基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)的痹祺膠囊治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

姚鵬飛 ，韓彥琪 ，張祥麟，許 浚 ，王 磊，李 新 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

2.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

3.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.天津藥物研究院 藥物成藥性評價與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

5.天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

6.津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300193

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種系統(tǒng)性、對稱性、異質(zhì)性的慢性自身免疫性疾病，主要病理特征為滑膜炎癥、血管翳生成、骨破壞及關(guān)節(jié)軟骨損傷等[1-2]。RA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，屬中醫(yī)“痹癥”范疇，《素問·痹論》有“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”[3]，外邪入侵是RA 的主要病因?！额愖C治裁·痹證》記載：“諸痹，良由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)侵”[4]，表明營衛(wèi)不固、腠理疏豁、氣血虧虛是RA 的內(nèi)在病因。目前西醫(yī)主要采用非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素以及生物制劑等藥物進(jìn)行治療，但長期服用會對中樞系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管損傷和肝腎功能等造成不同程度的損害[5]。中藥在RA 的治療中具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多重作用，通過對機(jī)體進(jìn)行多方面調(diào)節(jié)，療效顯著，不良反應(yīng)小，部分單味藥及其復(fù)方制劑已在臨床上得到廣泛應(yīng)用[6]。

痹祺膠囊由馬錢子、黨參、白術(shù)、丹參、茯苓、牛膝、地龍、川芎、三七和甘草10 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效。臨床上用于治療氣血不足，風(fēng)濕瘀阻，肌肉關(guān)節(jié)酸痛，關(guān)節(jié)腫大，風(fēng)濕、RA，軟組織損傷等癥[7-8]。文獻(xiàn)報(bào)道，痹祺膠囊對RA 患者療效確切，能夠顯著降低患者紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和免疫球蛋白 A（immunoglobulin A，IgA）等病理指標(biāo)，有效改善患者關(guān)節(jié)疼痛、晨僵及關(guān)節(jié)腫脹程度等癥狀，具有一定的骨保護(hù)作用，提高患者的生活質(zhì)量[9-11]?；诖耍狙芯客ㄟ^運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）技術(shù)對RA 大鼠膝關(guān)節(jié)組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，通過分析不同組間的差異表達(dá)蛋白，為RA 的診斷和發(fā)病機(jī)制提供新的線索，并初步明確痹祺膠囊對RA 的治療機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量110～130 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃、相對濕度45%～65%的屏障環(huán)境內(nèi)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津天誠新藥評價有限公司實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（No.2021031803）。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（批號408700）由天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司提供；醋酸潑尼松片（批號21020162）購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司；雷公藤總苷片（批號180502）購自上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；弗氏完全佐劑（批號SLCJ4384）購自美國Sigma 公司；雞II 型膠原蛋白（批號200323）購自Chondrex公司；胰蛋白酶（批號 20220408）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM，批號SLCB6518）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT，批號P1171）購自美國Promega 公司；尿素（批號STBJ7774）購自美國GibcoBRL 公司；乙二胺四乙酸（批號2398B510）、苯甲基磺酰氟（批號0106B036）、考馬斯亮藍(lán)染料G250（批號 0138B020）、過硫酸胺（批號BCBG6210V）購自美國Amresco 公司；十二烷基硫酸鈉（ 批號 031M0035V ）、TEMED （ 批號SHBC4286V）、溴酚藍(lán)（批號SHBL3668）購自美國Sigma 公司；乙腈（批號F21LCL201）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；TMT 試劑盒（批號WJ334398）購自美國Pierce 公司。

1.3 儀器

L-3000 型常規(guī)液相（RIGOL 公司）；Ultimate 3000 nano LC system 納升液相（美國DIONEX 公司）；Powerlook 2100XL-USB 掃描儀（英國UMAX 公司）；Fisher Q-Exactive 質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-7C 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選取10只作為對照組，其余大鼠在左側(cè)足跎肉墊處皮內(nèi)注射雞II 型膠原蛋白（0.1 mL/只），對照組注射等體積生理鹽水。在第1 次注射免疫的第7 天，在背部注射0.1 mL 相同乳劑加強(qiáng)免疫，觀察大鼠狀態(tài)至造模第15 天，篩選雙側(cè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥腫脹的大鼠隨機(jī)分為模型組、潑尼松（10 mg/kg）組、雷公藤總苷（10 mg/kg）組和痹祺膠囊各劑量（0.05、0.10、0.20、0.40 g/kg）組，每組10 只。各給藥組連續(xù)ig 給藥15 d，對照組及模型組ig 等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。末次給藥前禁食不禁水12 h 以上，末次給藥結(jié)束1 h 后，麻醉，腹主動脈采血，取對照組（C）、模型組（M）、痹祺膠囊0.4 g/kg 組（BQ）的大鼠左膝關(guān)節(jié)組織，每組隨機(jī)取3 個樣本混為1 個重復(fù)樣本，每組3 個重復(fù)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2.2 樣品蛋白提取及濃度測定

在組織樣品中加入裂解液，置于研磨機(jī)中勻漿混勻后，4 ℃、20 000×g離心30 min。取上清后加入預(yù)冷的TCA-丙酮，?20 ℃沉淀2 h 以上。純丙酮洗滌，4 ℃、20 000×g離心30 min 后棄上清，在沉淀加入純丙酮，?20 ℃沉淀20 min，重復(fù)3 次，清洗沉淀。在沉淀中加入裂解液，超聲5 min 助溶，20 000×g離心30 min，取上清。加入DTT 至終濃度10 mmol/L。56 ℃水浴1 h，隨后迅速加入IAM至終濃度55 mmol/L，暗處靜置1 h。20 000×g離心30 min，取上清，使用BCA 法對蛋白進(jìn)行定量，取1 μL 蛋白提取液（0.2 mg/mL）進(jìn)行濃度測定。根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳檢測，判定蛋白濃度的準(zhǔn)確度及蛋白提取質(zhì)量。

2.3 蛋白質(zhì)酶解及肽段TMT 標(biāo)記

分別取每個樣品30 μg 加入到10 K 超濾管中，4 ℃、14 000×g離心40 min 后，棄上清液。隨即加入200 μL TEAB 溶液（50 mmol/L），4℃、14 000×g離心40 min，棄上清液。加入1 μg/μL Trypsin，100 μg 蛋白質(zhì)底物加入3.3 μg 酶，37 ℃水浴24 h。凍干消化液，然后每管加入25 μL TEAB（200 mmol/L）復(fù)溶肽段。每管加入41 μL 乙腈，加入TMT 標(biāo)記試劑，混勻后，室溫孵育1 h；加入8 μL 5%羥胺，室溫放置15 min，真空濃縮儀抽干。

2.4 肽段預(yù)分離

使用RIGOL L-3220 型常規(guī)液相進(jìn)行肽段預(yù)分離純化，色譜條件：Gemini NX-C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm），流動相為5%乙腈水溶液（A）-95%乙腈水溶液（B），梯度洗脫：0～95 min，100%A；95～101 min，100%～95% A；101～107 min，95%～91% A；107～113 min，91%～87% A；113～119 min，87%～81% A；119～125 min，81%～20%A；125～130 min，20%～95% A；體積流量1 mL/min。準(zhǔn)備樣品：標(biāo)記后抽干的樣品用1 mL 5%乙腈水溶液溶解，15 000×g離心10 min，取上清進(jìn)行測試，得到預(yù)分離色譜圖，按照色譜圖分布，將出峰較少的組分進(jìn)行合并，最終合并成10 個組分，凍干后使用C18反相色譜進(jìn)行除鹽。

2.5 蛋白質(zhì)譜檢測

將10個預(yù)分離的樣品采用Dionex ultimate 3000 nano LC system 納升液相進(jìn)行分離。流動相A 為0.1%甲酸-2%乙腈水溶液，B 為0.1%甲酸-98%乙腈水溶液，洗脫梯度：0～40 min，95% A；40～45 min，95%～70% A；45～48 min，70%～40% A；48～55 min，40%～20% A；55～65 min，20%～95% A；體積流量0.4 μL/min。分離后使用Q-Exactive 質(zhì)譜儀檢測肽段信號，質(zhì)譜條件及參數(shù)為正離子模式，母離子掃描范圍m/z350～2000，二級分辨率35 000，毛細(xì)管溫度320 ℃，離子源電壓1800 V，碎裂模式高能碰撞解離（higher collision energy dissociation，HCD），歸一化碰撞能量為30 eV。

2.6 蛋白質(zhì)鑒定及定量分析

將質(zhì)譜原始文件輸入到PD（Proteome Discoverer 1.4，Thermo）軟件對質(zhì)譜譜圖進(jìn)行篩選，譜圖篩選母離子范圍m/z350～6000，二級質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)10，信噪比閾值1.5。PD 軟件根據(jù)Mascot 2.3 搜索結(jié)果和篩選后的譜圖進(jìn)行蛋白鑒定，參數(shù)設(shè)置：固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M）、Gln→Pyro-Glu（N-term Q）、TMT 6 plex（K）、TMT 6plex（N-term），一級質(zhì)量偏差為1.5×10?5，二級質(zhì)量偏差為6×10?6，最大允許露切數(shù)為1，酶的類型為Trypsin。鑒定所用蛋白數(shù)據(jù)庫為Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）。定量分析時蛋白定量取值類型為Median，最小肽段數(shù)為1，歸一化方法為Median。對結(jié)果進(jìn)行ANOVA 方差分析，進(jìn)行差異顯著性評估。選取P＜0.05、差異倍數(shù)≥1.2 或差異倍數(shù)≤0.83 的蛋白為差異表達(dá)蛋白。

2.7 差異表達(dá)蛋白聚焦分析

對MvsC、BQvsM 2 個比較組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行Venn 圖分析，得到痹祺膠囊干預(yù)后有回調(diào)趨勢的蛋白，進(jìn)一步與GeneCards、OMIN 數(shù)據(jù)庫檢索得到的RA 疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，從而獲取痹祺膠囊治療后與RA 疾病相關(guān)的回調(diào)蛋白。

2.8 生物信息學(xué)分析

通過OmicsBean 數(shù)據(jù)庫對RA 相關(guān)的回調(diào)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別從細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過程（biological process，BP）3 個方面對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能分析，同時對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R version 3.6.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，兩組間比較采用ANOVA 方差分析。

3 結(jié)果

3.1 差異表達(dá)蛋白結(jié)果分析

以P＜0.05、差異倍數(shù)≥1.2 或差異倍數(shù)≤0.83為條件篩選MvsC、BQvsM、BQvsC 的差異蛋白（顯著上調(diào)表達(dá)蛋白和顯著下調(diào)表達(dá)蛋白），統(tǒng)計(jì)得到的差異表達(dá)蛋白火山圖見圖1。結(jié)果顯示，MvsC 組共有1583 個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白有784 個，下調(diào)蛋白有799 個；BQvsM 組共有234 個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白有124 個，下調(diào)蛋白有110 個；BQvsC 組共有1548 個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白有761 個，下調(diào)蛋白有787 個。

圖1 火山結(jié)果示意圖Fig.1 Volcanic result diagram

通過對痹祺膠囊治療前后的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行Venn 圖分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療前后共有187 個蛋白重疊，其中有121 個差異表達(dá)蛋白具有回調(diào)趨勢（熱圖分析見圖3），其中69 個蛋白在M 組中表達(dá)升高，經(jīng)痹祺膠囊治療后顯著下調(diào)；52 個蛋白在M 組中表達(dá)降低，痹祺膠囊治療后顯著上調(diào)。由于這121 個蛋白在造模前后和給藥治療后均發(fā)生了顯著的差異表達(dá)變化，初步推斷它們與RA 的發(fā)病以及痹祺膠囊的干預(yù)途徑密切相關(guān)，極有可能成為痹祺膠囊治療RA 的潛在靶標(biāo)蛋白。

圖2 各組差異蛋白Venn 圖Fig.2 Venn digram of differential protein analysis in each group

圖3 121 個回調(diào)蛋白熱圖Fig.3 Heat map of 121 callback proteins

3.2 回調(diào)蛋白聚焦分析

為了進(jìn)一步聚焦痹祺膠囊對RA 作用的核心靶點(diǎn)，通過GeneCards、OMIN 數(shù)據(jù)庫檢索RA 疾病靶點(diǎn)，共得到5082 個疾病靶點(diǎn)，通過與121 個回調(diào)蛋白進(jìn)行交集分析，最終得到38 個與RA 疾病相關(guān)的回調(diào)蛋白，相關(guān)信息見表1，初步認(rèn)為38 個蛋白為痹祺膠囊干預(yù)的核心靶點(diǎn)。

表1 與RA 疾病相關(guān)的回調(diào)蛋白信息Table 1 Callback protein information associated with RA disease

3.3 生物信息學(xué)分析

GO 分析結(jié)果見圖4（以P值最小的前20 個條目進(jìn)行做圖分析）。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，38 個核心回調(diào)蛋白在CC 方面主要參與細(xì)胞外囊泡、外泌體、基質(zhì)、細(xì)胞外空間成分的構(gòu)成，也涉及多種細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、核糖體亞基以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的組成。在BP方面主要涉及對代謝過程、分子功能、多種生物過程的調(diào)控，調(diào)節(jié)有機(jī)物間的相互作用及反應(yīng)等生物過程。在MF 方面主要參與多種蛋白質(zhì)、蛋白酶、整合素、細(xì)胞黏附分子、RNA 結(jié)合等生物成分的結(jié)合過程，調(diào)節(jié)生物結(jié)構(gòu)成分、多種蛋白酶及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分的活性。由此可推斷痹祺膠囊可能通過干預(yù)上述生物過程及功能，多方面調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能，進(jìn)而發(fā)揮對RA 的治療作用。

圖4 RA 相關(guān)的回調(diào)表達(dá)蛋白GO 功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis of RA-related callback proteins

3.4 通路富集分析

通路富集分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，38 個核心回調(diào)蛋白參與了RA 信號通路，與免疫和炎癥相關(guān)的通路如T、B 細(xì)胞受體信號通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化信號通路、Th17 細(xì)胞分化信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等，與骨破壞相關(guān)的通路如破骨細(xì)胞分化信號通路，與血管翳生成相關(guān)通路如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路，與活血相關(guān)信號通路如血管平滑肌收縮、花生四烯酸代謝等。結(jié)果表明，痹祺膠囊可能通過干預(yù)β2 整合素（integrin subunit beta 2，ITGB2）、鈣調(diào)磷酸酶B 亞基（calcineurin subunit B type 1，PPP3R1）、鈣調(diào)蛋白2（calmodulin 2，CALM2）、前列腺素合成酶（prostacyclin synthase，PTGIS）及FOMD 等核心蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)與免疫、炎癥、破骨細(xì)胞分化、血管平滑肌及血管翳生成等相關(guān)信號通路，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制、抗炎、活血、抑制破骨細(xì)胞分化及血管翳生成等作用，從而達(dá)到對RA 的治療效果。

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

4 討論

RA 是一種病因不明的進(jìn)行性自身免疫性疾病，主要發(fā)病部位在于骨膜組織及其下的軟骨，表現(xiàn)為滑膜炎、軟骨損傷、多關(guān)節(jié)炎癥及損傷等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA 屬于“痹證”范疇，與“風(fēng)、寒、濕”外邪入侵機(jī)體有關(guān)，其侵入人體，進(jìn)而閉阻經(jīng)絡(luò)，淤血痰濁，致使氣血不通，不通則痛，最終邪氣停留于關(guān)節(jié)，日久而成痹，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大變形、淤血疼痛等癥狀[12-13]。痹祺膠囊具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，對RA 具有良好的療效。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊通過調(diào)節(jié)多個蛋白的表達(dá)，干預(yù)了RA 信號通路、免疫及炎癥信號傳遞、破骨細(xì)胞分化等過程，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制、抗炎、軟骨保護(hù)及活血等作用（圖6）。

圖6 痹祺膠囊作用機(jī)制預(yù)測圖Fig.6 Biqi Capsule mechanism prediction diagram

RA 作為自身免疫系統(tǒng)性疾病，涉及多種免疫器官及免疫細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)等過程?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，痹祺膠囊可通過下調(diào)白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、IL-18 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎癥因子表達(dá)，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化及Th1/Th2 細(xì)胞因子的平衡，有效抑制關(guān)節(jié)炎癥及滑膜增殖[14-15]；T 淋巴細(xì)胞的增殖及分化在RA 的發(fā)病過程中具有重要作用。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）是一類介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間起黏附作用的糖蛋白，在RA 滑膜炎癥及免疫調(diào)節(jié)的形成過程中起重要作用[16]；ITGB2 作為T 細(xì)胞增殖及活化過程中的關(guān)鍵蛋白，通過與ICAM-1 特異性結(jié)合，進(jìn)而引起T 細(xì)胞的黏附、遷移，同時刺激T 細(xì)胞活化，活化的T 細(xì)胞會促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，致使機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，同時伴隨炎癥的發(fā)生[17]。此外，白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移與自身免疫和炎癥形成密切相關(guān)。在組織損傷或感染時，表達(dá)在白細(xì)胞上的ITGB2與血管內(nèi)皮上的黏附分子ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）相互結(jié)合，緊密黏附后穿越內(nèi)皮細(xì)胞及基膜，跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移而離開血管，從而引發(fā)自身免疫反應(yīng)及炎癥[18-19]。另外，蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 gene，PTPN22）是參與T 細(xì)胞信號調(diào)節(jié)的分子之一，其通過去磷酸化和失活T 細(xì)胞受體相關(guān)的激酶及其底物來防止T 細(xì)胞激活，可作為T 細(xì)胞激活負(fù)調(diào)節(jié)因子[20-21]。β2 微球蛋白（Beta-2-microglobulin，B2M）通常與主要組織相容性復(fù)合體 I（major histocompatibility complex I，MHC-I）負(fù)責(zé)多種免疫細(xì)胞的抗原呈遞，參與T 細(xì)胞的激活過程，可作為RA 診斷的標(biāo)志物及治療的潛在靶點(diǎn)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組ITGB2、B2M 的表達(dá)顯著升高，PTPN22 表達(dá)顯著降低，而經(jīng)痹祺膠囊干預(yù)后均可顯著回調(diào)，由此可見痹祺膠囊可通過抑制ITGB2、B2M 表達(dá)，增加PTPN22 表達(dá)，從而抑制T 淋巴細(xì)胞活化及抗原遞呈，影響其功能的發(fā)揮，進(jìn)而降低IL-6、IL-17、TNF-α、γ-干擾素（interferonγ，IFN-γ）等下游細(xì)胞因子表達(dá)；同時也可有效阻止白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程，抑制白細(xì)胞募集，共同發(fā)揮免疫抑制及抗炎作用。

Ca2+作為第二信使，參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生物過程及功能，包括細(xì)胞存活、增殖、凋亡及免疫應(yīng)答，同時參與多種疾病過程，與RA 發(fā)病密切相關(guān)[24]，王中華等[25]通過基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與GEO 芯片方法探究發(fā)現(xiàn)鈣信號通路是痹祺膠囊治療RA 的關(guān)鍵通路，可通過調(diào)節(jié)基因功能發(fā)揮作用。T 細(xì)胞、B 細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞表面上的抗體與攜帶抗原肽的抗原提呈細(xì)胞結(jié)合，通過激活與不同磷脂酶C 亞型偶聯(lián)的G 蛋白偶聯(lián)受體，刺激三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，InsP3）的形成，InsP3 擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi)通過與其受體結(jié)合后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高[26-27]，Ca2+與CALM2結(jié)合形成復(fù)合物，與PPP3R1結(jié)合后激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，激活T 細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）級聯(lián)信號反應(yīng)的正調(diào)控[27-28]，最終調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17 細(xì)胞分化并產(chǎn)生IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-17 等細(xì)胞因子，同時使得活化后的B 細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，進(jìn)而在機(jī)體自身免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)中共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[29-31]。另一方面，在破骨細(xì)胞分化過程中，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的抑制核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）與破骨細(xì)胞表面的核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）結(jié)合，經(jīng)磷脂酶C（phospholipase C，PLC）激活3InsP3-Ca2+信號通路，鈣信號通過活化NFAT的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)與破骨分化相關(guān)基因抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metallopeptidase-1，MMP-1）和MMP-3 等表達(dá)，促使破骨細(xì)胞發(fā)生融合、細(xì)胞骨架重塑和發(fā)揮骨吸收功能[32-33]，研究發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊能顯著下調(diào)RANKL 表達(dá)，上調(diào)骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）表達(dá)，從而抑制滑膜增生，減輕關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞[34-35]。同時，Ca2+也參與血管平滑肌收縮信號通路，PLC-β 激活后，啟動Ca2+信號通路，肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）可由CALM2 激活，進(jìn)而對肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）進(jìn)行磷酸化，使肌動球蛋白得以激活肌球蛋白三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶，最終引起血管平滑肌的收縮[36]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA 模型組CALM2 和PPP3R1 的表達(dá)顯著高于對照組，經(jīng)痹祺膠囊干預(yù)后有顯著回調(diào)趨勢，由此推測，痹祺膠囊通過抑制CALM2 和PPP3R1 表達(dá)，進(jìn)而阻礙鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制NFAT 的轉(zhuǎn)錄，有效抑制T 細(xì)胞、B 細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制與破骨分化相關(guān)基因的表達(dá)及血管平滑肌收縮，從而發(fā)揮免疫抑制、抗炎、抑制骨吸收及活血等作用。

在花生四烯酸代謝中，PTGIS 會促進(jìn)其代謝產(chǎn)生前列環(huán)素（prostaglandin I2，PGI2），其具有強(qiáng)烈的舒張血管和抑制血小板聚集的作用[37]，同時也具有一定的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[38-39]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，痹祺膠囊可使PTGIS 表達(dá)升高，通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集，發(fā)揮活血功效。

綜上分析，痹祺膠囊通過影響ITGB2、CALM2、PPP3R1、PTPN22、B2M、PTGIS 等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，抑制T 淋巴細(xì)胞的活化、增殖及白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移，阻止Ca2+通路的信號傳導(dǎo)，調(diào)控花生四烯酸代謝等生物過程，發(fā)揮免疫抑制、抗炎、抑制骨吸收及活血等藥理作用。后續(xù)仍需針對這些關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步明確痹祺膠囊治療RA 的作用機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突