新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究

吳桂梅 汪瑤 趙小峰 金磊 賀玲

（徐州醫(yī)科大學(xué)，國(guó)家基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，江蘇徐州 221004）

電泳是生物化學(xué)研究中常用的一種實(shí)驗(yàn)手段，其中醋酸纖維素薄膜電泳是常用的一種電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物的電泳技術(shù)，該電泳技術(shù)具有電滲小、分離速度快、樣品用量小、分辨率高、分離清晰等優(yōu)點(diǎn)。此外，該電泳的操作方法比瓊脂糖電泳、淀粉膠電泳和聚丙烯酸胺凝膠電泳簡(jiǎn)便，而且染色后的薄膜便于保存和定量分析[1-3]。因此，醋酸纖維素薄膜電泳成為生物化學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一，該電泳可用于血清蛋白電泳、脂蛋白電泳、同功酶電泳、甲種胎兒球蛋白電泳、血紅蛋白電泳以及免疫電泳等[1]。

醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)最常用的緩沖液是巴比妥緩沖液，巴比妥緩沖液緩沖能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好，以該緩沖液為電泳介質(zhì)的樣品分離效果好，但該緩沖液中用到的巴比妥和巴比妥鈉作為麻醉鎮(zhèn)靜藥物，安全性存在隱患，在試劑采購(gòu)方面也存在限制，因此研究適用于醋酸纖維素薄膜電泳的新型緩沖液具有重要的意義。本研究以人血清為樣品進(jìn)行醋酸纖維素電泳來(lái)檢驗(yàn)不同電泳緩沖液的效果。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

醋酸纖維薄膜（2cm×8cm）；人血清；巴比妥緩沖液（pH8.6，離子強(qiáng)度0.06）[1]：巴比妥1.66 g，巴比妥鈉12.76g，加水溶解定容至1L；硼酸緩沖液（pH8.6，離子強(qiáng)度0.075）[4]：硼酸5.60g，四硼酸鈉5.61g，氯化鈉1.32g，加水溶解定容至1L；Tris-硼酸緩沖液：Tris 7.5g,硼酸5.60g，四硼酸鈉5.61g，氯化鈉1.32g，加水溶解定容至1L；染色液[1]：氨基黑10В 0.5g，溶于甲醇50ml，再加冰醋酸10ml，蒸餾水40ml，混勻。漂洗液[1]：乙醇45ml，冰醋酸加ml，蒸餾水50ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 準(zhǔn)備

電泳槽內(nèi)放適量的緩沖液，在電泳槽內(nèi)側(cè)的支持板上用紗布搭橋，分別使其一端搭到支持板上，另一端浸入緩沖液中。

取緩沖液浸透后的醋酸纖維素薄膜（2cm×8 cm），用濾紙輕輕吸去膜上多余的緩沖液，辨別無(wú)光澤面，在無(wú)光澤面距一端約2.0cm處，用鉛筆畫(huà)一條線（與此端平行），作為點(diǎn)樣線。

1.2.2 點(diǎn)樣

把膜的無(wú)光澤面向上，將樣品均勻地涂于蓋玻片的一端，點(diǎn)樣到膜的點(diǎn)樣線上（點(diǎn)樣時(shí)可將蓋玻片45度角傾斜，這樣點(diǎn)樣線比較細(xì)，樣品的分離效果更好），使樣品浸入膜內(nèi)。

1.2.3 電泳

用鑷子夾住薄膜的一端，把膜放進(jìn)電泳槽，膜的點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端置于陰極側(cè)但不能接觸紗布，把膜的兩端緊貼到內(nèi)側(cè)支持板上搭橋的紗布上，把膜擺平拉直，蓋好電泳槽蓋。接通電泳儀電源，穩(wěn)壓110V，通電45min。

1.2.4 染色

電泳結(jié)束后關(guān)閉電源立即取出薄膜，放入染色液中浸染5min，然后取出薄膜控凈多余染色液，放入漂洗液中依次漂洗3次，至無(wú)蛋白處無(wú)色為止，取出薄膜用濾紙吸干。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 以巴比妥緩沖液作為電泳介質(zhì)的醋酸纖維素薄膜電泳分離人血清蛋白結(jié)果

以常用的巴比妥緩沖液作為電泳介質(zhì)得到的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜見(jiàn)圖1，能夠清晰分離出5條區(qū)帶。因所用緩沖液的pH值大于血清各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（見(jiàn)表1），各種蛋白質(zhì)皆帶負(fù)電，通直流電時(shí)，皆向正極方向泳動(dòng)。血清各蛋白質(zhì)的分子大小及帶電量不同（見(jiàn)表1），因此各蛋白的泳動(dòng)速度不同，從而被分離，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白，見(jiàn)圖1標(biāo)記。

圖1 以巴比妥緩沖液為電泳介質(zhì)的血清蛋白圖譜

表1 血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、正常血清中各蛋白的含量[1]

2.2 以硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)的醋酸纖維素薄膜電泳分離人血清蛋白結(jié)果

以硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)得到的電泳圖譜見(jiàn)圖2，圖中可見(jiàn)分離出4條區(qū)帶，對(duì)比巴比妥緩沖液得到的電泳圖譜推測(cè)其為清蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。

圖2 以硼酸緩沖液為電泳介質(zhì)的血清蛋白圖譜

2.3 以Tris-硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)的醋酸纖維素薄膜電泳分離人血清蛋白結(jié)果

以硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)進(jìn)行的醋酸纖維素薄膜電泳分離人血清蛋白并未取得預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果，在本文的硼酸緩沖液配方的基礎(chǔ)上我們加入了Tris，并且經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)確定了合適的用量以及電泳條件。以我們配制的Tris-硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)得到的電泳圖譜見(jiàn)圖3，分離出5條區(qū)帶，分別為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白，條帶清晰。

圖3 以Tris-硼酸緩沖液為電泳介質(zhì)的血清蛋白圖譜

3.實(shí)驗(yàn)討論

醋酸纖維素薄膜電泳作為一種重要的生化分析技術(shù)，在臨床、科研以及高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)中有著非常重要的作用，但是目前常用的電泳介質(zhì)巴比妥緩沖液作為麻毒類藥品，除了價(jià)格高昂之外，還存在潛在的危險(xiǎn)，并且采購(gòu)受到管控，所以能夠替代巴比妥緩沖液的新型緩沖液的研制刻不容緩。

硼酸緩沖液也具有較好的緩沖能力，其中用到的硼酸、四硼酸鈉和氯化鈉都是成本低、易采購(gòu)的試劑。因此硼酸緩沖液是近年來(lái)研究比較多的在醋酸纖維素薄膜電泳中用來(lái)替代巴比妥緩沖液的一種緩沖液[5-8]。之前的報(bào)道顯示硼酸緩沖液可以取得良好的效果，能夠替代巴比妥緩沖液用于醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白[4,7]，但是我們的結(jié)果顯示以巴比妥緩沖液作為電泳介質(zhì)將人血清分離出5條蛋白區(qū)帶，而以硼酸緩沖液作為電泳介質(zhì)，只是分離出4條蛋白區(qū)帶，這表明硼酸緩沖液并不能取代巴比妥緩沖液成為優(yōu)質(zhì)的醋酸纖維素薄膜電泳的電泳介質(zhì)。Tris易溶于水，對(duì)很多酶呈惰性反應(yīng)，在pH7.5～9.0有較強(qiáng)的緩沖能力，可用于穩(wěn)定反應(yīng)體系的PH值，常用于配制各種緩沖液，我們?cè)谠摼彌_系統(tǒng)中加入Tris配制Tris-硼酸緩沖液，經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，最終確定了該緩沖液Tris的用量（見(jiàn)本文緩沖液配方）從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到經(jīng)過(guò)改良的Tris-硼酸緩沖系統(tǒng)成功的將人血清分離出5條蛋白區(qū)帶，具有與巴比妥緩沖液相似的分離效果。

我們研制的Tris-硼酸緩沖液不僅在醋酸纖維素薄膜電泳中對(duì)樣品有很好的分離效果而且易獲得，因此可以替代巴比妥緩沖液用于醋酸纖維素薄膜電泳。我們的研究成果具有非常重要的意義，現(xiàn)在我們已經(jīng)將其應(yīng)用于學(xué)生的實(shí)驗(yàn)課中，取得了良好的實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。