響應(yīng)面法優(yōu)化具有抑菌活性的大麥乳酸菌發(fā)酵工藝

姚芳+肖香+董英

摘要：通過單因素試驗(yàn)探討了乳酸菌添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比、提取液對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵物抑菌效果的影響；并以大腸桿菌為指標(biāo)菌，進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌效果的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，大麥乳酸菌發(fā)酵液最佳抑菌效果出現(xiàn)在料液比1 ∶7（g ∶mL）、發(fā)酵溫度30.5 ℃、菌種添加量27.5 g/kg、發(fā)酵時(shí)間25.5 h。在此條件下，抑菌圈直徑為17.52 mm，與模型預(yù)測(cè)值17.56 mm基本一致。

關(guān)鍵詞：大麥；乳酸菌；抑菌活性；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)： TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0296-06

微生物污染導(dǎo)致的食品腐敗變質(zhì)，是食品貯藏保鮮過程中的關(guān)鍵問題。目前延長食品保藏期的主要方法是添加化學(xué)防腐劑或一些物理方法，如干燥、冷藏、熱處理等[1]。而物理的保藏方法強(qiáng)度過大會(huì)降低食品品質(zhì)，已知的化學(xué)防腐劑具有一定危害，因此生物防腐成為研究熱點(diǎn)。近年來，乳酸菌的生物轉(zhuǎn)化功能越來越受到人們關(guān)注，尤其是其代謝產(chǎn)物的抑菌功能[2-3]。

大麥?zhǔn)俏覈鴤鹘y(tǒng)的藥食兼用作物，產(chǎn)量位居世界糧食作物第4位，但我國大麥的主要用途是啤酒釀造和飼料工業(yè)，僅有10%左右的大麥用于食用，利用率十分低下[4]。已有研究表明，大麥含有β-葡聚糖、黃酮、多酚類化合物、大麥芽堿等多種活性成分，具有清除自由基、抗衰老、抑菌、降血糖、降血脂、抗癌等功能[4-6]。但是，目前有關(guān)大麥微生物轉(zhuǎn)化利用的研究較少，其活性功能尚不明確。大麥?zhǔn)侨樗峋l(fā)酵的良好基質(zhì)[7]，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后大麥中葉酸、γ-氨基丁酸、可溶性膳食纖維等營養(yǎng)活性成分含量顯著升高[8]；大麥中含有的多酚類物質(zhì)[9]經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，從而發(fā)酵產(chǎn)物的多酚明顯增加[10]。Funamoto等發(fā)現(xiàn)，大麥燒酒蒸餾后的殘留物具有抗腫瘤和免疫活性[11-12]；Baek等發(fā)現(xiàn)，用2株乳酸菌發(fā)酵大米粉制作的年糕，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)霉菌具有抑制作用[13]，Ross等認(rèn)為，乳酸菌發(fā)酵碳水化合物能夠產(chǎn)生豐富的有機(jī)酸類（如乳酸、乙酸、丙酸、苯甲酸、香草酸等），能夠抑制部分致病菌及腐敗菌的生長[14-15]。這些酸的抑菌效果是通過降低體系pH值、抑制菌體生長和代謝而實(shí)現(xiàn)的[16]。此外，乳酸菌抑菌蛋白及其衍生物的抑菌能力的研究也有不少報(bào)道[17-18]。然而，利用植物乳桿菌發(fā)酵大麥，研究其發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性，國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究以抑菌圈直徑為追蹤指標(biāo)，對(duì)影響大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的各因素進(jìn)行研究，采用響應(yīng)面法優(yōu)化具有抑菌活性的乳酸菌發(fā)酵大麥的最佳工藝，旨在提升大麥的生理活性功能，為大麥的高效利用和天然抑菌產(chǎn)品的開發(fā)開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麥：新鮮脫殼大麥，購自江蘇省鹽城市雙增農(nóng)化科技有限公司。

乳酸菌：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum Dy-1，CGMCC No.6016），由江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離貯藏。

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、青霉菌（Penicillium expansum），均為江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：1.0%牛肉膏、0.5%酵母膏、1.0% 蛋白胨、2.0%葡萄糖、0.5%乙酸鈉、0.2%檸檬酸銨、0.2% K2HPO4、0.058% MgSO4·7H2O、0.025% MnSO4·H2O、0.1%吐溫80、1 L蒸餾水，pH值6.2～6.4，瓊脂1.5%，115 ℃滅菌 25 min，用于培養(yǎng)乳酸菌。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：0.3%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5% NaCl、1.5%瓊脂、1 L水，pH值7.0～7.2，115 ℃滅菌25 min，用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%（去皮切塊后煮沸30 min，取濾液），葡萄糖2.0%，瓊脂1.5%，蒸餾水定容至1 L，115 ℃滅菌25 min，用于培養(yǎng)霉菌。

牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、瓊脂為生化試劑，其他為分析純，均購自中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑有限公司，馬鈴薯購自市場(chǎng)。

1.3 試驗(yàn)儀器

高速萬能粉碎機(jī)，天津市華鑫儀器廠；SPX-250S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，吳江市亞泰凈化設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；PRIMOR型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；BS-IE型振蕩培養(yǎng)箱；上海一恒科技有限公司；AUTOCLAVE·G154DWS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申勝生物技術(shù)有限公司；AL204型電子天平，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；EL3002型電子天平，上海申勝生物技術(shù)有限公司；0～150 mm游標(biāo)卡尺，無錫錫工量具有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 大麥乳酸菌發(fā)酵物的制備

將新鮮的大麥脫殼磨粉過篩，按料液比1 ∶7（g ∶mL）混合均勻，添加2%的乳酸菌凍干粉，攪拌均勻，30 ℃發(fā)酵1 d，8 000 r/min離心 20 min，收集上清液，冷凍干燥后，即為大麥乳酸菌發(fā)酵物。

1.4.2 樣品抑菌液的制備

將大麥乳酸菌發(fā)酵物凍干粉用蒸餾水配制成50 mg/mL的溶液，在超凈臺(tái)中過0.22 μm的膜，即得樣品抑菌液。

1.4.3 供試菌懸液的制備

無菌條件下，用劃線法將供試菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌）分別接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基置36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，將青霉菌用PDA培養(yǎng)基置 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，用接種環(huán)挑取適宜的菌落，用無菌生理鹽水梯度稀釋，獲得1×105～1×106 CUF/mL的菌懸液。

1.4.4 抑菌效果的測(cè)定

采用打孔法[19]測(cè)定抑菌效果，具體方法：在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中倒入滅菌后的培養(yǎng)基，凝固后加入200 μL相應(yīng)的供試菌懸液，涂布均勻，用直徑6 mm的打孔器在涂布好菌液的平板上打4個(gè)分布均勻的小孔，對(duì)3個(gè)孔中加入100 μL的樣品抑菌液，對(duì)另1個(gè)孔加空白對(duì)照液。將細(xì)菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，將真菌于28 ℃恒溫培養(yǎng) 2 d，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈2個(gè)垂直方向的直徑，取其平均值為測(cè)定結(jié)果，抑菌圈直徑越大說明抑菌效果越好。每項(xiàng)抑菌試驗(yàn)重復(fù)3次。以上操作均在無菌超凈臺(tái)上完成。

1.4.5 單因素試驗(yàn)

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，研究提取溶劑、料液比、菌種添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用Design-Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，選取影響抑菌效果的4個(gè)主要因素（料液比、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加量、發(fā)酵溫度）進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，因素水平見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，利用F檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取劑的選擇

采用蒸餾水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等5種提取劑對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵物中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取，制成50 mg/mL的溶液，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，分別以相應(yīng)的提取劑為空白溶液，研究不同大麥乳酸菌發(fā)酵提取液的抑菌性能，扣除空白溶液抑菌圈后的結(jié)果見表2。

由表2可知，不同大麥乳酸菌發(fā)酵提取液對(duì)供試菌的抑菌效果順序?yàn)榇竽c桿菌>金黃色葡萄球菌>青霉菌，水提取液對(duì)3種供試菌的抑菌效果最好，且與其他溶劑提取液相比有顯著差異。說明水提取液中有效抑菌物質(zhì)較多，且水提取液能代表大麥乳酸菌發(fā)酵液中所有成分，因此后續(xù)試驗(yàn)直接用大麥乳酸菌發(fā)酵液為樣品。

2.1.2 料液比對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

設(shè)定20 g/kg的乳酸菌接種量，30 ℃發(fā)酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同料液比對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。由圖1可知，隨料液比增加，大麥乳酸菌發(fā)酵液對(duì)3種供試菌的抑菌活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，料液比為1 g ∶7 mL時(shí)對(duì)青霉菌的抑菌效果最好，在料液比為1 g ∶8 mL時(shí)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，這可能是因?yàn)楹可俨焕谌樗峋鷮?duì)大麥的充分發(fā)酵，含水量太多會(huì)導(dǎo)致大麥乳酸菌發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)的相對(duì)含量減少，從而減弱了抑菌效果。因此，選擇料液比 1 g ∶6 mL、1 g ∶7 mL、1 g ∶8 mL進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

設(shè)定料液比為1 g ∶7 mL，乳酸菌接種量為20 g/kg，30 ℃發(fā)酵，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，大麥乳酸菌發(fā)酵液對(duì)3種供試菌的抑菌活性呈先增強(qiáng)后緩慢減弱的趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間在20 h時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，在24 h時(shí)對(duì)大腸桿菌、青霉菌的抑菌效果最好，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間短時(shí)產(chǎn)生的抑菌活性成分少，發(fā)酵時(shí)間太長會(huì)導(dǎo)致一些抑菌活性成分又被代謝利用，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為20、24、28 h進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 菌種添加量對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

設(shè)定料液比為1 g ∶7 mL，30 ℃發(fā)酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同菌種添加量對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。由圖3可知，隨著乳酸菌接種量增加，大麥乳酸菌發(fā)酵液對(duì)3種供試菌的抑菌活性呈先增強(qiáng)后平緩的趨勢(shì)，在菌種添加量為20 g/kg時(shí)，對(duì)3種供試菌的抑菌活性達(dá)到較大；隨著接種量繼續(xù)增加，抑菌效果并未有明顯變化。乳酸菌接種量是影響大麥發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的關(guān)鍵因素，乳酸菌接種量小，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物少；乳酸菌接種量大時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物迅速積累，酸度也迅速上升，當(dāng)酸度上升至一定水平時(shí)，乳酸菌生長受到影響[20]，抑菌物質(zhì)的量也會(huì)趨于平穩(wěn)。因此，選擇乳酸菌接種量為10、20、30 g/kg進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.5 發(fā)酵溫度對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

設(shè)定料液比為1 g ∶7 mL，乳酸菌接種量為20 g/kg，發(fā)酵1 d，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌為供試菌，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度升高，大麥乳酸菌發(fā)酵液對(duì)3種供試菌的抑菌活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，對(duì)3種供試菌的抑菌活性達(dá)到最大；但發(fā)酵溫度為26～38 ℃時(shí)抑菌圈直徑變化不顯著，可能是因?yàn)槿樗峋诖藴囟确秶鷥?nèi)都能生長。溫度偏低時(shí)，乳酸菌生長緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長；溫度偏高時(shí)，會(huì)影響發(fā)酵過程中某些酶的活性，降低抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，選擇發(fā)酵溫度為26、30、34 ℃進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 大麥乳酸菌發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

大麥乳酸菌發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表3，回歸模型的方差分析見表4。

從表4可知，該模型的F值為102.85，P值小于0.000 1，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明二次回歸模型對(duì)抑菌圈直徑的影響高度顯著。試驗(yàn)中一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4和二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42對(duì)抑菌圈直徑的影響極顯著，說明各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，料液比、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加量、發(fā)酵溫度對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液的抑菌效果有極顯著影響。由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算出的模型相關(guān)系數(shù)R2值為0.990 4，說明模型有很好的精密度；模型校正決定系數(shù)R2Adj為0.980 7，說明該模型能解釋98.07%響應(yīng)值的變化，僅有總變異的1.93%不能用此模型來解釋，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)的擬合程度好，用該模型對(duì)具有抑菌活性的大麥乳酸菌發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是合適的。R2Pred為0.944 9，說明該模型預(yù)測(cè)性良好，能很好地預(yù)測(cè)影響大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌效果的各因素對(duì)抑菌圈直徑的影響。

2.2.2 響應(yīng)面因素間的交互作用分析

根據(jù)回歸模型，將任意2個(gè)因素固定在零水平， 可以得到體現(xiàn)另外2個(gè)因素及其交互作用影響的響應(yīng)面曲線圖及對(duì)應(yīng)的等高線圖（圖5）。

曲面圖的形狀可反映出單因素對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面越陡峭，影響越顯著，擬合的響應(yīng)面圖和等高線圖比較直觀地反映了各因素間的交互作用。由圖5可知，以對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，各因素對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液抑菌效果的影響順序?yàn)榫N添加量>發(fā)酵時(shí)間>料液比>發(fā)酵溫度，與表4中F值分析結(jié)果一致。菌種添加量、料液比、發(fā)酵溫度過高或過低和發(fā)酵時(shí)間過長或過短，都不能使大麥乳酸菌發(fā)酵液的抑菌效果達(dá)到最大，只有其取某個(gè)適中值時(shí)，才可使抑菌圈直徑達(dá)到最大值。沿菌種添加量軸線等高線相對(duì)密集，表明菌種添加量對(duì)抑菌效果的影響最大。圖5-a、圖5-d中等高線密度分布不均勻，呈橢圓形，說明發(fā)酵時(shí)間和料液比、發(fā)酵時(shí)間和菌種添加量的交互作用較強(qiáng)，影響較顯著。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的大麥乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert 8.05b軟件中的“Optimization”模塊分析得出優(yōu)化結(jié)果，即獲得較好抑菌效果的工藝參數(shù)為料液比1 g ∶7 mL，發(fā)酵時(shí)間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發(fā)酵溫度30.53 ℃，大麥乳酸菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑預(yù)測(cè)可達(dá)到17.56 mm?？紤]實(shí)際操作便利，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為料液比1 g ∶7 mL，發(fā)酵時(shí)間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發(fā)酵溫度30.5 ℃。采用修正后的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得抑菌圈直徑為17.52 mm，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)具有抑菌活性的大麥乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù)，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以大腸桿菌為指標(biāo)菌，以抑菌圈直徑為響應(yīng)指標(biāo)，通過四因素三水平的響應(yīng)分析對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了大麥乳酸菌發(fā)酵工藝的二次多項(xiàng)式回歸模型。經(jīng)方差分析和響應(yīng)面圖得知，各因素對(duì)抑菌效果影響的大小順序?yàn)榫N添加量>發(fā)酵時(shí)間>料液比>發(fā)酵溫度，料液比、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加量、發(fā)酵溫度對(duì)大麥乳酸菌發(fā)酵液的抑菌效果有極顯著影響。經(jīng)回歸分析并結(jié)合實(shí)際操作便利性，確定大麥乳酸菌發(fā)酵的最佳工藝為料液比1 g ∶7 mL，發(fā)酵時(shí)間25.5 h，菌種添加量27.5 g/kg，發(fā)酵溫度30.5 ℃。在此條件下，抑菌圈直徑為17.52 mm，與模型預(yù)測(cè)值17.56 mm基本一致，說明該模型可靠性較高，對(duì)乳酸菌發(fā)酵大麥的生產(chǎn)實(shí)踐有一定的指導(dǎo)意義。大麥乳酸菌發(fā)酵液可作為一種天然的抑菌產(chǎn)品添加到其他食品中，提升了大麥的使用價(jià)值。

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