株，活性最高為2 184.32 U/mL，是誘變前出發(fā)菌株的1.98 倍。

本文從豆制品廢液沉淀池獲取泥沙樣，再經(jīng)搖瓶液體發(fā)酵，纖維蛋白-瓊脂糖平皿點(diǎn)樣篩選，最終將溶解圈大、酶活性高的菌種分離出來，并從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)以及酶學(xué)性質(zhì)等方面對菌株進(jìn)行鑒別和研究，旨在篩選出一株酶活高、性能穩(wěn)定的納豆激酶菌株，為降血栓藥物、保健食品開發(fā)提供優(yōu)良菌株資源和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

采集自豆制品廢液沉淀池的淤泥樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）平皿培養(yǎng)基為LB 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2%瓊脂；（2）種子培養(yǎng)基為LB 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；（3）發(fā)酵培養(yǎng)基成分為2%可溶性淀粉+1%胰蛋白胨+0.5%酵母粉+0.1% KH2PO3+0.2% K2HPO3·3H2O+0.02% CaCl2。

1.1.3 儀器與試劑

PH50-3A43L-A 生物顯微鏡，鳳凰光學(xué)股份有限公司；XD-202 倒置顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；TGL-16 醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PAX-150B 生化培養(yǎng)箱，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化

樣品采用稀釋涂布法，37 ℃培養(yǎng)1 ～2 d。選取長勢良好、形態(tài)單一、類似芽孢菌的單菌落，連續(xù)純化3 次即可分離出純培養(yǎng)單菌落。

1.2.2 菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，觀察菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色及其芽孢染色[7-8]。

（2）分子生物學(xué)鑒定。使用DNA 提取試劑盒提取菌株DB-07 DNA，然后進(jìn)行PCR 反應(yīng)及跑膠，得到一條清晰、明亮的條帶，送廈門鉑瑞生物公司測序。BLAST 序列比對，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.3 纖維蛋白-瓊脂糖測定平皿的制備

取已滅菌的1.5%瓊脂糖溶液10 mL 至燒杯中，50 ℃水浴，另外吸取10 mL 纖維蛋白原溶液（1.5 mg/mL）、760 μL 凝血酶溶液（1 bp/mL）分別在50 ℃水浴保溫20 min。將上述藥品混合均勻，無菌倒板，靜置30 min 后置4 ℃冰箱保存。

1.2.4 粗酶液的制備

菌株接種發(fā)酵，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h。離心收集上清，即得粗酶液。

1.2.5 酶活測定

1.2.5.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用0.9%氯化鈉溶液對1000 IU/mL 尿激酶母液進(jìn)行梯度稀釋配制，得20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL 樣品溶液。分別吸取5 μL 各濃度的尿激酶溶液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿2mm 孔中點(diǎn)樣，然后正放于生化培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)16 h。X軸表示溶解圈面積，Y 軸表示尿激酶濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 納豆激酶酶活的測定

納豆激酶的酶活以尿激酶活力（IU/mL）來定義。發(fā)酵液12 000 r/min 離心10 min，收集上清，生理鹽水稀釋50 倍，取5 μL 生理鹽水稀釋后的酶液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿上點(diǎn)樣，正放置于生化培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)16 h，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測酶活。

1.2.6 納豆激酶酶學(xué)活性研究

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度

在8 支5 mL 離心管中各加入500 μL 稀釋至一定酶活的納豆激酶溶液，在pH 自然條件下水浴30 min，研究20 ～55 ℃條件對納豆激酶活性的影響，水浴結(jié)束立即放置冰浴10 min，平皿點(diǎn)樣測定酶活，以最高酶活為100%進(jìn)行組間比較。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH

配制pH 分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的酶液，在30 ℃條件下水浴30 min，水浴結(jié)束立即放置冰浴10 min，之后在平皿點(diǎn)樣，以最高酶活為100%進(jìn)行組間比較。

1.2.6.3 最適水浴時間

在最適反應(yīng)溫度和pH 條件下，水浴時間分別設(shè)置 為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，水浴結(jié)束后冰浴10 min，平皿點(diǎn)樣，以最高酶活為100%進(jìn)行組間比較。

1.2.6.4 不同金屬離子對納豆激酶酶學(xué)活性的影響

根據(jù)文獻(xiàn)[1]設(shè)定金屬離子濃度為10 mmol/L，在最適的溫度、pH 及水浴時間條件下，研究Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+對納豆激酶酶活的影響。以不添加金屬離子時的最高酶活為100%，進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

經(jīng)過分離純化獲得的菌株，接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液離心收集上清液，在纖維蛋白-瓊脂糖平皿中點(diǎn)樣測定納豆激酶酶活。比較菌株之間透明圈直徑大小，選擇透明圈直徑大的菌株繼續(xù)復(fù)篩，選育到一株芽孢桿菌，搖瓶酶活水平為3 097.63 IU/mL，編號DB-07。菌株DB-07 納豆激酶溶解圈見圖1（箭頭所指部位）。

圖1 納豆激酶平皿溶解圈

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

如圖2 所示，菌株DB-07 在LB 平皿培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，菌落形狀不規(guī)則、白色、表面粗糙、無光澤、不透明、質(zhì)地蠟狀、扁平、邊緣波狀；該菌為G+，菌體短桿狀；芽孢染色呈綠色、菌體呈紅色，芽孢中生、短橢圓形。根據(jù)以上結(jié)果，初步判定DB-07 菌株歸屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株DB-07 形態(tài)特征

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株DB-07 的16S rRNA 序列長度為1 459 bp，序列比對結(jié)果與B.subtilis有99.79%相似度，序列覆蓋度為98%，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果顯示菌株DB-07與B.subtilis在同一分支上（圖3）。因此，將菌株DB-07 鑒定為B.subtilis。

圖3 DB-07 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 納豆激酶活力測定

2.3.1 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，制備納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4 納豆激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 納豆激酶酶活的測定

測量溶解圈直徑為4.17 mm，得到溶解圈面積為54.60 mm2，代入公式，計(jì)算出納豆激酶的酶活為3 097.63 IU/mL。

2.4 菌株DB-07 的納豆激酶酶學(xué)活性研究

2.4.1 菌株DB-07 的納豆激酶最適溫度

如圖5 所示，隨著溫度的上升，納豆激酶酶活呈現(xiàn)先升后降的趨勢，溫度30 ℃時酶活最高。隨著溫度的繼續(xù)上升，酶活逐漸下降，說明高溫環(huán)境不利于納豆激酶酶活性質(zhì)穩(wěn)定。因此，菌株DB-07 的納豆激酶的最適反應(yīng)溫度確定為30 ℃。

圖5 溫度對納豆激酶酶學(xué)活性的影響

2.4.2 菌株DB-07 的納豆激酶最適pH

如圖6 所示，隨著pH 值上升，酶活先升后降。當(dāng)pH 值為6.5 時，納豆激酶酶活達(dá)到最大值；pH 低于5.0 時，酶活快速降低，說明低pH 值不利于酶學(xué)活性的維持。因此，菌株DB-07 的納豆激酶最適反應(yīng)pH 確定為6.5。

圖6 pH 對納豆激酶酶學(xué)活性的影響

2.4.3 菌株DB-07 的納豆激酶最適水浴時間

如圖7 所示，隨著水浴保溫時間的增加，酶活先升后降，然后逐漸維持一定范圍的酶學(xué)活性。水浴60 min 時酶活最高；從60 min 增加到90 min，相對酶活下降近30%，90 min 之后酶活逐漸穩(wěn)定。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在水浴保溫時間相對較短情況下，對納豆激酶能夠起到激發(fā)酶學(xué)活性的作用，隨著時間延長，酶活逐漸下降。因此，菌株DB-07 的納豆激酶最適反應(yīng)水浴時間確定為60 min。

圖7 水浴時間對納豆激酶酶學(xué)活性的影響

2.4.4 不同金屬離子對菌株DB-07 納豆激酶酶學(xué)活性的影響

如表1 所示，Ca2+和Cu2+能夠提高菌株DB-07納豆激酶的酶學(xué)活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+則會抑制納豆激酶的酶學(xué)活性。因此，在應(yīng)用中應(yīng)避免體系中存在游離的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+，可適當(dāng)加入Ca2+和Cu2+。

表1 金屬離子對納豆激酶酶學(xué)活性的影響

3 結(jié)論

本研究從豆制品廢液沉淀池的淤泥樣品中分離篩選到一株產(chǎn)納豆激酶菌株DB-07，該菌株發(fā)酵上清液在纖維蛋白-瓊脂糖平皿培養(yǎng)后具有明顯的溶解透明圈。經(jīng)菌落形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。

枯草芽孢桿菌DB-07 在搖瓶中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，納豆激酶酶活力達(dá)到3 097.63 IU/mL。納豆激酶在溫度30 ℃、pH 值6.5、水浴時間60 min 條件下，能夠保持較高的活性，Ca2+和Cu2+能夠提高納豆激酶的酶學(xué)活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+則會抑制納豆激酶的酶學(xué)活性。本研究獲得的菌株DB-07 是一株能夠高產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌，可為降血栓藥物、保健食品的開發(fā)提供優(yōu)良的菌株資源。