淺藍(lán)霉素H產(chǎn)生菌CRM05的發(fā)酵條件優(yōu)化及其抗菌活性研究

高諭康?劉培培?李燕楠?邱培菊?朱偉明

摘要：目的 優(yōu)化海洋來源的藍(lán)灰異壁放線菌OUCMDZ-413突變株CRM05的發(fā)酵條件，提高淺藍(lán)霉素H的發(fā)酵產(chǎn)量并測定其對海洋環(huán)境病原細(xì)菌的抑菌活性。方法 探索培養(yǎng)基組成、接種量、種齡、發(fā)酵天數(shù)、鹽度、pH、碳源、氮源、前體以及大孔吸附樹脂添加量，再采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)發(fā)酵條件。結(jié)果 優(yōu)化后淺藍(lán)霉素H的最佳發(fā)酵條件為：搖瓶發(fā)酵11 d（28℃、180 r/min）、裝液量150/500 mL（體積分?jǐn)?shù)）、優(yōu)化培養(yǎng)基（20 g可溶性淀粉、10 g 蛋白胨、10 g 酵母浸膏、4 g NaCl、4 g CaCO3、0.1 g 2-吡啶甲酸、40 g XAD-16大孔吸附樹脂、1 L 陳海水、滅菌前用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 6.5）、2%接種量、5 d 種齡（即菌落的A600 2.72）。結(jié)論 以優(yōu)化條件發(fā)酵菌株CRM05，淺藍(lán)霉素H的分離產(chǎn)量達(dá)到434 mg/L，是優(yōu)化前液體發(fā)酵產(chǎn)量的10倍和優(yōu)化后固體發(fā)酵產(chǎn)量的1.6倍。淺藍(lán)霉素H可顯著抑制3種海洋弧菌—溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌，其最小抑菌濃度分別為8、16和16 μg/mL，活性強(qiáng)于環(huán)丙沙星（相應(yīng)的最小抑菌濃度分別為64、64和32 μg/mL）。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵優(yōu)化；淺藍(lán)霉素H；抑菌活性；海洋環(huán)境病原細(xì)菌；突變株CRM05

中圖分類號(hào)：R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Fermentation optimization for the caerulomycin H-producing strain CRM05 and the antibacterial activity of caerulomycin H

Gao Yukang， Liu Peipei， Li Yan nan， Qiu Peiju， and Zhu Weiming

（ Key Laboratory of Marine Drugs， Ministry Education of China， School of Medicine and Pharmacy，

Ocean University of China， Qingdao 266003）

Abstract Objective To optimize the fermentation conditions for the caerulomycin H-producing strain CRM05 mutant from the marine-derived Actinoalloteichus cyanogriseus OUCMDZ-413 that we previously numbered as WH1-2216-6， and then assay the antibacterial activity against the pathogenic bacteria in the marine environment. Methods The optimal composition of the culture medium， inoculum size， inoculum age， cultivation time， salinity， pH， carbon sources， nitrogen sources， precursor， and additive amount of XAD-16 macroreticular resin were investigated by means of the single factor experiment， and the orthogonal experiment. Results The highest production of caerulomycin H was obtained through the liquid fermentation at 28℃ and shaking 11 d（180 r/min） in a 500 mL conical flask containing 150 mL of an optimized medium and 2% inoculation volume with 5d-old strain CRM05（A600 2.72）. The optimized medium was prepared by dissolving soluble starch 20 g， peptone 10 g， yeast extract 10 g， NaCl 4 g， CaCO3 4 g， and 2-pyridinic acid 0.1 g in 1 L of natural seawater with pH 6.5 （adjusted by 1 mol/L HCl）， and then adding 40 g of XAD-16 resin. Conclusion? ? The isolation yield of caerulomycin H reached 434 mg/L after optimization， which is respectively 10- and 1.6-folds increase in the yields of the previous unoptimized liquid fermentation and the optimized solid fermentation. In addition， caerulomycin H showed stronger inhibitory activity than ciprofloxacin（a positive control） against three marine vibrio strains， Vibrio alginolyticus， V. vulnificus and V. parahaemolyticus with the minimum inhibition concentrations of 8， 16 and 16 μg/mL for caerulomycin H and 64， 64 and 32 μg/mL for ciprofloxacin， respectively.

Key words Fermentation optimization; Caerulomycin H; Antibacterial activity; Marine pathogenic bacteria; Mutant strain CRM05

特殊環(huán)境微生物比如耐酸和海洋微生物由于其處于酸性環(huán)境[1]或含鹽環(huán)境中[2]，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的、多樣化的次級(jí)代謝產(chǎn)物即天然產(chǎn)物[3]，由此成為藥物先導(dǎo)化合物的重要來源[4]，特別是海洋放線菌[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1976–2022年間分別報(bào)道了313個(gè)抗菌活性[6]和254個(gè)腫瘤細(xì)胞毒活性[7]的海洋放線菌新天然產(chǎn)物。淺藍(lán)霉素類化合物（caerulomycins）是來源于放線菌的一類具有2，2'-聯(lián)吡啶母核的生物堿，具有成為抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物乃至候選新藥的潛力[8]，其中最早發(fā)現(xiàn)并鑒定結(jié)構(gòu)的是caerulomycin A[9]。前期從海洋來源的藍(lán)灰異壁放線菌（Actinoalloteichus cyanogriseus） 菌株OUCMDZ-413的發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了包括caerulomycins A和H在內(nèi)的系列淺藍(lán)霉素類化合物，其中caerulomycin H對急性白血病細(xì)胞株HL-60表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖抑制活性（IC50為1.6 μmol/L）[10-11]，且為caerulomycin A的生物合成前體[12-13]。為了獲得充足的caerulomycin H來進(jìn)行成藥性研究，通過基因敲除滅活OUCMDZ-413的O-甲基轉(zhuǎn)移酶CrmM、構(gòu)建了突變株CRM05，將生物合成阻斷在caerulomycin H[14]；然后初步優(yōu)化了caerulomycin H的發(fā)酵條件，使其固體發(fā)酵的產(chǎn)量達(dá)到272 mg/kg[15]，仍有優(yōu)化的空間。鑒于淺藍(lán)霉素類化合物的抗菌活性鮮有報(bào)道，而菌株OUCMDZ-413來自海洋，本文進(jìn)一步優(yōu)化了突變株CRM05生產(chǎn)caerulomycin H的發(fā)酵條件，并測試了caerulomycin H對8種海洋環(huán)境病原細(xì)菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

CRM05為藍(lán)灰異壁放線菌Actinoalloteichus cyanogriseus OUCMDZ-413（即WH1-2216-6） 的O-甲基轉(zhuǎn)移酶CrmM缺失的突變株[13]，8種海洋環(huán)境病原細(xì)菌：遲緩愛德華菌Edwardsiella tarda ATCC15947、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus ATCC14579、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC17802、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus ATCC27562、溶藻弧菌Vibrio alginolyticus ATCC33787、鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii ATCC19606、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes ATCC13048、蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis ATCC10792，保藏于本實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱內(nèi)。

1.1.2 儀器與試劑

天平（ME204，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超聲儀（VC750，Sonics公司）；超凈工作臺(tái)（MCV-131 BNF（T）型，sanyo公司）；恒溫?fù)u床（ZHWY211B，上海智誠分析儀器制造有限公司）；潔凈工作臺(tái)（Air Tech，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；便攜式pH計(jì)（FiveGo2，梅特勒-托利多儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（LDZX-75KBS，上海愛寶醫(yī)療器械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100型，EYELA公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；冷凍干燥機(jī)（EZ-DRY型，美國FTS公司）；分析用高效液相色譜儀（島津公司，Shimadzu LC-6AD型號(hào)， SPD-M10Avp檢測器，YMC-pack ODS-A C18柱：4.6 mm×250 mm， 5 μm， 12 nm， 1 mL/min）；液-質(zhì)聯(lián)用儀（Wasters公司，Q-TOF Ultima Global GAA076 LC型）；三用紫外儀（ZF-6型，上海嘉鵬科技有限公司）；紫外光譜儀（DU640型，美國Beckman公司）；紅外光譜儀（Nicolet NEXUS 470型，美國Nicolet公司）；酶標(biāo)儀（SpectraMax plus型，美國Molecular公司）；柱色譜與薄層色譜硅膠（200-300目，青島海洋化工集團(tuán)）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；XAD-16大孔吸附樹脂（美國AMBERLITE公司）；高效薄層色譜板（GF 254，青島海洋化工廠）。

發(fā)酵所用的可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、豆粉、天冬氨酸、丙酸鈉以及各類無機(jī)鹽購自國藥集團(tuán)；蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浸膏購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；瓊脂購自Solarbio公司；2-吡啶甲酸購自麥克林公司；液相色譜以及液質(zhì)聯(lián)用甲醇和乙腈均為色譜純；常規(guī)提取分離用二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、冰醋酸、三乙胺均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

除非特別指明，所有培養(yǎng)基均用1 L陳海水（即放置7 d的天然海水）配制，固體平板培養(yǎng)基系在相應(yīng)液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上、加20 g瓊脂倒板而成。

（1）平板培養(yǎng)基（突變株CRM05的傳代、培養(yǎng)以及暫時(shí)保藏）

平板培養(yǎng)基的組成（g/L）：可溶性淀粉 20、甘油 20、蛋白胨20、KNO3 1、CaCO3 2、瓊脂 20（pH 7.5）。

（2）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（突變株CRM05的發(fā)酵培養(yǎng)）

高氏Ⅰ號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 20、KNO3 1、K2HPO4·3H2O 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.5（pH 7.5）。

A1（g/L）：可溶性淀粉 10、酵母浸膏 4、蛋白胨 2、KBr 0.1、Fe2（SO4）3·4H2O 0.04（pH 7.5）。

放線菌1號(hào)（g/L）：淀粉 10、葡萄糖 20、牛肉浸膏 1、蛋白胨 20、酵母浸膏 4、豆粉 5、K2HPO4·3H2O 0.5、CaCO3 2（pH 7.0）。

放線菌2號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 10、葡萄糖 20、牛肉浸膏 3、蛋白胨 10、酵母浸膏 10、CaCO3 2、KH2PO4 0.5、MgSO4 0.5（pH 7.5）。

放線菌3號(hào)（g/L）：玉米浸膏 5、酵母浸膏 2、豆粉 5、（NH4）2SO4 2、可溶性淀粉 15、CaCO3 2（pH 8.0）。

放線菌4號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 15、豆粉 5、甘油 15、蛋白胨 15、CaCO3 2（pH 7.5）。

放線菌5號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 20、豆粉 15、酵母浸膏 5、蛋白胨 2、NaCl 4、CaCO3 4（pH 7.5）。

M3（g/L）：胰蛋白胨 2、天冬氨酸 0.1、甘油 5、丙酸鈉 4、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO4·3H2O 0.5、MgSO4·7H2O 0.1（pH 7.0）。

自制1號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 20、蛋白胨 20、甘油 20、KNO3 1、CaCO3 2（pH 7.5），用于制作菌株CRM05種子液。

自制2號(hào)（g/L）：可溶性淀粉 20、蛋白胨 10、酵母浸膏 10、NaCl 4、CaCO3 4、2-吡啶甲酸 0.1、XAD-16大孔吸附樹脂 40（pH 6.5）。

（3）病原菌培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10、酵母浸膏 5（用于培養(yǎng)遲緩愛德華菌、蠟狀芽胞桿菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌）。

LB培養(yǎng)基（g/L，自來水配制）：胰蛋白胨 10、NaCl 5、酵母浸膏 5（用于培養(yǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、蘇云金芽胞桿菌）。

1.2 方法

1.2.1 菌株CRM05的發(fā)酵

將保藏于-80℃冰箱的菌株CRM05接種到自制1#培養(yǎng)基瓊脂平板上，放置28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)

6 d。經(jīng)傳代后挑取平板上的放線菌孢子接種到自制1#液體培養(yǎng)基中（150/500 mL三角瓶），于恒溫?fù)u床（28℃、180 r/min）培養(yǎng)4 d，得到種子液。取種子液以2%的添加量接種到不同發(fā)酵條件的液體培養(yǎng)基中（150/500 mL三角瓶），于恒溫?fù)u床（28℃、180 r/min）培養(yǎng)10 d得到發(fā)酵液。

1.2.2 菌株CRM05次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取

將菌株CRM05的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相并減壓濃縮至干；若為添加了大孔吸附樹脂的發(fā)酵液則先用紗布和濾網(wǎng)過濾出樹脂，再使用等發(fā)酵液體積的丙酮沖洗大孔吸附樹脂3次，合并有機(jī)相并減壓濃縮至干。得到菌株CRM05在不同發(fā)酵條件下的粗提物，用于后續(xù)LC-MS定量分析。

1.2.3 Caerulomycin H的分離與提純

將粗體物經(jīng)正相減壓硅膠柱色譜分離，以體積比為1：0、100：1、50：1、30：1、20：1、10：1、5：1、1：1、0：1的二氯甲烷-甲醇進(jìn)行梯度洗脫，將其中體積比為20：1、10：1和5：1的洗脫液合并，再經(jīng)LH-20凝膠柱色譜分離（甲醇洗脫）得到高純度caerulomycin H [10]。

1.2.4 Caerulomycin H的定量檢測

Caerulomycin H的純度檢測：Caerulomycin H的純度經(jīng)薄層色譜TLC檢測，其在展開劑（10：1：0.1二氯甲烷-甲醇-冰醋酸， V/V）、3種顯色方法（254 nm UV、香草醛-濃硫酸、碘顯色）下均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)。然后通過LC-MS驗(yàn)純，即通過面積歸一法，選取5個(gè)不同的波長（λmax 210、242、256、280、302 nm）測定，記錄色譜圖的時(shí)間寬度為caerulomycin H出峰時(shí)間的2倍以上。結(jié)果顯示，在選取的5個(gè)不同波長下，caerulomycin H的純度均大于98%，符合標(biāo)準(zhǔn)品的純度要求[16-17]。

Caerulomycin H的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以上述純度大于98%的caerulomycin H為標(biāo)準(zhǔn)品，將其依次配成濃度為1、0.75、0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.005 mg/mL的甲醇（MeOH）溶液，然后進(jìn)樣（1 μL）作LC-MS分析（流動(dòng)相：9% MeCN/H2O + 0.1% HCO2H，流速：0.4 mL/min，檢測波長：λmax 242 nm），再通過面積歸一法檢測不同濃度的caerulomycin H對應(yīng)的峰面積，繪制caerulomycin H的濃度（縱坐標(biāo)）-峰面積（橫坐標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化及粗提物提取

按照“1.2.1”和“1.2.2”中的方法得到不同發(fā)酵條件的粗提物，將其配成濃度為2 mg/mL的甲醇溶液，進(jìn)樣1 μL作LC-MS，檢測λmax 242 nm下峰面積、通過圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析其中caerulomycin H的產(chǎn)量。在此基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，探究基礎(chǔ)培養(yǎng)基、接種量、發(fā)酵時(shí)間、種齡、鹽度、pH、碳源、氮源、前體添加濃度和XAD-16大孔吸附樹脂添加量對caerulomycin H產(chǎn)量的影響，以此獲得caerulomycin H的最佳發(fā)酵條件。

1.2.6 抑菌活性測試

菌懸液制備：將遲緩愛德華菌、蠟狀芽胞桿菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌接種于2216E培養(yǎng)基中，鮑曼不動(dòng)桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、蘇云金芽胞桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，裝液量均為30/100 mL，置于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h、以菌液渾濁作為培養(yǎng)終點(diǎn)，然后用對應(yīng)的無菌培養(yǎng)基（即0.22 μm無菌濾膜過濾后的空白培養(yǎng)基）稀釋1000倍備用。

測試液制備：用細(xì)胞級(jí)的二甲基亞砜（DMSO）將caerulomycin H和陽性藥（環(huán)丙沙星）配成濃度為1.28 mg/mL的原液，備用。

最小抑菌濃度（MIC）測定：采用微量稀釋法、在96孔板中測定caerulomycin H和環(huán)丙沙星的MIC[18]。實(shí)驗(yàn)分為空白組（僅加入空白培養(yǎng)基）、陰性組（稀釋的菌懸液和細(xì)胞級(jí)的DMSO）、藥物組包括陽性藥組（稀釋的致病菌液和不同濃度的環(huán)丙沙星）和化合物組（稀釋的致病菌液和不同濃度的caerulomycin H），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。藥物組中每孔加入10 μL caerulomycin H或環(huán)丙沙星原液、90 μL對應(yīng)空白培養(yǎng)基和100 μL稀釋菌液，即每孔藥物濃度為64 μg/mL（初篩）；然后采用二倍梯度稀釋法測定MIC，用對應(yīng)的空白培養(yǎng)基依次將藥物終濃度稀釋為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。加藥結(jié)束后，將96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h觀察每孔中液體的濁度，菌液由渾濁變澄清的第一個(gè)梯度即為藥物的MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Caerulomycin H標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“1.2.4”中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，分別以caerulomycin H的濃度和對應(yīng)的峰面積為縱、橫坐標(biāo)，繪制了caerulomycin H的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。結(jié)果表明caerulomycin H的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0219x+ 0.0013、r2=0.9999（x為峰面積、y為濃度），曲線的線性關(guān)系良好，可用于caerulomycin H含量的測定[17，19]。

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

不同培養(yǎng)基的成分影響微生物對于營養(yǎng)的利用，從而影響微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。將5 d種齡的CRM05種子液以2%的接種量分別接種到裝有150 mL放線菌1～5號(hào)、M3、A1和高氏1號(hào)（G1）液體培養(yǎng)基的500 mL三角燒瓶（搖瓶）中，放置于28℃、180 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。采用“1.2.2”的方法獲得含caerulomycin H的粗提物，LC-MS定量分析并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算caerulomycin H的產(chǎn)量。結(jié)果表明：在8種培養(yǎng)基中，放線菌5號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最大（圖2）。因此以放線菌5號(hào)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行下一步的發(fā)酵優(yōu)化。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)確定接種量、發(fā)酵時(shí)間、種齡、鹽度和初始pH值

2.3.1? ? ?接種量的確定

接種量對菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物有一定影響。為了確定最佳接種量，分別向裝有150 mL放線菌5號(hào)培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中接入體積比為1%、2%、3%、4%、5%、6%的種子液（種齡4 d），每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，其他條件不變。定量分析表明（同“2.2”）：當(dāng)接種量為2%時(shí)，caerulomycin H的產(chǎn)量最大（圖3左）。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間會(huì)影響菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)量。為了確定caerulomycin H的最佳發(fā)酵時(shí)間，在其他條件不變的情況下，搖床發(fā)酵培養(yǎng)CRM05菌株7、8、9、10、11和12 d，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。結(jié)果表明：發(fā)酵7 d和8 d時(shí)菌落數(shù)較少、生長狀態(tài)不佳，發(fā)酵9～12 d時(shí)菌株生長狀態(tài)較好、且無明顯區(qū)別，但發(fā)酵11 d的caerulomycin H產(chǎn)量最大（圖3右）。

2.3.3? ? 種齡的確定

種子液的活力與種齡直接相關(guān)。接入的種子液活力旺盛則可以縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵效率。在探究種齡對caerulomycin H產(chǎn)量的影響時(shí)，首先繪制不同種齡的種子液的生長曲線，結(jié)果表明：菌株CRM05在4～9 d進(jìn)入穩(wěn)定期，可用作種子（圖4左）。分別接種種齡為4、5、6和7 d的種子液，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行、其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明：種齡為5 d時(shí)，caerulomycin H的產(chǎn)量最大（圖4右）。

2.3.4鹽度的確定

鹽度對于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物也有重要影響，尤其是對于生存在高鹽環(huán)境中的海洋微生物。配制放線菌5號(hào)培養(yǎng)基時(shí)將鹽度分別調(diào)成0.4%（自來水配制，5#培養(yǎng)基成分中含0.4% NaCl）、2.4%（陳海水加自來水稀釋）、3.7%（陳海水）、4.4%、6.4%和8.4%，后3個(gè)鹽度是在陳海水的基礎(chǔ)上添加NaCl配制；其他條件不變。定量分析操作同“2.2”，結(jié)果表明：鹽度為6.4%和8.4%時(shí)菌株生長狀態(tài)很差，鹽度為3.7%即陳海水配制時(shí)，caerulomycin H的產(chǎn)量最大（圖5左）。

2.3.5 初始pH值的確定

酸堿度對菌株的正常生長及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生十分重要，合適的pH可能會(huì)增加產(chǎn)物的產(chǎn)量。滅菌前用濃度為1 mol/L的HCl和NaOH將放線菌5號(hào)培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為4.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0，其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明：當(dāng)初始pH為4.0時(shí)，菌株無法正常生長；初始pH為6.5時(shí)，caerulomycin H的產(chǎn)量最大（圖5右）。

2.4 確定最佳碳、氮源及其配比

2.4.1 單因素剔除實(shí)驗(yàn)

微生物對不同碳、氮源的回收利用有所不同，不同碳、氮源也會(huì)影響微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。為了探究不同的碳、氮源對caerulomycin H產(chǎn)量的影響，首先設(shè)計(jì)了單因素剔除實(shí)驗(yàn)。分別配制逐一剔除其中單個(gè)碳源（可溶性淀粉）、氮源（豆粉、蛋白胨、酵母浸膏）和無機(jī)鹽（NaCl和CaCO3）的放線菌5號(hào)培養(yǎng)基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明：碳源中可溶性淀粉的影響最大，氮源中酵母浸膏的影響最大，單因素剔除無機(jī)鹽對caerulomycin H產(chǎn)量的影響較?。▓D6）。

2.4.2 不同碳源對caerulomycin H產(chǎn)量的影響

分別以相同質(zhì)量的甘油、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖和蔗糖替代可溶性淀粉配制培養(yǎng)基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明：仍然是可溶性淀粉作為碳源時(shí)caerulomycin H的產(chǎn)量最大，甘油、麥芽糖和甘露糖次之；葡萄糖作為碳源時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最?。▓D7左）。

2.4.3 不同氮源對caerulomycin H產(chǎn)量的影響

分別以相同質(zhì)量的牛肉浸膏、蛋白胨、胰蛋白胨和味精替代酵母浸膏配制培養(yǎng)基，其他條件不變，定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明，酵母浸膏作為氮源時(shí)caerulomycin H的產(chǎn)量最大，蛋白胨次之，味精作為氮源時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最?。▓D7右）。

2.4.4 正交實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基中碳源、氮源的最佳配比

從上述單因素實(shí)驗(yàn)確定了培養(yǎng)基中最優(yōu)的碳、氮源依然是5#培養(yǎng)基中的原始成分，進(jìn)一步通過正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳配比[20]。將培養(yǎng)基中4種碳、氮源為研究對象，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（表1），配制相應(yīng)的培養(yǎng)基，按2.2方法培養(yǎng)菌株CRM05并計(jì)算caerulomycin H的產(chǎn)量。結(jié)果表明：按極差大小決定因素的影響順序，影響從大到小的順序依次為B（豆粉）、A（可溶性淀粉）、D（蛋白胨）、C（酵母浸膏）；確定最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即2%可溶性淀粉、1%酵母浸膏和1%蛋白胨（表2）。

綜上，最優(yōu)培養(yǎng)基組合為：20 g可溶性淀粉、10 g酵母浸膏、10 g蛋白胨、4 g NaCl、4 g CaCO3、1 L陳海水（滅菌前用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)初始pH 6.5）。

2.5 前體和大孔吸附樹脂添加量對caerulomycin H產(chǎn)量的影響

2.5.1 添加2-吡啶甲酸前體

添加適量前體利于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。2-吡啶甲酸是淺藍(lán)霉素類化合物的生物合成前體[12]，有必要探究添加不同量的2-吡啶甲酸對caerulomycin H產(chǎn)量的影響。為此，將濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mg/mL的2-吡啶甲酸加入到最優(yōu)培養(yǎng)基中，其他條件不變。定量分析操作同“2.2”。結(jié)果表明：當(dāng)2-吡啶甲酸的添加量≤0.4 mg/mL時(shí)，有利于提高caerulomycin H的產(chǎn)量，其中添加量為0.2 mg/mL時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最大（圖8左）。

2.5.2 添加XAD-16大孔吸附樹脂

大孔吸附樹脂是近年來使用較多的有機(jī)吸附劑[21]，

因大孔吸附樹脂成本低、可再生以及吸附性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)級(jí)的微生物發(fā)酵。為了探討XAD-16大孔吸附樹脂是否可以富集并提高caerulomycin H的產(chǎn)量，本文設(shè)計(jì)向上述優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、2%、4%、6%、8%和10%的XAD-16大孔吸附樹脂，其他條件不變。按照“1.2.2”的操作提取得到粗提物，再按照“2.2”方法定量分析。結(jié)果表明：大孔吸附樹脂的添加明顯提高caerulomycin H的產(chǎn)量，其中XAD-16添加量為2%時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最大（圖8右）。

2.5.3 確定XAD-16大孔樹脂和2-吡啶甲酸的最佳添加比

由于XAD-16樹脂和2-吡啶甲酸前體的添加對caerulomycin H產(chǎn)量有較大影響，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性與工作量，分別選取3個(gè)最佳條件通過全面交互實(shí)驗(yàn)來探究二者的最佳添加比。根據(jù)“2.5.1”和“2.5.2”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在“2.4”確定的最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，設(shè)定XAD-16樹脂的3個(gè)添加水平為2%、4%、6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），2-吡啶甲酸前體的3個(gè)添加水平為0.1、0.2、0.4 mg/mL，按照表3進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（其他發(fā)酵條件不變），并通過“2.2”方法測定caerulomycin H的產(chǎn)量。結(jié)果表明：在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下，XAD-16樹脂和2-吡啶甲酸前體的添加量分別為4%（即40 mg/mL）和0.1 mg/mL時(shí)caerulomycin H產(chǎn)量最大（圖9）。

2.6 最優(yōu)發(fā)酵條件驗(yàn)證

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)出菌株CRM05生產(chǎn)caerulomycin H的最優(yōu)發(fā)酵條件為：配制最佳培養(yǎng)基（20 g可溶性淀粉、10 g酵母浸膏、10 g蛋白胨、4 g NaCl、4 g CaCO3、0.1 g 2-吡啶甲酸、40 g XAD-16樹脂、1 L 陳海水、滅菌前1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 6.5），裝液量150/500 mL、接種量2%（種齡5 d）、置于28℃和180 r/min下?lián)u床發(fā)酵11 d；利用該條件共發(fā)酵8瓶（8×150 mL=1.2 L）。發(fā)酵完成后過濾除去發(fā)酵液，將吸附產(chǎn)物的XAD-16大孔吸附樹脂裝柱，以體積比為0、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、9：1、10：0的乙醇-水各500 mL依次洗脫。合并其中含caerulomycin H的3：7和4：6（V/V） 乙醇-水洗脫液（薄層色譜TLC檢測）、減壓濃縮除去乙醇后，水相用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并、濃縮乙酸乙酯后得到的固體，所得固體經(jīng)15 mL 乙酸乙酯和5 mL甲醇依次洗滌后、置于60 ℃下用甲醇重結(jié)晶，得到521.3 mg純度≥98%的caerulomycin H（即434.4 mg/L），是優(yōu)化前液體發(fā)酵產(chǎn)量（42.4 mg/L）[15]的10.2倍和優(yōu)化固體發(fā)酵產(chǎn)量（272 mg/kg） [15]的1.6倍。

2.7 Caerulomycin H的抑菌活性

初篩結(jié)果表明caerulomycin H在濃度為64 μg/mL時(shí)對8種致病菌均有抑菌活性，故采用微量肉湯稀釋法進(jìn)一步測定其對8種致病菌的最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明（表4），caerulomycin H對8種致病菌的MIC值為8～64 μg/mL；其中對溶藻弧菌（VA）、創(chuàng)傷弧菌（VV）和副溶血弧菌（VP）的抑菌活性強(qiáng)于陽性藥環(huán)丙沙星（ciprofloxacin），尤其是對溶藻弧菌的活性最顯著、MIC值為8 μg/mL（環(huán)丙沙星MIC為64 μg/mL），

值得深入研究。

3 結(jié)論

Caerulomycin H對人腫瘤細(xì)胞株HL-60和A549具有較好的細(xì)胞增殖抑制活性[10]，同時(shí)也是重要的合成中間體，因其結(jié)構(gòu)的4-位羥基可進(jìn)行糖基化等修飾得到糖苷等caerulomycin H的衍生物[15]。因此，本文通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)等方法探究了培養(yǎng)基組成等不同發(fā)酵條件對caerulomycin H產(chǎn)量的影響，獲得了caerulomycin H的最佳發(fā)酵條件。優(yōu)化后caerulomycin H的分離產(chǎn)量達(dá)到434 mg/L，比之前優(yōu)化的固體發(fā)酵產(chǎn)量[15]提高了60%、是優(yōu)化前液體發(fā)酵產(chǎn)量的10倍，為其后續(xù)結(jié)構(gòu)修飾與成藥性研究奠定了化合物基礎(chǔ)。鑒于淺藍(lán)霉素類化合物的抑菌活性鮮有報(bào)道，本文還首次發(fā)現(xiàn)caerulomycin H對3種海洋弧菌即溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus和副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus具有顯著的抑菌活性，可深入探究。

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