五加皮中二萜類化學(xué)成分及其抗炎活性研究

張 雪 ，解盈盈，劉 琦，關(guān)永霞，趙淑秀，劉青芝，林永強(qiáng)，郭東曉 ?

1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥監(jiān)局膠類產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，中藥配方顆粒共性技術(shù)山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南 250101

2.山東現(xiàn)代學(xué)院，山東 濟(jì)南 250104

3.經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

4.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

五加皮為五加科五加屬植物細(xì)柱五加AcanthopanaxgracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，又稱南五加皮、五谷皮、紅五加皮，主要分布于我國(guó)湖北、河南、陜西、安徽、浙江、遼寧、河北等省，為臨床常用的傳統(tǒng)中藥材[1]。五加皮始載于《本經(jīng)》，主要功效為祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、利水消腫，臨床上主要用于治療風(fēng)濕痹病、筋骨萎軟、小兒行遲、體虛泛力、水腫和腳氣等疾病[2]?！吨腥A本草》[3]中記載五加皮具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗應(yīng)激、抗腫瘤、提高免疫力等作用，其化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、萜類、甾醇類、有機(jī)酸類、脂肪酸類、苯丙素類、黃酮類等[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，五加皮具有很好的抗炎活性[5-6]。

本研究從五加皮70%乙醇提取物中分離得到13 個(gè)二萜類化合物，包括7 個(gè)海松烷型二萜7β-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7β-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，1]、7- 酮基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，2]、7β-甲氧基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸 [7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid，3]、6,8(14),15-三烯-19-異海松羧酸[ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid，4]、14-酮基-8,15-二烯-19-異海松羧酸（14-oxo-ent-pimara-8,15-dien-19-oic acid，7）、14-羥基-16-乙烯基-8,11,13-三烯-17-異海松羧酸（14-hydroxy-16-devinyl-entpimara-8,11,13-trien-17-oic acid，8）、7α-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸[7α-hydroxy-entpimara-8(14),15-dien-19-oic acid，11]；以及6 個(gè)貝殼杉烷型二萜16α,17-二羥基-19-異貝殼杉烷羧酸（16α,17-dihydroxy-ent-kaur-19-oic acid，5）、17-羥基-19-異貝殼杉烷羧酸（17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid，6）、異貝殼杉烯酸（ent-kaur-16-en-19-oic acid，9）、17-醛基-19-異貝殼杉烯酸（17-oxo-ent-kaur-19-oic acid，10）、17-醛基-15-烯-19-異貝殼杉烷酸（17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid，12）和17-羥基-15-烯-19-異貝殼杉烷酸（17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid，13）。其中化合物8 為新化合物，命名為細(xì)柱五加酸G1，3 和4 為首次從細(xì)柱五加植物中分離得到。采用Griess 法測(cè)試脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞釋放炎癥因子模型，對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行了抗炎活性評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance Ⅲ 600 核磁共振波譜儀，德國(guó)布魯克公司；METTLER TOLEDO XSE205 型電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；Buchi R210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步奇公司；Agilent 1200 型HPLC 色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；HPLC-IT-TOF-MS 液質(zhì)聯(lián)用儀，日本島津公司；Bio Tek EPOCH2NS 酶標(biāo)儀，美國(guó)博騰公司。

乙醚、正丁醇、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MCI GEL CHP20P（37～75 μm），日本三菱化學(xué)株式會(huì)社；柱色譜硅膠（200～300 目），青島海灣精細(xì)化工有限公司；Sephadex LH-20，北京索萊寶科技有限公司；硅膠薄層板，煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所；HPLC 色譜柱，SymmentryShiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MTT 溶液，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；（Eagle）DMEM 高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清，上海達(dá)特希爾生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），Life Science 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；對(duì)氨基苯磺酰胺，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；胰酶，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；3,4-二羥基苯甲羥肟酸（DiDOX），美國(guó)MedChem Express 公司，批號(hào)HY-19387/CS-5292；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）；NO 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 材料

五加皮產(chǎn)地為湖北，經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院穆向榮副主任藥師鑒定為五加科五加屬植物細(xì)柱五加A.gracilistylusW.W.Smith.的干燥根皮，樣品（SDIFDC-G-AGZ01）保存于山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

2 方法

2.1 提取與分離

取五加皮藥材4 kg，粉碎，以70%乙醇為溶劑，加熱回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，減壓回收溶劑，得到粗提物浸膏600 g。將粗提物用適量溫水分散，用乙醚萃取3 次，合并萃取液，減壓濃縮得乙醚層浸膏130.2 g。將乙醚層浸膏溶解后經(jīng)MCI樹(shù)脂柱分離，用甲醇-水溶液（40%～100%）梯度洗脫，共得到7 個(gè)流分。流分4 用硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶1～1∶1）進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)TLC 檢測(cè)并合并相同組分，得到Fr.4A～4U 共21個(gè)組分。組分4L 經(jīng)結(jié)晶得到化合物1（60 mg），經(jīng)硅膠柱（石油醚-丙酮19∶5～17∶1）分離，結(jié)晶得到化合物4（2.0 mg）；組分4J 和4D 經(jīng)結(jié)晶分別得到2（32 mg）和3（33 mg）；組分4N 先后經(jīng)石油醚-醋酸乙酯（15∶1～10∶1）洗脫和HPLC 色譜（柱溫40 ℃，甲醇-水56∶44，tR＝11.320 min）分離得到化合物6（4.7 mg）；組分4H 經(jīng)硅膠柱（二氯甲烷-甲醇100∶1～80∶1）和HPLC 色譜（甲醇-水68∶32）分離得到化合物7（28 mg）；組分4R 經(jīng)硅膠柱（二氯甲烷-甲醇90∶1～70∶1）分離得到化合物5（21 mg）。流分3 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶1～1∶1）進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.3A～3X 共24 個(gè)組分。組分3J 經(jīng)凝膠柱和HPLC 色譜（柱溫35 ℃，甲醇-水70∶30）分離得到化合物8（3.3 mg）。流分5 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶1～1∶1）進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.5A～5M 共26 個(gè)組分。組分5B 經(jīng)結(jié)晶得到化合物9（205 mg）；組分5J 經(jīng)凝膠柱和重結(jié)晶得到化合物11（1.0 mg）；組分5E 先后經(jīng)凝膠和硅膠柱（石油醚-醋酸乙酯50∶1～43∶1）分離得到化合物10（34 mg）和12（3.6 mg）。流分6 用硅膠柱，以石油醚-丙酮系統(tǒng)（100∶1～1∶1）進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr.6A～6J 共10 個(gè)組分。組分6G 經(jīng)凝膠柱色譜分離得到化合物13（9.7 mg）。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2環(huán)境下，向高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清，加入復(fù)蘇的RAW264.7 細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞密度為8×104個(gè)/孔。以每孔200 μL 的量加入96孔板，待細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后用于實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 MTT 法檢測(cè)藥物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為8×105個(gè)/孔，接種于96 孔板中，每孔200 μL，分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（陽(yáng)性藥物為DiDOX）和實(shí)驗(yàn)組（加入待測(cè)化合物）處理。細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄去上清液，加入200 μL DMSO 避光振搖10 min，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝A實(shí)驗(yàn)/A空白對(duì)照

2.2.3 單體化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的測(cè)試 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔加入96 孔板中，每孔200 μL，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，去除上清液，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、LPS 組（1.0μg/mL LPS）、不同濃度的化合物（1.0 μg/mL LPS＋100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L）。各組細(xì)胞加入藥物或空白培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取上清液100 μL，加入100 μL Griess 試劑，室溫放置10 min，波長(zhǎng)設(shè)置為570 nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定A，將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝0.006 4C＋0.002 4，r＝0.999 7，其中A為吸光度，C為亞硝酸鈉濃度，計(jì)算NO 釋放量。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 1 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測(cè)分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.69(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.46 (1H, brs, H-14),4.96 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.84 (1H, dd,J=17.4, 1.7 Hz, H-16), 4.28 (1H, brs, H-7), 2.20 (1H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.12 (1H, m, H-9), 2.10 (2H, m, H-6), 1.84 (1H, dd,J= 9.0, 7.0 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 3.4, 13.9 Hz, H-2β), 1.72 (1H, brd,J= 13.1 Hz, H-1β), 1.59 (2H, m, H-11β, 12β), 1.47 (1H, dq,J= 3.0,14.0 Hz, H-2α), 1.27 (3H, s, H-18), 1.24～1.37 (2H, m,H-11α, 12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J=13.5, 13.5, 4.5 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19),146.4 (C-14), 140.2 (C-8), 133.2 (C-15), 113.3 (C-16),73.2 (C-7), 48.3 (C-5), 45.7 (C-9), 39.2 (C-4), 39.2 (C-1), 43.6 (C-10), 38.5 (C-13), 37.9 (C-3), 35.5 (C-12), 30.6(C-6), 29.0 (C-18), 28.8 (C-17), 19.6 (C-2), 18.7 (C-11),13.0 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]，故鑒定該化合物為7β-羥基-8(14),15-二烯-19-異海松烷酸。

化合物2：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 2 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測(cè)分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.58(1H, s, H-14), 5.68 (1H, dd,J= 17.5, 10.5 Hz, H-15),5.00 (1H, dd,J= 10.5, 1.4 Hz, H-16α), 4.76 (1H, dd,J= 17.5, 1.4 Hz, H-16β), 3.13 (1H, dd,J= 18.8, 13.6 Hz, H-6α), 2.81 (1H, dd,J= 18.8, 5.0 Hz, H-6β), 2.19(1H, m, H-9), 2.01 (1H, dd,J= 16.4, 5.0 Hz, H-5), 1.25(3H, s, H-20), 1.13 (3H, s, H-18), 0.76 (3H, s, H-17)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 200.6 (C-7), 182.1 (C-19), 145.7 (C-15), 142.8 (C-14), 136.8 (C-8), 114.3 (C-16), 51.7 (C-5), 50.4 (C-9), 44.0 (C-4), 39.3 (C-13),38.8 (C-12), 38.7 (C-1), 38.0 (C-3), 37.3 (C-10), 35.0(C-6), 28.4 (C-18), 28.3 (C-17), 19.6 (C-2), 19.1 (C-11),12.9 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，故鑒定該化合物為7-oxo-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物3：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:331.226 8 [M－H]?，理論值為331.227 9，推測(cè)分子式為C21H31O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.70(1H, dd,J= 17.3, 10.4 Hz, H-15), 5.40 (1H, s, H-14),4.97 (1H, dd,J= 10.4, 1.7 Hz, H-16), 4.88 (1H, dd,J=17.3, 1.7 Hz, H-16), 3.60 (1H, t,J= 3.1 Hz, H-7), 3.16(3H, s, H-21), 2.15 (2H, m, H-3), 2.06 (1H, m, H-6),1.92 (1H, m, H-9), 1.76 (1H, m, H-5), 1.68 (2H, m, H-1), 1.60 (2H, m, H-12), 1.46 (2H, m, H-2), 1.34 (2H, m,H-11), 1.26 (3H, s, H-18), 1.08 (3H, s, H-17), 0.65 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.6 (C-19),146.4 (C-15), 135.5 (C-8), 134.5 (C-14), 113.2 (C-16),81.7 (C-7), 54.6 (C-21), 48.8 (C-5), 45.7 (C-9), 43.6 (C-4), 39.1 (C-10), 38.8 (C-1), 38.7 (C-13), 37.8 (C-3),35.5 (C-12), 29.9 (C-6), 29.6 (C-17), 28.8 (C-18), 19.5(C-2), 18.7 (C-11), 13.2 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]，故鑒定該化合物為7β-methoxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物4：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:299.200 7 [M－H]?，理論值為299.201 7，推測(cè)分子式為C20H28O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 6.6(1H, dd,J= 2.7, 11.6 Hz, H-6), 6.03 (1H, brd,J= 11.6 Hz，H-7), 5.72 (1H, dd,J= 17.2, 10.1 Hz, H-15), 5.24(1H, s, H-14), 4.96 (1H, dd,J= 10.3, 1.7 Hz, H-16),4.86 (1H, dd,J= 17.3, 1.8 Hz, H-16), 2.15～2.25 (1H,m, H-3), 2.04～2.10 (1H, m, H-5), 1.91～1.99 (1H, m,H-9), 1.79～1.91 (1H, m, H-11), 1.68～1.75 (2H, m,H-1), 1.60～1.66 (1H, m, H-12), 1.53～1.55 (1H, m,H-11), 1.50～1.53 (1H, m, H-2), 1.33 (3H, s, H-18),1.28～1.31 (1H, m, H-12), 1.24～1.28 (1H, m, H-2),1.07～1.09 (1H, m, H-3), 1.07 (3H, s, H-17), 0.63 (3H,s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 180.9 (C-19),147.3 (C-15), 135.9 (C-8), 131.7 (C-14), 128.3 (C-7),127.4 (C-6), 113.1 (C-16), 55.5 (C-5), 49.3 (C-9), 43.2(C-4), 38.9 (C-13), 37.9 (C-10), 37.4 (C-3), 37.2 (C-1),35.4 (C-12), 29.0 (C-17), 28.2 (C-18), 19.5 (C-11), 18.6(C-2), 11.8 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，故鑒定該化合物為ent-pimara-6,8(14),15-trien-19-oic acid。

化合物5：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:335.221 9 [M－H]?，理論值為335.222 8，推測(cè)分子式為C20H32O4。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 3.70(1H, d,J= 11.3 Hz, H-17α), 3.59 (1H, d,J= 11.3 Hz,H-17β), 2.11 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-3α), 2.02 (1H, brs,H-13), 1.18 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.83 (1H,td,J= 13.0, 4.0 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz,CDCl3)δ: 181.5 (C-19), 82.8 (C-16), 66.8 (C-17), 58.0(C-5), 57.3 (C-9), 53.7 (C-15), 46.2 (C-13), 45.7 (C-8),44.6 (C-4), 43.2 (C-7), 41.8 (C-1), 40.7 (C-10), 39.1 (C-14), 38.1 (C-3), 29.3 (C-18), 27.1 (C-12), 23.2 (C-6),20.1 (C-2), 19.5 (C-11), 16.1 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定該化合物為16α,17-dihydroxyent-kaur-19-oic acid。

化合物6：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:319.226 8 [M－H]?，理論值為319.227 9，推測(cè)分子式為C20H32O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 3.29 (1H,s, H-17), 1.17 (3H, s, H-18), 0.96 (3H, s, H-20), 0.92～0.81 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ:181.8 (C-19), 67.9 (C-17), 58.5 (C-5), 57.1 (C-9), 46.5 (C-15), 46.1 (C-8), 44.8 (C-4), 44.6 (C-16), 43.1 (C-14), 42.3(C-1), 41.0 (C-10), 39.7 (C-13), 39.4 (C-7), 38.2 (C-3),32.7 (C-12), 29.7 (C-18), 23.9 (C-6), 20.5 (C-2), 20.1 (C-11), 16.5 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，故鑒定該化合物為17-hydroxy-ent-kaur-19-oic acid。

化合物7：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:315.195 5 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測(cè)分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.04(1H, dd,J= 17.7, 10.9 Hz, H-15α), 5.07 (1H, d,J=10.8 Hz, H-16), 4.97 (1H, d,J= 17.6 Hz, H-16), 2.40(2H, m, H-6α, 6β), 2.19 (1H, d,J= 13.0 Hz, H-3α), 2.11(1H, m, H-11α), 2.00 (1H, m, H-7β), 2.42 (1H，m, H-7α), 1.96 (1H, m, H-2α), 1.95 (1H, m, H-1α), 1.92 (1H,m, H-12α), 1.80 (1H, m, H-12β), 1.78 (1H, m, H-11β),1.56 (1H, m, H-2β), 1.35 (1H, brd,J= 12.5 Hz, H-5β),1.24 (3H, s, H-19β), 1.21 (1H, m, H-1β), 1.14 (3H, s,H-17), 1.07 (1H, d,J= 4.2 Hz, H-3β), 1.04 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 204.5 (C-14),181.0 (C-18), 165.2 (C-9), 143.4 (C-15), 130.1 (C-8),113.1 (C-16), 53.1 (C-5), 47.3 (C-13), 44.4 (C-4), 40.9(C-10), 38.2 (C-3), 37.1 (C-1), 34.6 (C-12), 28.7 (C-19),26.3 (C-7), 22.2 (C-17), 22.1 (C-6), 20.7 (C-11), 20.2 (C-2), 17.8 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定該化合物為melanocane E。

化合物8：白色無(wú)定形粉末。[α]20D?40.4 (c0.10,MeOH)；, 2909, 1696, 1639, 1416, 1265,814。HR-ESI-MSm/z: 287.164 1 [M－H]?，理論值為287.165 3，推測(cè)分子式為C18H24O3，不飽和度為7。1H-NMR（表1）顯示有2 個(gè)角甲基 [δH1.12 (s), 1.27(s)] 和1 個(gè)雙鍵相連甲基 [δH2.14 (s)] 的存在。通過(guò)13C-NMRδC122.7 (C-8), 147.2 (C-9), 116.6 (C-11),127.4 (C-12), 120.3 (C-13), 151.7 (C-14) 6 個(gè)C 信號(hào)可以確定苯環(huán)的存在，δH6.73 (J= 8.4 Hz), 6.84 (J= 8.4 Hz) 為苯環(huán)上的2 個(gè)相鄰質(zhì)子。通過(guò)HMBC（圖1）中δH6.84 (J= 8.4 Hz) 與C-9、C-11 和C-14 信號(hào)相關(guān)，δH6.73 (J= 8.4 Hz) 與C-8、C-9 和C-13 信號(hào)相關(guān)，確定苯環(huán)氫位于11 和12 位；通過(guò)HMBC 中H-7 和H3-15 與C-14 的相關(guān)信號(hào)可推測(cè)出羥基在14 位；通過(guò)HMBC 中H3-16 與δC180.1 相關(guān)可推測(cè)羧基在17 位。根據(jù)HMBC 中δC147.2 與H-7、H-12、H-18 的相關(guān)，δC122.7 與H-6、H-7、H-11 相關(guān)，δC38.1 與H-1、H-2、H-5、H-18 的相關(guān)可進(jìn)一步證實(shí)其結(jié)構(gòu)。根據(jù)1H-1H COSY 中H-1 與H-2 的相關(guān)，H-2 與H-3、H-5 與H-6、H-6 與H-7、H-11與H-12 的相關(guān)，結(jié)合HMBC 中信息，可確定其平面結(jié)構(gòu)（圖1）。通過(guò)NOESY 譜中H-5 與H-1β、H-7β、H-16 相關(guān)，推斷其相對(duì)構(gòu)型（圖2）。結(jié)合以上數(shù)據(jù)，并與已知相似化合物[8]比對(duì)，化合物8 的結(jié)構(gòu)確定為 14-hydroxy-16-devinyl-ent-pimara-8,11,13-trien-17-oic acid，經(jīng)Sci-finder 檢索，是1 個(gè)新的降海松烷型二萜，命名為細(xì)柱五加酸G1。

圖1 化合物8 的結(jié)構(gòu)（左）和關(guān)鍵HMBC (→)、1H-1H COSY (━) 相關(guān)（右）Fig.1 Structure (left), key HMBC (→) and 1H-1H COSY(━) correlations (right) of compound 8

圖2 化合物8 的關(guān)鍵NOESY 相關(guān) (?)Fig.2 Key NOESY correlations (?) of compound 8

表1 化合物8 的 1H- 和 13C-NMR 數(shù)據(jù) (600/150 MHz,CD3OD)Table 1 1H- and 13C-NMR spectroscopic data for compound 8 (600/150 MHz, CD3OD)

化合物9：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:301.216 7 [M－H]?，理論值為301.217 3，推測(cè)分子式為C20H30O2。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 4.80(1H, brs, H-17α), 4.74 (1H, brs, H-17β), 2.64 (1H, brs,H-13), 2.23 (2H, m, H-15), 2.16 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-3), 2.05 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-16), 1.99 (1H, dd,J=11.2, 2.2 Hz, H-14), 1.87 (2H, m, H-1, 2), 1.82 (2H, m,H-6), 1.60 (2H, m, H-11), 1.52 (2H, dt,J= 3.5, 13.0 Hz,H-7), 1.46 (2H, m, H-12), 1.43 (1H, m, H-2), 1.24 (3H,s, H-19), 1.14 (1H, dd,J= 11.4, 5.0 Hz, H-14), 1.06 (H,d,J= 5.2 Hz, H-5), 1.03 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-9), 1.00(1H, dt,J= 4.5, 13.5 Hz, H-3), 0.95 (3H, s, H-18), 0.81(1H, dt,J= 13.4, 3.6 Hz, H-1), 0.76 (1H, s, H-20)；13CNMR (150 MHz, CDCl3)δ: 183.4 (C-19), 155.8 (C-16),103.0 (C-17), 57.1 (C-5), 55.2 (C-9), 49.0 (C-15), 44.2(C-8), 43.9 (C-13), 43.7 (C-4), 41.3 (C-7), 40.7 (C-1),39.7 (C-14), 39.6 (C-10), 37.8 (C-3), 33.1 (C-12), 28.9(C-18), 21.8 (C-6), 19.1 (C-2), 18.4 (C-11), 15.6 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定該化合物為ent-kaur-16-en-19-oic acid。

化合物10：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 4 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測(cè)分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 9.59(1H, d,J= 1.6 Hz, H-17), 2.62 (1H, t,J= 5.3, 9.2 Hz,H-16), 2.00～2.03 (1H, m, H-3α), 1.30～1.85 (8H, m,H-2α, 3β, 11, 12, 14α), 1.10 (3H, s, H-18), 0.86 (3H, s,H-20), 0.75～0.83 (1H, m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 203.9 (C-17), 178.6 (C-19), 56.0 (C-5), 54.6 (C-9), 52.7 (C-16), 48.6 (C-8), 44.6 (C-4), 42.9(C-7), 40.8 (C-1), 40.4 (C-15), 39.1 (C-10), 37.7 (C-13), 37.3 (C-3), 37.0 (C-14), 30.5 (C-12), 28.6 (C-18),22.2 (C-6), 18.9 (C-2), 18.3 (C-11), 15.4 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定該化合物為17-oxoent-kaur-19-oic acid。

化合物11：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 8 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測(cè)分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 5.74(1H, dd,J= 16.8, 10.2 Hz, H-15), 5.60 (1H, brs, H-14),4.95 (1H, dd,J= 10.8, 2.4 Hz, H-16), 4.94 (1H, dd,J=16.8, 1.8 Hz, H-16), 3.87 (1H, brs, H-7), 2.80 (1H, ddd,J= 12.7, 4.7, 1.2 Hz, H-6β), 2.55 (1H, q,J= 12.7 Hz, H-6α), 2.24 (2H, dt,J= 14.0 Hz, H-3β), 2.16 (1H, m, H-9),1.86 (1H, dd,J= 9.6, 7.8 Hz, H-5), 1.79 (1H, dt,J= 13.8,4.8 Hz, H-2β), 1.73 (1H, brd,J= 13.2 Hz, H-1β), 1.59(2H, m, H-11β, 12β), 1.44 (1H, dq,J= 14.4, 4.2 Hz, H-2α), 1.25 (3H, s, H-18), 1.25～1.36 (2H, m, H-11α,12α), 1.12 (1H, m, H-3α), 1.11 (1H, ddd,J= 13.2, 13.2,6.6 Hz, H-1α), 1.04 (3H, s, H-17), 0.67 (3H, s, H-20)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-19), 148.2 (C-15), 141.6 (C-8), 125.8 (C-14), 113.5 (C-16), 73.4 (C-7),54.1 (C-5), 50.0 (C-9), 44.6 (C-10), 40.2 (C-4), 40.1 (C-1), 39.1 (C-3), 39.0 (C-13), 36.5 (C-12), 34.9 (C-6), 29.7(C-17), 29.4 (C-18), 20.6 (C-2), 20.3 (C-11), 14.3 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]，故鑒定該化合物為7αhydroxy-ent-pimara-8(14),15-dien-19-oic acid。

化合物12：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.195 8 [M－H]?，理論值為315.196 6，推測(cè)分子式為C20H28O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 9.73(1H, s, H-17), 6.57 (1H, s, H-15), 3.04 (1H, d,J= 3.6 Hz, H-13), 2.17 (1H, d,J= 10.8 Hz, H-3α), 1.26 (3H,s, H-18), 1.00 (3H, s, H-20), 0.83 (1H, td,J= 16.8, 12.6 Hz, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 189.3 (C-17), 182.2 (C-19), 161.3 (C-15), 148.7 (C-16), 56.6 (C-5), 50.9 (C-9), 46.0 (C-8), 43.7 (C-4), 43.0 (C-7), 40.6(C-1), 40.1 (C-10), 38.2 (C-14), 37.9 (C-13), 37.8 (C-3), 28.9 (C-18), 25.1 (C-12), 20.2 (C-6), 19.0 (C-2), 18.7(C-11), 15.5 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定該化合物為17-oxo-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

化合物13：白色無(wú)定形粉末。HR-ESI-MSm/z:317.211 2 [M－H]?，理論值為317.212 2，推測(cè)分子式為C20H30O3。1H-NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 5.37(1H, d,J= 10.3 Hz, H-15), 4.19 (2H, d,J= 2.0 Hz, H-16), 2.54～2.58 (1H, m, H-13), 2.10 (1H, m, H-3α),1.23 (3H, s, H-18), 0.98 (3H, s, H-20), 0.80～0.94 (1H,m, H-1β)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3)δ: 182.4 (C-19), 146.4 (C-16), 135.9 (C-15), 61.7 (C-17), 57.1 (C-5), 49.3 (C-8), 48.0 (C-9), 44.3 (C-7), 44.0 (C-4), 41.5(C-13), 41.1 (C-1), 40.2 (C-10), 39.6 (C-14), 38.4 (C-3),29.3 (C-18), 25.9 (C-12), 21.1 (C-6), 19.5 (C-2), 19.3 (C-11), 15.8 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定該化合物為17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid。

3.2 抗炎活性篩選結(jié)果

3.2.1 單體化合物對(duì)細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組相比，13個(gè)化合物濃度在3.125～100 μmol/L，細(xì)胞活力在80%以上，無(wú)顯著性差異，可認(rèn)為在3.125～100 μmol/L 受試樣品未出現(xiàn)細(xì)胞毒性，因此實(shí)驗(yàn)選擇在此質(zhì)量濃度比較不同樣品的抗炎作用的優(yōu)劣。

3.2.2 單體化合物對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞中NO 的含量測(cè)定 為了明確五加皮中分離得到的單體化合物的抗炎作用，采用MTT 法進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%。與LPS組相比，8 種化合物均具有抗炎活性，化合物1～3、7 具有較強(qiáng)的抗炎活性，并且化合物1～5、7、9、10 隨著質(zhì)量濃度的增加，NO 的含量減少，抗炎活性增強(qiáng)；化合物6、9 質(zhì)量濃度在25～100 μmol/L 時(shí)有抗炎活性，低質(zhì)量濃度時(shí)并未發(fā)揮抗炎活性（圖3）。

圖3 13 個(gè)化合物對(duì)NO 釋放的抑制情況 (n = 3)Fig.3 Inhibitory activities of 13 compounds (n = 3)

4 討論

從五加皮中共得到13 個(gè)二萜類化合物，分別為7 個(gè)海松烷型二萜化合物1～4、7、8、11，以及6個(gè)貝殼杉烷型二萜化合物5、6、9、10、12、13。化合物8 為1 個(gè)新的降海松烷型二萜，化合物3 和4為在首次該植物中發(fā)現(xiàn)。

體外抗炎活性研究發(fā)現(xiàn)，海松烷型二萜的抗炎活性普遍高于貝殼杉烷型類化合物。對(duì)海松烷型二萜抗炎作用結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這類化合物7 位取代活性順序?yàn)棣?OH＞β-OCH3＞Δ6雙鍵＞C=O＞α-OH（活性順序?yàn)?＞3＞4＞2＞11）。

本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的五加皮二萜類化合物及其活性研究，為五加皮藥材及制劑的質(zhì)量控制方法建立、藥用資源合理開(kāi)發(fā)和利用提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突