EasyDisc法與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法檢測水中菌落總數(shù)的比較

孫 杰

(上海城市水資源開發(fā)利用國家工程中心有限公司，上海 200082)

水中菌落總數(shù)作為常規(guī)微生物檢測項(xiàng)目之一，可以及時(shí)反映水體受微生物污染的程度。目前，國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)大多以傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法作為水中菌落總數(shù)的主要檢測方法。但隨著細(xì)菌種類的不斷更新，傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法并不適用于檢測厭氧菌、非嗜中溫及對(duì)繁殖所需營養(yǎng)有特殊要求的細(xì)菌[1]；在試驗(yàn)過程中因操作步驟復(fù)雜易引入污染；試驗(yàn)結(jié)果判定困難易造成較大的人為誤差，對(duì)試驗(yàn)技術(shù)人員和檢測環(huán)境要求極高，部分實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到。因此，不能滿足實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急樣品及大批量樣品的檢測需求。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比，EasyDisc法具有操作簡便、外來污染及人為誤差小、無菌環(huán)境要求低等優(yōu)點(diǎn)，且大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)EasyDisc法與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法在檢測水中菌落總數(shù)結(jié)果上無明顯差異。因此，該方法可以廣泛應(yīng)用于水中菌落總數(shù)的檢測。相較于2002年美國環(huán)保署(EPA)批準(zhǔn)使用酶底物法(SimPlate法)檢測飲用水以及地表水中的菌落總數(shù)，傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法已30余年未更新。2013年廣東省中山市供水有限公司最早將SimPlate法寫入廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)(DB44/T 1163—2013)[2]。2019年張穎[3]等采用定量盤法(HPC for quanti-tray)檢測水中菌落總數(shù)，該方法在原理上與SimPlate法類似，與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法的檢測結(jié)果相比也沒有顯著差異，但其檢測時(shí)需要100 mL樣品，且要使用封口機(jī)和紫外燈等輔助設(shè)備，操作相對(duì)繁瑣。

EasyDisc法于2021年研發(fā)成功，是一種新型的水中菌落總數(shù)檢測方法，目前在國內(nèi)外還處于試用階段。其基本原理是在EasyDisc平皿底部添加有顯色底物的脫水PCA培養(yǎng)基，微生物在該培養(yǎng)基上生長代謝時(shí)所產(chǎn)生的酶會(huì)促進(jìn)相應(yīng)顯色底物反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，便于計(jì)數(shù)，降低了結(jié)果判定的人為誤差。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比，該方法無需配制培養(yǎng)基，檢測過程簡便，每個(gè)樣品前處理耗時(shí)不足1 min，顯著降低了外來污染和人為誤差，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性，適用于應(yīng)急樣品及大批量樣品的檢測需求。

本文采用傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法和新型檢測技術(shù)EasyDisc法兩種檢測方法對(duì)NSI定量質(zhì)控樣品和上海地區(qū)實(shí)際水樣進(jìn)行檢測，并比較分析兩種方法的檢測結(jié)果[4-5]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)試劑及設(shè)備

EasyDisc平皿、HPC定量質(zhì)控樣品(NSI 200317)、無菌PBS緩沖液、無菌取樣瓶等耗材由IDEXX公司提供。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；試驗(yàn)使用國產(chǎn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱，溫控精度為±0.5 ℃，經(jīng)計(jì)量部門校準(zhǔn)合格。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 水樣采集

管網(wǎng)水水樣取自上海某地區(qū)的管網(wǎng)監(jiān)測點(diǎn)，二次供水水樣為上海居民的龍頭水。參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006)，選取一次性無菌采樣瓶(含硫代硫酸鈉)作為采樣容器，并在4 h內(nèi)對(duì)采集水樣進(jìn)行檢測[6-8]。

1.2.2 質(zhì)控樣品制備

將NSI定量質(zhì)控樣品從-10 ℃冰箱取出，在室溫下平衡10～15 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL無菌PBS緩沖液中，水平振蕩搖勻，待NSI定量質(zhì)控樣品完全溶解后，30 min內(nèi)進(jìn)行檢測。

1.2.3 質(zhì)控稀釋樣品制備

將質(zhì)控樣品充分混勻后，取10 mL質(zhì)控樣品轉(zhuǎn)移至100 mL無菌取樣瓶中，用無菌水稀釋至刻度線，配制成稀釋10倍的質(zhì)控稀釋樣品溶液。

1.2.4 平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù)方法

平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù)參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)[8]。

1.2.5 EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)方法

量取1 mL待測樣品加入EasyDisc平皿，充分搖勻，使樣品均勻分布于整個(gè)平皿，在室溫下靜置20 min后正置放入(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48±3) h后統(tǒng)計(jì)分析菌落總數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 質(zhì)控樣品檢測結(jié)果分析

分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法平行檢測同一定量質(zhì)控樣品15次，其檢測結(jié)果表明兩種方法的檢測結(jié)果均在質(zhì)控樣品結(jié)果可接受范圍內(nèi)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)兩種方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，計(jì)算檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差，如表1、圖1所示。EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差更小，更接近于真值，準(zhǔn)確度更高；計(jì)算兩種方法相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差可得SD(平皿計(jì)數(shù)法)=5.84%，SD(EasyDisc法)=3.66%。綜上，EasyDisc法檢測結(jié)果與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，表明其與真值的相對(duì)誤差離散程度較小，性能更加穩(wěn)定。

2.2 質(zhì)控稀釋樣品檢測結(jié)果分析

為驗(yàn)證兩種方法在低濃度樣品檢測中的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法平行檢測同一稀釋10倍的定量質(zhì)控樣品15次，其檢測結(jié)果如表2、圖2所示。結(jié)果表明：平皿計(jì)數(shù)法合格率為80%，EasyDisc法合格率為100%；EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差更小，更接近于真值，準(zhǔn)確度更高；兩種方法檢測結(jié)果與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為SD(平皿計(jì)數(shù)法)=14.31%，SD(EasyDisc法)=9.28%。綜上，EasyDisc法檢測低濃度樣品的準(zhǔn)確性更高，性能更穩(wěn)定。

表1 兩種方法檢測質(zhì)控樣品的結(jié)果Tab.1 Detection Results of QC Samples by Both Methods

圖1 兩種方法檢測結(jié)果真值的相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.1 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Methods

2.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果分析

選取上海地區(qū)30組管網(wǎng)水樣品及50組二次供水樣品，分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法檢測選取的80組實(shí)際樣品，其檢測結(jié)果如表3所示。為探究兩種方法在實(shí)際樣品檢測中的相關(guān)性，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制折線圖，如圖3所示。結(jié)果表明：兩種方法的檢測結(jié)果趨勢基本相同，具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

表2 兩種方法檢測質(zhì)控稀釋樣品的結(jié)果Tab.2 Detection Results of QC Dilution Samples by Both Methods

圖2 兩種方法檢測結(jié)果真值的相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.2 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Method

為進(jìn)一步探究兩種方法在檢測實(shí)際樣品時(shí)是否存在差異性，以及使檢測結(jié)果呈正態(tài)分布，將運(yùn)用SPSS Statistics軟件對(duì)平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測結(jié)果，作對(duì)數(shù)處理后進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表4所示。平皿計(jì)數(shù)法與EasyDisc法的泊松相關(guān)系數(shù)為0.894，屬極強(qiáng)相關(guān)性；t檢驗(yàn)P=0.325(>0.05)，說明兩種檢測方法的檢測結(jié)果無顯著差異，具有高度一致性?？烧J(rèn)為平皿計(jì)數(shù)法、EasyDisc法均可有效檢測水中菌落總數(shù)。

表3 兩種方法檢測實(shí)際樣品的結(jié)果Tab.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

圖3 兩種方法檢測實(shí)際樣品的結(jié)果Fig.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

3 討論

3.1 質(zhì)控樣品檢測

平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法對(duì)HPC定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果的真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為6.27%和3.02%。EasyDisc法檢測HPC定量質(zhì)控結(jié)果的真值相對(duì)誤差相較于平皿計(jì)數(shù)法的真值相對(duì)誤差更小，表明EasyDisc法的檢測結(jié)果更接近真值，準(zhǔn)確度更高。與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算結(jié)果表明，EasyDisc法與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，其檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差離散程度較小，性能更加穩(wěn)定。

表4 兩種方法對(duì)實(shí)際樣品檢測結(jié)果的t檢驗(yàn)Tab.4 T-Test of Results of Practical Sample by Both Methods

3.2 質(zhì)控稀釋樣品檢測

平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法對(duì)稀釋10倍的低濃度HPC定量指控樣品檢測結(jié)果的真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為11.98%和8.86%；平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測合格率分別為80%和100%。EasyDisc法檢測HPC稀釋10倍的低濃度定量質(zhì)控結(jié)果的真值相對(duì)誤差相較于平皿計(jì)數(shù)法的真值相對(duì)誤差更小、合格率更高，表明在低濃度的情況下EasyDisc法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度仍優(yōu)于平皿計(jì)數(shù)法。

3.3 實(shí)際樣品檢測

對(duì)管網(wǎng)水和二次供水等實(shí)際樣品，平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測結(jié)果泊松相關(guān)系數(shù)為0.893，屬極強(qiáng)相關(guān)性，t檢驗(yàn)P為0.325(>0.05)，表明兩種方法檢測數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著差異，均可檢測水中菌落總數(shù)。

3.4 EasyDisc法優(yōu)勢

EasyDisc法于2021年研發(fā)成功，是一種新型的水中菌落總數(shù)檢測方法，對(duì)傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行了顯著革新，相較于傳統(tǒng)的90 mm平皿，其47 mm的平皿既能減少廢棄物處理的成本又能增加實(shí)驗(yàn)室檢測量。其PCA培養(yǎng)基已脫水固定于平皿底部，省去傳統(tǒng)方法中配置培養(yǎng)基的過程，節(jié)省大量時(shí)間的同時(shí)減少了配置培養(yǎng)基帶來的污染。EasyDisc法產(chǎn)品的1年保質(zhì)期，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室管理流程的同時(shí)，也降低了相應(yīng)耗材的浪費(fèi)。在PCA培養(yǎng)基中添加顯色底物，與微生物生長代謝所產(chǎn)生的酶相互反應(yīng)形成藍(lán)色菌落，配合白色底部及網(wǎng)格線更加便于觀察，降低人為計(jì)數(shù)誤差。同時(shí)，通過大量數(shù)據(jù)分析水中菌落總數(shù)檢測干擾菌種，添加雜菌生長抑制劑，使PCA培養(yǎng)基對(duì)檢測環(huán)境要求大幅降低。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比，EasyDisc法測定質(zhì)控樣品及質(zhì)控稀釋樣品時(shí)，準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法；測定實(shí)際樣品時(shí)，其檢測結(jié)果與平皿計(jì)數(shù)法無顯著差異，但因EasyDisc法無需制備培養(yǎng)基，操作更加簡便，對(duì)無菌環(huán)境及檢測人員技術(shù)無明顯要求等優(yōu)勢，更適用于大批量樣品及應(yīng)急突發(fā)樣品的檢測。

4 結(jié)論

(1)平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù)，配制培養(yǎng)基操作繁瑣，要求嚴(yán)格；使用高溫滅菌設(shè)備需相應(yīng)資格證；試驗(yàn)結(jié)果讀數(shù)人為誤差大。因此，平皿計(jì)數(shù)法不能滿足實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急樣品及大批量樣品檢測的需求。EasyDisc法無需配制培養(yǎng)基，每個(gè)樣品前處理耗時(shí)不足1 min，檢測過程簡便，顯著降低了外來污染和人為誤差，且在實(shí)際樣品檢測中可以發(fā)現(xiàn)其檢測結(jié)果與平皿計(jì)數(shù)法無明顯差異。

(2)采用EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)，具有操作更加簡便、人為誤差少、計(jì)數(shù)便捷、對(duì)試驗(yàn)技術(shù)人員及試驗(yàn)環(huán)境要求低等優(yōu)勢，其質(zhì)控樣品與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.66%，低于平皿計(jì)數(shù)法的5.84%，質(zhì)控稀釋樣品的合格率為100%，高于平皿計(jì)數(shù)法的80%，表明其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法，可以滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)水中菌落總數(shù)的檢測要求。同時(shí)，該方法在應(yīng)急突發(fā)樣品現(xiàn)場檢測方面也有很大的應(yīng)用前景。

(3)鑒于EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境要求及采購設(shè)備成本低，更適用于中小型實(shí)驗(yàn)室在大批量樣品及應(yīng)急突發(fā)樣品的檢測，在未來必將成為一種發(fā)展趨勢。