2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究

于婧文，霍明章，2，李艷花，趙立峰，劉 宏，2*

（1.山西大同大學醫(yī)學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學呼吸病與職業(yè)病研究所，山西 大同 037009）

2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究

于婧文1，霍明章1，2，李艷花1，趙立峰1，劉 宏1，2*

（1.山西大同大學醫(yī)學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學呼吸病與職業(yè)病研究所，山西 大同 037009）

目的在血清蛋白醋酸纖維膜電泳巴比妥緩沖液可以分離出5條區(qū)帶的實驗條件下，研究硼酸－硼酸鹽緩沖液是否能夠達到相同甚至更好的實驗效果，是否可替代巴比妥緩沖液。方法采用DYY－8C型電泳儀進行醋酸纖維膜電泳，選擇不同電壓和電泳時間，觀察巴比妥緩沖液與硼酸－硼酸鹽緩沖液分離兔血清蛋白的效果，并分析2組蛋白質(zhì)相對含量測定值有無差異。結(jié)果在相同的實驗條件下，硼酸鹽緩沖液的分離效果好于巴比妥緩沖液，2組蛋白質(zhì)相對含量無明顯差異。結(jié)論在血清蛋白醋酸纖維膜電泳實驗中，與巴比妥緩沖液相比，硼酸緩沖液的實驗結(jié)果更穩(wěn)定且重復性更好，可以替代巴比妥緩沖液。

巴比妥緩沖液；硼酸鹽緩沖液；醋酸纖維膜電泳

血清蛋白醋酸纖維膜電泳是生物化學與分子生物學的常用實驗技術(shù)之一。巴比妥緩沖液是血清蛋白醋酸纖維膜電泳實驗中最常用的緩沖液，但作為鎮(zhèn)靜類藥物其可得性受到限制，安全性存在隱患。本研究在巴比妥緩沖液能夠清晰分離出5條區(qū)帶的4組實驗條件下，觀察硼酸鹽緩沖液是否也能夠分離出理想的圖譜，并測定這2種緩沖液在不同實驗條件下分離出的蛋白相對含量，判斷其實驗結(jié)果的差異，從而探討在血清蛋白醋酸纖維膜電泳實驗中，硼酸緩沖液是否可以替代巴比妥緩沖液。

1 實驗材料

1.1 標本

新鮮兔血清，取自1只健康家兔，體質(zhì)量2.8 kg，采其動脈血離心得血清。

1.2 儀器

DYY－8C型電泳儀4臺、DYCP－38B型電泳槽8個（北京六一儀器廠），722型分光光度計。

1.3 試劑

醋酸纖維薄膜（臺州市路橋四生化塑料廠）；巴比妥緩沖液（pH 8.6，離子強度0.06）：巴比妥1.66 g，巴比妥鈉12.76 g，加熱溶解，冷卻至室溫后，定容到1 L；硼酸鹽緩沖液（pH 8.6，離子強度0.08）：硼酸5.60 g，硼酸鈉5.610 g，氯化鈉1.316 g，蒸餾水溶解并定容至1 L；麗春紅染液，麗春紅0.5 g，三氯醋酸6 g，蒸餾水溶解并定容至100 mL；漂洗液，V無水乙醇∶V冰醋酸∶V蒸餾水＝45∶5∶50；洗脫液，0.4mol／LNaOH。

2 方法

參照生物化學與分子生物學實驗指導方法[1]進行。將醋酸纖維膜剪成2.5 cm×8 cm的長方形小片，浸泡到上述2種緩沖液中過夜待用。

2.1 點樣

取浸泡好的醋酸纖維膜，夾于濾紙中吸去多余緩沖液，在無光澤面一端1.3 cm處畫點樣線，用載玻片一端均勻蘸取少量血清垂直點樣，使血清均勻滲入薄膜中同時保持醋酸纖維膜的潤濕。

2.2 電泳

每臺電泳儀連接分別裝巴比妥緩沖液和硼酸鹽緩沖液的2個電泳槽，4臺電泳儀共連接8個電泳槽。將點樣后的醋酸纖維膜無光澤面向下，點樣端靠近陰極，兩端緊貼電泳槽上的紗布橋，拉直放好，每個電泳槽放置12條點樣后的醋酸纖維膜，蓋好電泳槽，平衡10 min后分別選擇電壓和電泳時間，打開開關(guān)，通電電泳。

2.3 染色及漂洗

麗春紅染液染色5 min后取出用漂洗液漂洗數(shù)次，直至背景漂凈為止。

2.4 定量

分別取各實驗條件下的電泳效果較好的醋酸纖維薄膜各6條，將蛋白質(zhì)各條色帶和一空白色帶剪下，分別裝入6個試管，用0.4 mol／L NaOH溶液分別洗脫，30min后用722型分光光度計在波長620 nm進行比色，測各組分蛋白的百分含量。

2.5 實驗條件

設(shè)定4種實驗模式觀察硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液分離血清蛋白效果：①調(diào)節(jié)電壓在110 V（10 V/cm橋長）,電泳時間60 min[1]；②先將電壓調(diào)至60 V,電泳5 min后,再調(diào)到95 V,電泳55 min[2]；③電壓130 V,電泳時間45min[3]；④電壓160 V,電泳時間45min[4]。

2.6 統(tǒng)計學處理

用SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。2種緩沖液分離出的血清蛋白含量比較采用配對樣本t檢驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同電壓和時間對電泳結(jié)果的影響

在4組實驗模式下巴比妥緩沖液都可得到清晰的圖譜，硼酸鹽緩沖液同樣能分離出5條蛋白區(qū)帶。蛋白電泳結(jié)果圖如圖1～8。2種緩沖液電泳情況比較見表1。比色測定2種緩沖液下分離出的各蛋白區(qū)帶的相對含量取其平均值，測定結(jié)果見表2。統(tǒng)計學結(jié)果顯示2組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)r＝1，P＝0.88，2組數(shù)據(jù)無明顯差異。

4種實驗模式下觀察硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液分離血清蛋白效果，見圖1～8。2種緩沖液電泳情況比較見表1。

圖1 110V-60min巴比妥緩沖液

圖2 110V-60min硼酸鹽緩沖液

圖3 60V-5m in,95V-55m in巴比妥緩沖液

圖4 60V-5m in,95V-55m in硼酸鹽緩沖液

圖5 130V-45m in巴比妥緩沖液

圖6 130V-45m in硼酸鹽緩沖液

圖7 160V-45m in巴比妥緩沖液

圖8 160V-45m in硼酸鹽緩沖液

3.2 2 種緩沖液洗脫各組分蛋白的結(jié)果

比色測定兩種緩沖液下分離出的各蛋白區(qū)帶的相對含量取其平均值,見表2。

4 結(jié)論

電壓與電泳時間是影響電泳結(jié)果的重要因素之一。在4組實驗模式下，硼酸鹽緩沖液同巴比妥緩沖液一樣都能分離出5條蛋白區(qū)帶。在160 V－45 min條件下，兩組圖譜展開距離短，除清蛋白外，其它蛋白條帶擠壓，區(qū)帶變細不利于區(qū)分。

表1 兩種緩沖液電泳情況的比較

表2 不同實驗條件下各組分蛋白質(zhì)的相對含量

2種緩沖液的離子強度不同，蛋白遷移速度也不同。硼酸鹽緩沖液的離子強度高，可能降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳的速度變慢，故4組實驗模式下硼酸鹽緩沖液的區(qū)帶較集中，最遠區(qū)帶與點樣點的距離較短。實驗表明在不同的實驗條件下硼酸鹽緩沖液能夠得到清晰的圖譜甚至分離效果好于巴比妥緩沖液，而且實驗的重復性和穩(wěn)定性更好。

實驗結(jié)果與靳彩虹測定兔血清蛋白含量結(jié)果[5]基本一致：清蛋白含量＞γ－球蛋白＞α1－球蛋白＞β－球蛋白＞α2－球蛋白。統(tǒng)計學結(jié)果說明，硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液在分離各組分蛋白的含量方面差異沒有顯著性。

綜上所述，在相同實驗條件下，硼酸鹽緩沖液同巴比妥緩沖液一樣能夠分離出清晰的圖譜，甚至效果要好于巴比妥緩沖液。統(tǒng)計分析測定各組分蛋白質(zhì)的相對含量，2種緩沖液差異沒有顯著性。多次重復實驗證明，與巴比妥緩沖液相比，硼酸鹽緩沖液中電泳出的圖譜結(jié)果更穩(wěn)定，重復性更好，而且成本較低，能夠替代巴比妥緩沖液，更適合在生物化學與分子生物學實驗中使用。

[1]李林,張月紅,張宇輝,等.生物化學與分子生物學實驗指導[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2008.

[2]孫莉麗,李榮華.醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白實驗的改進[J].實驗室科學,2010,13（2）：58-59.

[3]陳書明,曹新鵬,胡軍,等.6種血清的醋酸纖維薄膜電泳分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2010,38（6）：18-20.

[4]尹麗,陳秀敏,王永和,等.血清蛋白醋酸纖維膜電泳幾種緩沖液的效果分析[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2010,7（11）：145-146.

[5]靳彩虹,柴連明,武洋.醋酸纖維素薄膜電泳法分離兔血清蛋白質(zhì)[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22（11）：2649-2650.

〔責任編輯 楊德兵〕

The Effect Separating Serum Protein w ith Cellulose Acetate Membrane Electrophoresis in Two Buffer Solution

YU Jing－wen1，HUOMing－zhang1，2，LIYan－h(huán)ua1，ZHAO Li－feng1，LIU Hong1，2＊
（1.Medical School，ShanxiDatong University，Datong Shanxi，037009；
2.Research Institute of Respiratory and Occupational Disease，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Objective Boric acid－borate buffer can achieve the same or even better experimental effect in the experimental conditions that barbiturate buffer can separate out five ribbons in serum protein cellulose acetatemembrane electrophoresis.Methods Using DYY－8C electrophoresis apparatus for cellulose acetate membrane electrophoresis，choosing different voltage and time，the effect separating rabbit serum protein is observed in barbiturate buffer and boric acid－borate buffer.And the relative content of protein components ismeasured.Results Under the same experimental conditions，the effect separating serum protein in borate saline buffer is better than in barbiturate buffer.There is no difference between the two kinds of buffer.Conclusions In serum protein cellulose acetate membrane electrophoresis，the boric acid－borate buffer can replace barbiturate buffer，and many experiments prove that：the experimental results of boric acid－borate buffer ismore stable and repeatability is better than barbiturate buffer.

Boric acid－borate buffer；Barbiturate buffer；Cellulose acetatemembrane electrophoresis

O657.1

A

2012－08－08

于婧文（1984－），女，山西左云人，碩士，助理實驗師，研究方向：生物化學教學與實驗。*劉宏，男，博士；教授，通信作者。

1674－0874（2013）05－0058－03