一株植物內(nèi)生放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取及抑菌活性研究

李增政　林滕　常永芳　周琴　劉俊林

【摘 要】通過從蘭州百合中分離篩選得到的一株放線菌，且發(fā)現(xiàn)該菌株具有抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)通過發(fā)酵來生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物，利用萃取的方法來提取次級(jí)代謝產(chǎn)物。用不同溶劑來溶解粗提物以及用菌體進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。最后得到該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物且該產(chǎn)物對(duì)多種不同病原菌（如金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等）具有較強(qiáng)的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】放線菌；次級(jí)代謝產(chǎn)物；抑菌活性；發(fā)酵；生理生化

0 前言

放線菌（Actinomycetes）是一類具有分支狀菌絲體的高（G+C）mol%、革蘭氏陽性細(xì)菌。在系統(tǒng)分類學(xué)中，分類學(xué)家將它分到細(xì)菌界、放線菌門、放線菌綱、放線菌目、放線菌科，放線菌屬。目前已描述的放線菌至少有180個(gè)屬，包括鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、放線菌屬、小單孢菌屬、鏈孢囊菌屬、游動(dòng)放線菌屬等；其中研究最多的就是鏈霉菌屬，因?yàn)樵搶僦饕糜谏a(chǎn)抗生素，而且易于培養(yǎng)。因此，將除此屬以外的其他屬稱作稀有放線菌。從放線菌中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)至少有11000多種。前已發(fā)現(xiàn)的近萬種抗生素，如各種抗癌劑、酶抑制劑、抗寄生蟲劑、免疫抑制劑和農(nóng)用殺蟲劑等，約70%是由放線菌產(chǎn)生的，其中約三分之二的抗生素來源于陸生放線菌。放線菌與人們的生活息息相關(guān)，其代謝活性物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)實(shí)生活中，如鏈霉素、萬古霉素和阿奇霉素等被廣泛應(yīng)用于臨床治療，井岡霉素、慶豐霉素等成為農(nóng)用抗生素。此外，還可用于烴類發(fā)酵、石油脫蠟、淄體轉(zhuǎn)化、污水處理等。

次級(jí)代謝產(chǎn)物是指生物生長到一定階段后通過次級(jí)代謝合成的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同種類的生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物不相同，它們可能積累在細(xì)胞內(nèi)，也可能排到外環(huán)境中。由于次級(jí)代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此具有很大研究價(jià)值。

微生物在穩(wěn)定期活菌數(shù)目達(dá)到高峰期，細(xì)胞內(nèi)大量積累代謝產(chǎn)物，特別是次級(jí)代謝產(chǎn)物。有機(jī)物被生物體氧化降解成氧化產(chǎn)物并釋放能量的過程統(tǒng)稱為生物氧化。微生物生理學(xué)把生物氧化區(qū)分為呼吸和發(fā)酵，呼吸又可進(jìn)一步區(qū)分為有氧呼吸和無氧呼吸。因此，發(fā)酵是生物氧化的一種方式。

發(fā)酵是這樣一種生物氧化方式：在沒有外源最終電子受體的條件下，化能異養(yǎng)型微生物細(xì)胞對(duì)能源有機(jī)化合物的氧化與內(nèi)源的（已經(jīng)經(jīng)過該細(xì)胞代謝的）有機(jī)化合物的還原相耦合，一般并不發(fā)生經(jīng)包含細(xì)胞色素等的電子傳遞鏈上的電子傳遞和電子傳遞磷酸化，而是通過底物（激酶的底物）水平磷酸化來獲得代謝能ATP；能源有機(jī)化合物釋放的電子的一級(jí)電子載體NAD，以NADH的形式直接將電子交給內(nèi)源的有機(jī)電子受體而再生成NAD，同時(shí)將后者還原成發(fā)酵產(chǎn)物（不完全氧化的產(chǎn)物）。

細(xì)胞中的NAD是有限的，如果作為一級(jí)電子載體的輔酶NAD不能得到再生，就不能被回用，有效的電子載體就會(huì)愈來愈少，脫氫反應(yīng)就不能持續(xù)進(jìn)行下去了。因此，輔酶NAD的再生是生物氧化（包括發(fā)酵）繼續(xù)進(jìn)行下去的必要條件。

該菌株是蘭州百合的內(nèi)生菌株，本實(shí)驗(yàn)通過采用組織懸液法處理植物組織然后分別接種于改良高氏I號(hào)、腐殖酸培養(yǎng)基等10種培養(yǎng)基，在改良高氏I號(hào)中分離純化得到一株菌體為紅色形態(tài)特征明顯的放線菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目標(biāo)菌株

從蘭州百合中分離所得的一株放線菌。

1.1.2 主要試劑和藥品

75%乙醇溶液、10%的碳酸氫鈉溶液、生理鹽水、大量高溫滅菌的蒸餾水、無水乙醇、無水乙酸乙酯、甘油、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鉀、氯化鈉、氯化鈣、重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3 主要器材及儀器

9cm培養(yǎng)皿、剪刀、鑷子、酒精燈、酒精棉球、移液槍、槍頭（藍(lán)色、黃色）、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、PH計(jì)、蒸汽滅菌鍋、搖床培養(yǎng)箱、1000ml錐形瓶、濾紙、打孔器、離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及抑菌劑的配制

改良高氏I號(hào)：可溶性淀粉20g；K2HPO4·3H2O，0.5g；MgSO4· 7H2O，0.5g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；瓊脂18g。

抑菌劑：重鉻酸鉀（50μg/mL）、萘啶酮酸（20μg/mL）、放線菌酮（50μg/mL）、制霉菌素（50μg/mL）。

發(fā)酵種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉15g、葡萄糖5g、黃豆粉10g、氯化鈉1g、蛋白胨5g、酵母提取物5g、碳酸鈣5g、蒸餾水1000ml，PH7。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉20g、酵母粉15g、葡萄糖10g、K2HPO41g、碳酸鈣3g、氯化鈉1g、蒸餾水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2 放線菌的培養(yǎng)及目標(biāo)菌株的分離純化

將涂布后的平板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為23℃，時(shí)間為30d。在改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)一株菌體為紅色且形態(tài)特征明顯的放線菌。將該菌株從原平板上分離接種于新的改良高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基上，得到純培養(yǎng)平板。

1.2.3 發(fā)酵

從生長到對(duì)數(shù)期的平板中挑取一定數(shù)量的單個(gè)菌落接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基于搖床中160r/min培養(yǎng)溫度26℃培養(yǎng)時(shí)間2d。種子培養(yǎng)基占發(fā)酵培養(yǎng)基的10%。

將活化兩天以后的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度26℃ PH7.2置于160r/min搖床中發(fā)酵14d。

1.2.4 次級(jí)代謝產(chǎn)物的提取

將發(fā)酵液取出搖勻于4℃4000r離心10分鐘，分離上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例進(jìn)行萃取，萃取完全以后分離有機(jī)相，將有機(jī)相通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗提物，再將粗提物于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥得到粗提物干品（胞外產(chǎn)物）。沉淀于80%丙酮中浸泡并且用超聲波破碎，然后于4℃4000r離心10分鐘，分離上清液和沉淀。上清液用乙酸乙酯按照1：1的比例進(jìn)行萃取，萃取完全以后分離有機(jī)相，將有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗提物，再將粗提物于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥得到粗提物干品（胞內(nèi)產(chǎn)物）。本試驗(yàn)主要以胞外產(chǎn)物為研究對(duì)象。

1.2.5 抑菌活性

表1 次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的抑菌活性結(jié)果

注：濾紙片直徑為10mm結(jié)果中的抑菌直徑包括濾紙品直徑，一號(hào)溶劑為無菌蒸餾水，二號(hào)溶劑為乙醇，三號(hào)溶劑為乙酸乙酯.在做抑菌活性實(shí)驗(yàn)時(shí)乙醇、乙酸乙酯已揮發(fā)，對(duì)照（未加粗提物的乙醇、乙酸乙酯）中也沒有出現(xiàn)抑菌圈.抑菌活性實(shí)驗(yàn)用無菌濾紙片法來操作，將次級(jí)代謝產(chǎn)物（胞外產(chǎn)物）分別稱取0.05g溶于1ml蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯溶劑，每個(gè)溶劑做3個(gè)平行最后取平均值（表1）。

1.3 結(jié)論及分析

該植物內(nèi)生放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物粗品對(duì)腐生桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌（野生型）、金黃色葡萄球菌（ATCC）、糞腸球菌、β-丙酰均有不同抑制作用；在污染的平板中發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)青霉菌、黑曲霉具有明顯的拮抗作用。說明應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)中的方法發(fā)酵和提取發(fā)酵產(chǎn)物是可行的，而且該菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)腐生桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌（野生型）、金黃色葡萄球菌（ATCC）、糞腸球菌、β-丙酰這些病原菌具有抑制作用。

所得產(chǎn)物在水、乙醇、乙酸乙酯三種溶劑中具有不同的溶解度，從整體的抑菌效果上來看溶解于乙酸乙酯的效果是最好的，乙醇次之，水最弱，當(dāng)然不同的菌還是有差異例如大腸桿菌，造成這種現(xiàn)象可能是發(fā)酵產(chǎn)物中具有生物活性的物質(zhì)有多種，這些物質(zhì)對(duì)不同的菌有不同的抑制作用并且這些物質(zhì)對(duì)溶劑的選擇具有一定的條件性。

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[責(zé)任編輯：王楠]