基于體外細(xì)胞模型的痹祺膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

宋紫騰 ，卜睿臻，韓彥琪 ，王 磊，姚鵬飛 , ，許 浚 ，張鐵軍 *，劉昌孝 *

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

2.天津藥物研究院 中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

3.天津藥物研究院 藥物成藥性評(píng)價(jià)與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司，天津 300112

5.津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司，天津 300193

6.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要特征的、導(dǎo)致多關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的慢性自身免疫性疾病[1]。RA在臨床上的病理特征主要表現(xiàn)為3 個(gè)方面：炎癥、滑膜增生、骨破壞[2]。因其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，市面上沒(méi)有治療RA 的特效藥，RA 仍危害著大量人群的健康[3]。目前臨床治療RA 的化學(xué)藥主要用于減輕癥狀，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，包括嘔吐、皮疹、白細(xì)胞減少和肝腎損傷[4]。相反，中藥不僅來(lái)源廣泛、種類豐富、不良反應(yīng)小，且具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多通路綜合作用的特點(diǎn)[5-6]，因此中藥在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA 屬于“痹證”范疇，中醫(yī)經(jīng)典中的“歷節(jié)病”“骨痹”“頑痹”“尪痹”“鶴膝風(fēng)”等均歸于RA[7]。其中，風(fēng)寒濕邪、經(jīng)絡(luò)不暢、痰瘀互結(jié)是導(dǎo)致RA 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病機(jī)。故RA 的臨床治療亦遵循祛風(fēng)除濕、散寒通絡(luò)、扶正祛邪、祛痰化瘀、清熱利濕、活血通絡(luò)的治則[8]。中醫(yī)藥良好的控制炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用在治療RA 中得到了廣泛研究與應(yīng)用[9-10]。

痹祺膠囊來(lái)源于漢代名醫(yī)華佗傳世驗(yàn)方“一粒仙丹”，用于治療水濕之地百姓常見(jiàn)的骨病，由馬錢子、黨參、丹參、白術(shù)、茯苓、川芎、三七、地龍、甘草、牛膝10 味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效，臨床上用于治療氣血不足、風(fēng)濕阻滯、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、關(guān)節(jié)僵硬變形等，經(jīng)多年臨床使用證實(shí)其對(duì)RA 有確切療效[11-13]。然而，痹祺膠囊治療RA 的作用機(jī)制尚不完全明確，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，本研究通過(guò)建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥模型、細(xì)胞核因子-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophagestimulating factor，M-CSF）與RAW264.7 共孵育誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化模型以及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞RA-HFLS 增殖模型，探究痹祺膠囊及其方中19 個(gè)重要單體成分馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛、抑制破骨細(xì)胞形成及抑制滑膜增生的藥效及相關(guān)作用機(jī)制，并確定痹祺膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BDS200 型倒置顯微鏡、311 型MCO-5M CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；HFsafe-1200LC 型超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海Heal Force 公司；Spectra Max M5 型酶標(biāo)儀、T100 型PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；BD FACSVerse 型分析型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；LightCycler480II 型熒光定量PCR 儀購(gòu)自Roche 公司。

1.2 藥品與試劑

痹祺膠囊（批號(hào)311574，天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司），地塞米松、LPS、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號(hào)分別為WXBD5583V、12190801、SLCK0288，美國(guó)Sigma 公司），胎牛血清、雙抗（批號(hào)分別為2173968CP、2321126，美國(guó)Gibco 公司），甲基三氯硅烷（methyltrichlorosilane，MTS）（批號(hào)474372，美國(guó)Promega 公司），小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為2105251、2110261，上海西塘生物科技有限公司），一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號(hào)120320210414，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），人TNF-α、RANKL、M-CSF（批號(hào)分別為021825、0319233、0419245，美國(guó)Peprotech 公司），Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為021921210512，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），TRNzol Universal Reagent（批號(hào)為W9623，北京天根科技生物公司），cDNA 合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（批號(hào)分別為54746820、57313500，瑞士Roche 公司），定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物（上海生工生物工程股份有限公司）。馬錢子堿、士的寧、人參皂苷Rb1（批號(hào)分別為110706-200505、110705-200306、110704-201827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95.9%、97.0%、91.2%，中國(guó)藥品生物制品檢定所），阿魏酸、牛膝皂苷D、次黃嘌呤（批號(hào)分別為L(zhǎng)03A9D57744、S04GB159770、T13J11X107944，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為≥98%、≥94%、≥98%，上海源葉生物科技有限公司），黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、甘草次酸、甘草苷（批號(hào)分別為MUST-21061005、MUST-20110611、MUST-18072910、MUST-18060920、MUST-17101811、MUST-21030110、MUST-18053110、MUST-21011910、MUST-20110810、MUST-21090104、MUST-21060110、MUST-21030707、MUST-21052114，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為99.57%、99.97%、98.31%、98.38%、99.33%、98.60%、99.02%、98.12%、99.16%、≥98%、99.12%、99.10%、99.16%，成都曼斯特生物科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院，于DMEM 高糖完全培養(yǎng)基（含1%雙抗和10%胎牛血清）置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞RA-HFLS，購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，于DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗和10%胎牛血清）置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次。

2 方法

2.1 痹祺膠囊及單體化合物抗炎藥效實(shí)驗(yàn)

2.1.1 供試液的制備 精確稱取痹祺膠囊粉末100 mg，加入1 mL DMSO 超聲提取30 min，離心后過(guò)0.2 μm 的濾膜，得到質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的高濃度儲(chǔ)存液。精確稱取適量馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、茯苓酸、丹參素、丹參酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷對(duì)照品，加入一定量DMSO 同法配制成濃度為100 mmol/L 的高濃度儲(chǔ)存液，經(jīng)梯度稀釋得到供試溶液。

2.1.2 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/mL 均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜。加入含不同濃度痹祺膠囊（4、20、100、200、500 μg/mL）或單體化合物（1、10、50、100 μmol/L）的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后每孔加20 μL MTS 溶液置于培養(yǎng)箱孵育2 h，測(cè)孔板490 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.1.3 對(duì)NO、TNF-α 及IL-6 含量的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/mL 均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜后吸去上清，按實(shí)驗(yàn)分組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白組每孔加入100 μL 含2%血清的DMEM，模型組加入100 μL 終質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 的LPS，陽(yáng)性藥地塞米松組加入100 μL 終濃度為100 μmol/L 地塞米松和0.1 μg/mL LPS 的混合溶液，痹祺膠囊組每孔加入100 μL 終質(zhì)量濃度為200、20、2 μg/mL 的痹祺膠囊與0.1 μg/mL LPS 混合溶液，馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草苷給藥組分別加入100 μL 終濃度為100、10、1 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL 的LPS 混合溶液，丹參酮IIA、甘草次酸溶液給藥組分別加入100 μL 終濃度為50、10、2 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL的LPS 混合溶液，藁本內(nèi)酯給藥組分別加入100 μL終濃度為10、2、0.4 μmol/L 供試品和0.1 μg/mL 的LPS 混合溶液。各組細(xì)胞處理后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用試劑盒檢測(cè)NO、TNF-α、IL-6 的含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

2.2 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響

2.2.1 對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響 取生長(zhǎng)至80%～90%的RAW264.7 細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于24 孔板，8 h 后（已貼壁）吸去原培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，空白組每孔加入500 μL DMEM 完全培養(yǎng)基，模型組加入500 μL 含100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，痹祺膠囊組每孔加入500 μL 終質(zhì)量濃度為200、100、50 μg/mL 的痹祺膠囊及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基；馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草苷組每組加入500 μL終濃度為100、10 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，丹參酮IIA、甘草次酸組每組加入500 μL 終濃度為50、5 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM 完全培養(yǎng)基，藁本內(nèi)酯組每組加入100 μL 終濃度為10、1 μmol/L 的供試品及100 ng/mL RANKL、30 ng/mL M-CSF 的DMEM完全培養(yǎng)基。各組細(xì)胞處理后于培養(yǎng)箱孵育，隔天換液，共培養(yǎng)5 d 后，進(jìn)行TRAP 染色，根據(jù)TRAP染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

2.2.2 對(duì)破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因TRAP、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7 細(xì)胞，接種于6 孔板，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8 h 后，選取對(duì)破骨細(xì)胞分化有顯著抑制作用的化合物，按照“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h，隔天換液，培養(yǎng)至第5天采用TRIZOL 法提取細(xì)胞總RNA 后，測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，于熒光定量PCR 儀上檢測(cè)TRAP、CTSK的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 TRAP、CTSK 引物序列Table 1 Primer sequences of TRAP and CTSK

2.3 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RAHFLS 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3.1 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞增殖的影響取生長(zhǎng)至80%～90%的RA-HFLS 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔均勻接種于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后給藥處理，實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組，每孔加100 μL 完全培養(yǎng)基；模型組每孔加含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基；痹祺膠囊組每孔加入100 μL 終質(zhì)量濃度為1000、500、250 μg/mL 的痹祺膠囊和10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液；馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷組每孔加入100 μL 終濃度為100、10、1 μmol/L 的供試品和10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液。給藥后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTS，37 ℃，5% CO2的環(huán)境下孵育2 h后于490 nm 下檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-HFLS 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，接種于12 孔板，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，設(shè)對(duì)照組和給藥組，對(duì)照組加入1 mL含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基，給藥組加入1 mL質(zhì)量濃度分別為1000、500、250 μg/mL 的痹祺膠囊或不同濃度的待測(cè)化合物（除藁本內(nèi)酯和甘草次酸濃度設(shè)為50、5 μmol/L 外，其余化合物濃度均設(shè)為為100、10 μmol/L）與10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液，培養(yǎng)24 h 后，將所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1000 r/min 離心3 min，棄上清，取一定量細(xì)胞加入195 μL Annexin VFITC 結(jié)合液，混勻后加入5 μL Annexin V-FITC 以及10 μL 碘化丙啶染色液，室溫避光孵育20 min 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況。

2.3.3 對(duì)RA-HFLS 細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinases-3，MMP-3）、RANKL基因表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RA-HFLS 細(xì)胞，接種于6 孔板，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，按實(shí)驗(yàn)分組給藥，空白組加入2 mL 完全培養(yǎng)基，模型組加入2 mL 含10 ng/mL TNF-α 的完全培養(yǎng)基，各給藥組加入不同濃度的供試品溶液（濃度設(shè)置同“2.3.2”項(xiàng)下）與10 ng/mL 的TNF-α 混合溶液，培養(yǎng)24 h，按照TRIZOL 法提取細(xì)胞總RNA 后，測(cè)定RNA 濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，于熒光定量PCR 儀上檢測(cè)MMP-3、RANKL的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

表2 MMP-3、RANKL 引物序列Table 2 Primer sequences of MMP-3 and RANKL

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

3.1.1 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 如圖1-A 所示，痹祺膠囊質(zhì)量濃度低于200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率與空白組相比無(wú)顯著性差異，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)痹祺膠囊最大質(zhì)量濃度設(shè)為200 μg/mL。19 個(gè)化合物不同濃度下對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響如圖1-B、C所示，丹參酮IIA和甘草次酸溶液濃度為100 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率顯著低于空白組（P＜0.001），藁本內(nèi)酯溶液濃度高于50 μmol/L 時(shí)細(xì)胞存活率顯著低于空白組（P＜0.001），其余16 個(gè)化合物在1～100 μmol/L 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖均無(wú)顯著影響。因此，丹參酮IIA和甘草次酸活性檢測(cè)最大濃度設(shè)為50 μmol/L，藁本內(nèi)酯活性檢測(cè)最大濃度設(shè)為10 μmol/L，其余16 個(gè)化合物活性檢測(cè)最大濃度設(shè)為100 μmol/L。

3.1.2 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響結(jié)果如圖2、3 所示，LPS 作用于細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中的NO、TNF-α 和IL-6 分泌量明顯增加，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.001），陽(yáng)性藥地塞米松給藥濃度為100 μmol/L 時(shí)能顯著抑制NO、TNF-α 和IL-6的釋放（P＜0.001）。與模型組比較，除2 μg/mL 痹祺膠囊對(duì)細(xì)胞上清液中TNF-α 的分泌量無(wú)顯著差異外，各濃度痹祺膠囊能明顯降低細(xì)胞上清液中的NO、TNF-α 和IL-6 含量（P＜0.05、0.001），并且呈劑量相關(guān)性。與模型組比較，0.4 μmol/L 藁本內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞上清中NO 的釋放無(wú)顯著抑制作用；低濃度士的寧和丹參素、低濃度和中濃度馬錢子堿和人參皂苷Rg1以及3 個(gè)濃度黨參炔苷給藥組細(xì)胞上清液中TNF-α 的含量無(wú)顯著性差異；低濃度次黃嘌呤和牛膝皂苷D，低濃度和中濃度士的寧、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸和丹參素以及3 個(gè)濃度丹參酮IIA、甘草次酸和藁本內(nèi)酯給藥組細(xì)胞上清液中IL-6 的含量無(wú)顯著性差異，其他單體化合物在高、中、低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞上清液中NO、TNFα 和IL-6 的含量均有顯著性抑制作用（P＜0.05、0.01、0.001），并且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。

圖3 單體化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞上清液中NO (A、B)、TNF-α (C、D) 和IL-6 (E、F) 釋放的影響 (±s , n=3)Fig.3 Effects of monomer compounds on release of NO (A, B), TNF-α (C, D) and IL-6 (E, F) in supernatant of RAW264.7 cells(±s , n=3)

3.2 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的抑制作用

3.2.1 對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響 通過(guò)對(duì)各組RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行TRAP 染色，研究痹祺膠囊及19個(gè)單體化合物對(duì)RANKL 和M-CSF 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響。從圖4 可以看出，空白組中沒(méi)有觀察到破骨細(xì)胞分化，而添加RANKL和M-CSF 的模型組破骨細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.001），說(shuō)明模型建立成功。與模型組相比，痹祺膠囊各濃度均能顯著抑制破骨細(xì)胞分化的數(shù)量（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系。如表3 所示，與模型組相比，阿魏酸和丹參酮IIA低濃度給藥組，白術(shù)內(nèi)酯III、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和牛膝皂苷D 低濃度和高濃度給藥組破骨細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著性差異，其余化合物低濃度和高濃度給藥組均能顯著抑制破骨細(xì)胞的分化，破骨細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖4 痹祺膠囊對(duì)RAW246.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響 (×500，±s , n=3)Fig.4 Effects of Biqi Capsules on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (× 500,±s , n=3)

表3 不同濃度化合物給對(duì)RAW246.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (±s , n=3)

表3 不同濃度化合物給對(duì)RAW246.7 細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響 (±s , n=3)Table 3 Effects of compounds on differentiation of RAW246.7 cells into osteoclasts (±s , n=3)

與空白組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001###P < 0.001 vs blank group; *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs model group

組別 濃度/(μmol·L?1) 破骨細(xì)胞數(shù)/個(gè) 組別 濃度/(μmol·L?1) 破骨細(xì)胞數(shù)/個(gè)空白 — 0 三七皂苷R1 100 15.5±2.1***模型 — 91.5±3.5### 10 20.0±1.4***藁本內(nèi)酯 10 7.0±1.4*** 人參皂苷Rg1 100 51.5±3.5***1 55.5±5.0** 10 66.0±2.8**馬錢子堿 100 39.0±2.8** 人參皂苷Rb1 100 56.5±2.1***10 63.0±5.7* 10 69.5±2.1**士的寧 100 33.0±2.8*** 阿魏酸 100 77.0±2.8*10 50.5±3.5** 10 88.0±1.4黨參炔苷 100 52.0±2.8** 蛻皮甾酮 100 83.5±2.1 10 71.0±5.7* 10 87.5±3.5白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 100 89.5±2.1 次黃嘌呤 100 86.0±1.4 10 90.0±4.2 10 89.0±1.4茯苓酸 100 45.0±4.2** 甘草苷 100 7.0±1.4***10 63.5±4.9* 10 65.5±3.5**丹參素 100 13.5±2.1*** 牛膝皂苷D 100 82.5±4.9 10 37.0±2.8*** 10 89.5±3.5丹酚酸B 100 18.5±2.1*** 丹參酮ⅡA 50 7.0±1.4***10 61.0±2.8** 5 74.0±7.1迷迭香酸 100 16.0±1.4*** 甘草次酸 50 6.0±1.4***10 57.0±4.2** 5 77.5±3.5*

3.2.2 對(duì)破骨細(xì)胞形成相關(guān)基因TRAP、CTSK表達(dá)的影響 如圖5、6 所示，RAW264.7 細(xì)胞與RANKL和M-CSF 共孵育后，與空白組相比，破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因CTSK和TRAP表達(dá)量顯著升高（P＜0.001），痹祺膠囊各濃度給藥處理后CTSK和TRAP的基因表達(dá)量均顯著減少（P＜0.001），且呈劑量相關(guān)性。與模型組相比，馬錢子堿、黨參炔苷、丹酚酸B、人參皂苷Rg1和藁本內(nèi)酯低濃度給藥組CTSK基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異，丹酚酸B 低濃度給藥組TRAP基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異，其余化合物低濃度和高濃度給藥組CTSK、TRAP基因均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖5 痹祺膠囊對(duì)RAW264.7 細(xì)胞與RANKL 和M-CSF 共孵育后CTSK、TRAP mRNA 表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.5 Effect of Biqi Capsules on mRNA expression of CTSK and TRAP in RAW264.7 cells after co-incubation with RANKL and M-CSF (±s , n=3)

圖6 13 個(gè)化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞與RANKL 和M-CSF 共孵育后CTSK、TRAP mRNA 表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.6 Effects of 13 compounds on mRNA expression of CTSK and TRAP in RAW264.7 cells after co-incubation with RANKL and M-CSF (±s , n=3)

3.3 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)RAHFLS 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3.3.1 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞增殖的影響痹祺膠囊及19 個(gè)單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RAHFLS 細(xì)胞增殖活性影響結(jié)果如圖7、8 所示。與空白組相比，TNF-α 誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖能力顯著增高（P＜0.001），表明造模成功。痹祺膠囊在3 個(gè)給藥濃度下均能顯著降低TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。與模型組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤在3 個(gè)給藥濃度下均能顯著降低TNFα 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），丹參酮IIA、人參皂苷Rb1、甘草次酸、牛膝皂苷D 在高濃度和中濃度下能顯著降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性（P＜0.05、0.01、0.001），三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和蛻皮甾酮僅在高濃度給藥時(shí)顯著降低TNF-α 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性（P＜0.01、0.001），其中藁本內(nèi)酯、甘草次酸在100 μmol/L 濃度下有很強(qiáng)的抑制活性，細(xì)胞存活率均低于50%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)最大濃度設(shè)為50 μmol/L，其余化合物抑制細(xì)胞增殖活性不明顯。

圖8 不同濃度單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞增殖的影響 (±s , n=3)Fig.8 Effects of different concentrations of monomer compounds on TNF-α-induced RA-HFLS cell proliferation(±s , n=3)

3.3.2 痹祺膠囊及單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RAHFLS 細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)痹祺膠囊及抑制細(xì)胞增殖活性較好的9 個(gè)單體化合物對(duì)RA-HFLS 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖9、10 所示。與對(duì)照組相比，痹祺膠囊高濃度和中濃度給藥組均能顯著促進(jìn)RA-HFLS 細(xì)胞的凋亡（P＜0.05、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤、丹參酮IIA、蛻皮甾酮、甘草次酸在低濃度和高濃度給藥時(shí)均能明顯促進(jìn)RA-HFLS 細(xì)胞的凋亡（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖9 不同濃度痹祺膠囊對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.9 Effects of Biqi Capsules at different concentrations on TNF-α-induced apoptosis of RA-HFLS cells (±s , n=3)

圖10 不同濃度單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.10 Effects of different concentrations of compounds on TNF-α-induced apoptosis of RA-HFLS cells (±s , n=3)

3.3.3 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞MMP-3、RANKL基因表達(dá)的影響 痹祺膠囊及9 個(gè)單體化合物對(duì)MMP-3和RANKL基因表達(dá)的影響結(jié)果如圖11、12 所示。與空白組相比，TNF-α 作用于RAHFLS 細(xì)胞后MMP-3和RANKL基因的表達(dá)量顯著升高（P＜0.001）。與模型組相比，痹祺膠囊高、中、低濃度組MMP-3基因的表達(dá)量均顯著減少（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)關(guān)系；痹祺膠囊高、中濃度也同樣能顯著抑制RANKL基因的表達(dá)（P＜0.001），抑制活性隨濃度的增大而升高。與模型組相比，馬錢子堿、士的寧、丹參素、阿魏酸、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和甘草次酸在高、低濃度給藥時(shí)均能顯著抑制MMP-3基因的表達(dá)（P＜0.05、0.01、0.001），丹參酮IIA和藁本內(nèi)酯在高濃度給藥時(shí)顯著抑制MMP-3基因的表達(dá)（P＜0.001）；馬錢子堿、丹參素、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、次黃嘌呤和甘草次酸在高、低濃度給藥后均能顯著抑制RANKL基因的表達(dá)（P＜0.05、0.01、0.001），士的寧、丹參酮IIA和蛻皮甾酮高濃度給藥時(shí)對(duì)RANKL基因表達(dá)的抑制效果顯著（P＜0.001）。

圖11 痹祺膠囊對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞MMP-3、RANKL 基因表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.11 Effects of Biqi Capsules on TNF-α-induced expression of MMP-3 and RANKL in RA-HFLS cells (±s , n=3)

圖12 單體化合物對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞MMP-3、RANKL 基因表達(dá)的影響 (±s , n=3)Fig.12 Effects of compounds on TNF-α-induced expression of MMP-3 and RANKL in RA-HFLS cells (±s , n=3)

4 討論

RA 是一種由自身免疫功能障礙引起的疾病，具體以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹?，常伴有其他臟器功能受損的慢性炎癥疾病。RA 患者的主要癥狀是滑膜增生、關(guān)節(jié)窩炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)破壞、嚴(yán)重者功能喪失等，其特征是手、腕及對(duì)稱足關(guān)節(jié)炎癥[14]。目前RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但多數(shù)研究認(rèn)為T 淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子如TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 等引起骨關(guān)節(jié)破壞是RA 發(fā)病的主要機(jī)制[15-16]。除了T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞外，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblastlikesynoviocytes，F(xiàn)LS）是RA 中引起滑膜炎癥病變及關(guān)節(jié)破壞的主要效應(yīng)細(xì)胞[17]，炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的大量TNF-α 在RA 患者滑液、血清、關(guān)節(jié)滑膜等組織中表達(dá)異常升高，且一定濃度的TNF-α 能刺激FLS 大量增殖并分泌炎性細(xì)胞因子（IL-6、TNFα 等）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、趨化因子、MMPs 等，進(jìn)一步導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)、滑膜細(xì)胞增殖與凋亡平衡失調(diào)、血管翳生成、軟骨破壞及骨侵蝕[18]。FLS 的過(guò)度增殖使其通過(guò)類腫瘤細(xì)胞樣方式侵蝕組織，是RA 滑膜炎及最終導(dǎo)致骨破壞的重要機(jī)制[19-20]。關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞是關(guān)節(jié)畸形的重要因素，而破骨細(xì)胞是引起骨破壞的關(guān)鍵細(xì)胞之一，破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一負(fù)責(zé)吸收骨質(zhì)的巨大多核細(xì)胞，其起源于骨髄單核-巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，由單核前體細(xì)胞通過(guò)多種方式融合而形成[21]，受M-CSF 和RANKL 2 個(gè)細(xì)胞因子調(diào)控。M-CSF 結(jié)合其受體巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體（macrophage-stimulating factor receptor，c-Fms），在加快破骨細(xì)胞分化中具有重要的生物學(xué)功能[22]。RANKL 結(jié)合破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或者破骨細(xì)胞的膜蛋白R(shí)ANK，可激活一系列下游信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[23-24]。另外，滑膜大量的炎癥因子，如TNF-α 可促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和提高活性，最終使骨重建的天平失衡，介導(dǎo)骨破壞。因此，抑制破骨細(xì)胞的生成和功能，有助于改善RA 的病程發(fā)展[25]。

本研究利用LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞作為炎癥模型，對(duì)痹祺膠囊及19 個(gè)關(guān)鍵化學(xué)成分的抗炎活性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、白術(shù)內(nèi)酯III、茯苓酸、丹參素、丹參酮IIA、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、牛膝皂苷D、次黃嘌呤、甘草次酸、甘草苷19 個(gè)成分均表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，均能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NO、TNF-α、IL-6 的釋放，因此推測(cè)，該19 個(gè)單體成分可能為痹祺膠囊發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)一步通過(guò)體外小鼠單核巨噬細(xì)胞 RAW264.7 與 M-CSF 和RANKL 因子共培養(yǎng)，建立體外破骨細(xì)胞分化模型，探究痹祺膠囊及19 個(gè)單體化合物對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用，TRAP 染色結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、黨參炔苷、茯苓酸、丹參素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、藁本內(nèi)酯、甘草次酸和甘草苷13 個(gè)化合物均能顯著抑制破骨細(xì)胞的分化，其作用可能是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞發(fā)揮骨吸收作用的關(guān)鍵靶標(biāo)酶CTSK和TRAPmRNA 的相對(duì)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[26-27]，因此推測(cè)該13 個(gè)單體成分是痹祺膠囊抑制破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)建立TNF-α 誘導(dǎo)的RA-HFLS 細(xì)胞增殖模型檢測(cè)痹祺膠囊及19個(gè)單體化合物對(duì)RA-HFLS 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明痹祺膠囊及馬錢子堿、士的寧、丹參素、丹參酮IIA、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、蛻皮甾酮、次黃嘌呤和甘草次酸9 個(gè)化合物對(duì)RA-HFLS 細(xì)胞的增殖均有顯著的抑制作用，進(jìn)一步流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明痹祺膠囊和9 個(gè)化合物均能不同程度促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且均能顯著抑制RA-HFLS 細(xì)胞中參與骨破壞相關(guān)因子MMP-3和RANKL基因的表達(dá)[28-29]，因此推測(cè)該9 個(gè)化合物是痹祺膠囊中發(fā)揮抑制滑膜增生作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突