5種植物粗提物對(duì)稻瘟病菌的抑菌活性

張翠榮??+李明??+李榮玉??

摘要：以稻瘟病菌為供試靶標(biāo)，采用生長(zhǎng)速率和孢子萌發(fā)測(cè)定法，對(duì)魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟的乙醇粗提物進(jìn)行了抑菌活性測(cè)定。結(jié)果顯示，5種植物粗提液對(duì)稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時(shí)，馬尾松對(duì)該菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)抑制率最高，分別為62.23%和65.54%，其EC50為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL，其次是姜和夾竹桃，其中魚腥草和香樟的抑菌活性相對(duì)較弱。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌；乙醇粗提物；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S482.2+92；S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0162-02

21世紀(jì)全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)是更加注重農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，從天然植物中提取殺蟲殺菌活性物質(zhì)防治病蟲害，已成為研究熱點(diǎn)，并對(duì)現(xiàn)代農(nóng)藥研究具有重要意義。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約有1/2的人口以稻米作為主食，其中水稻稻瘟病是危害水稻的三大病害之一[1-2]，它是由水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌性病害[3]。目前稻瘟病主要依靠化學(xué)防治，雖然化學(xué)防治具有效果顯著、廣譜性強(qiáng)、易推廣等優(yōu)點(diǎn)，但在保障人類獲得豐厚農(nóng)產(chǎn)品的同時(shí)，也給環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的污染[4-5]。

植物源殺菌劑是從某些植物的葉、花、莖、根、果實(shí)等部位分離提取的具有殺菌作用的活性物，植物殺蟲殺菌資源豐富，對(duì)環(huán)境、植物本身以及害蟲天敵均無(wú)影響，也不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性，所以植物源殺菌劑成為目前農(nóng)藥研究開發(fā)的熱點(diǎn)。例如大蒜中的大蒜素、蠶豆中的蠶豆酮等均可有效地抑制或殺死某些病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育[6-10]。植物通過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化而產(chǎn)生種類繁多的活性次生代謝物是植物抵御病原菌的重要武器，這些類型多樣的次生代謝物為開發(fā)新農(nóng)藥提供了無(wú)限的研究資源。

國(guó)內(nèi)對(duì)于防治水稻稻瘟病的植物源藥劑的開發(fā)也有初步研究，有研究表明山蒼子植物中含有對(duì)水稻稻瘟病菌毒殺作用的物質(zhì)等。本研究探索5種植物（魚腥草、夾竹桃、馬尾松、姜和香樟）的乙醇粗提物對(duì)水稻稻瘟病的生物活性作用，以期為基于植物源藥劑防治水稻稻瘟病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試植物均采摘于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，植物名錄見(jiàn)表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物的預(yù)處理及粗提物的制備將5種植物洗凈置于陰涼處晾干，然后放在恒溫干燥箱中以60 ℃的溫度烘干，小心取出植物分別放入研缽中充分研磨，直至成細(xì)粉末狀，將獲得干粉稱質(zhì)量后置于密封瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆谩２捎贸暡ㄌ崛》ㄟM(jìn)行粗提物的制備，提取溶劑為無(wú)水乙醇。

分別稱取5種植物干粉各10 g置于250 mL錐形瓶中，按照料液比1 g ∶[KG-*3]20 mL加入無(wú)水乙醇中浸漬、振蕩、低溫靜置，真空抽濾、棄廢渣、減壓濃縮獲得浸膏狀植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解5種植物粗提物，適量添加0.1%的吐溫-80，分別制成濃度為10、20、40 mg/mL的供試溶液。將試驗(yàn)分5組進(jìn)行，分別為魚腥草、夾竹桃、馬尾松、生姜和香樟乙醇粗提物各濃度供試液，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2菌絲生長(zhǎng)抑菌活性的測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法，分別取上述5種已經(jīng)配制成系列濃度梯度的植物粗提物，加入到融化好的PDA培養(yǎng)基中，滅菌，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基平板。取供試的稻瘟病菌菌種，用直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，然后將菌餅移到上述含藥的培養(yǎng)基平板中央，以不加藥的平板培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，25 ℃全黑暗培養(yǎng)?！笆弊纸徊娣y(cè)定各處理的菌落直徑，并根據(jù)公式計(jì)算菌絲抑制生長(zhǎng)率及EC50值[11]。

抑制生長(zhǎng)率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

采用回歸分析法對(duì)5種植物乙醇粗提物各處理濃度的對(duì)數(shù)值（x）和菌絲生長(zhǎng)抑制率的概率值（y）進(jìn)行分析處理，計(jì)算出5種植物乙醇粗提物對(duì)供試菌株的EC50值。

1.2.3孢子萌發(fā)抑菌活性的測(cè)定采用米糠培養(yǎng)基產(chǎn)孢的方法，取培養(yǎng)好的菌絲塊，分多點(diǎn)接種到米糠培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿，將少許無(wú)菌水倒入培養(yǎng)皿中，用毛筆輕輕刷洗過(guò)后，再置于365 nm黑光燈下培養(yǎng)，48 h后，培養(yǎng)基表面即產(chǎn)生大量孢子，表現(xiàn)為1層青灰色的新鮮霉層，即為稻瘟病菌孢子。刷洗霉層，過(guò)濾、鏡檢，調(diào)配成所需濃度的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察，以不加藥劑的孢子懸浮液為對(duì)照，分別在處理的孢子懸浮液中加入不同濃度的不同藥劑，每個(gè)濃度處理設(shè)3個(gè)重復(fù)[12-15]。

將各處理的孢子懸浮液置于搖床中培養(yǎng)24 h后，鏡檢各處理的孢子萌發(fā)情況，記錄200個(gè)孢子中萌發(fā)的孢子數(shù)。孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%。計(jì)算抑制率，求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50值[16]。

2結(jié)果與分析

2.1植物乙醇粗提物對(duì)菌絲的抑制作用

由表2可知，5種植物乙醇粗提物對(duì)稻瘟病菌菌絲均有抑制作用，在測(cè)定的濃度下，隨著各粗取物處理濃度的升高，稻瘟病菌菌落增長(zhǎng)直徑遞減，抑制率升高，粗提物濃度與抑制率正相關(guān)。當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)，馬尾松粗提物對(duì)稻瘟病菌菌絲的抑制率為62.23%，姜粗提物抑制率也達(dá)到了5123%，其次是夾竹桃和香樟，在相同濃度下，魚腥草對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率最低。

2.2植物乙醇粗提物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

從表4可以看出，5種植物乙醇粗提物對(duì)稻瘟病菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中馬尾松對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最明顯，隨著濃度升高，抑制率逐漸上升，當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了42.56%；當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了65.64%。夾竹桃、姜和香樟的粗提物在濃度是 40 mg/mL 時(shí)，其抑制率均超過(guò)40%。其中魚腥草的孢子萌發(fā)率相對(duì)較

3討論

植物的抑菌殺菌作用是長(zhǎng)期與昆蟲和病原菌進(jìn)化產(chǎn)生的結(jié)果，主要依賴于植物的次生代謝產(chǎn)物[17-18]。該試驗(yàn)探究了5種植物乙醇粗提物對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明5種植物粗提液對(duì)稻瘟病菌均有抑制作用，在濃度為40 mg/mL時(shí)，馬尾松對(duì)該菌的菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制率最高，分別為62.23%和65.64%，抑制效果顯著優(yōu)于其他4種植物粗提物；當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，姜和夾竹桃對(duì)菌絲抑制率為44.17%和34.98%；其中魚腥草對(duì)該菌的抑制活性相對(duì)較弱。線性毒力方程結(jié)果分析，5種植物粗提物處理濃度與對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制率呈線性關(guān)系，其中馬尾松的EC50值為21.75 mg/mL和19.38 mg/mL。不同植物中存在不同的抗菌活性物質(zhì)，它們的作用機(jī)制存在差異[19]。

本試驗(yàn)只研究了5種植物的乙醇粗提物，其有效成分復(fù)雜，為了解對(duì)稻瘟病菌有生物活性的主要成分及相互間的作用效果，有必要對(duì)高活性物質(zhì)分離、純化、分析其活性及化學(xué)成分，且其具體抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Skamnioti P，Gurr S J. Against the grain：safeguarding rice from rice

[KG1*2/3]blast disease[J]. Trends in Biotechnology，2009，27（3）：141-150.

[2]廖乾生. 抗稻瘟病菌附著胞形成研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2002.

[3]徐敬友，吳翠萍，童蘊(yùn)慧. 江蘇水稻旱育秧“黃枯”病原鑒定及致病力研究[J]. 植物病理學(xué)學(xué)報(bào)，2001，31（3）：230-235.

[4]張清麗. 淺談黑龍江省水稻稻瘟病的發(fā)生與防治[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（3）：115-116.

[5]卜元卿，孔源，智勇，等. 化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染及其防控對(duì)策建議[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2014，16（2）：19-25.

[6]Durham S. Detectives search for antimicrobial-resistant organisms[J]. Agricultural Research，2005，53（3）：18.

[7]費(fèi)有春. 簡(jiǎn)明農(nóng)藥詞典[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1985.

[8]中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所. 中草藥有效成分提取與分離[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1983.

[9]馮俊濤，祝木金，于平儒，等. 西北地區(qū)植物源殺菌劑初步篩選[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30（6）：129-133.[ZK）]

[10]黃建等. 三種藥劑對(duì)煙草黑脛病防治效果研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：1681-1682.

[11][JP3]張偉，廖靜靜，朱貴李，等. 8種植物揮發(fā)物和浸提液對(duì)三七根腐病菌的抑制活性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（30）：197-201.

[12]楊玉萍，李艾蓮. 植物源殺菌劑研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2006，8（1）：49-53.

[13]鄭雯，張亞玲，辛惠普，等. 水稻稻瘟病菌孢子萌發(fā)的化學(xué)抑制[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，16（4）：13-15.

[14]雷志清，楊雪梅. 水稻稻瘟病菌的發(fā)生及防治[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（3）：56-58.

[15]張應(yīng)烙，尹彩萍，馮駿濤，等. 植物源殺菌劑的研究進(jìn)展[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，31（3）：402-409.

[16]趙善歡. 植物化學(xué)保護(hù)[M]. 3版. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[17]王法紅，曹陽(yáng)，駱焱平. 21種海南植物粗提物生物活性初步測(cè)定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，25（8）：1829-1832.

[18]閻鳳鳴. 化學(xué)生態(tài)學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003.

[19]鄧業(yè)成，畢秀蓮，楊林林，等. 紅樹植物苦郎樹提取物及其活性成分對(duì)植物病原真菌的抑菌活性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（10）：2010-2013.

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