諾沃霉素植生鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

丁璟劍等

摘要：通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分及其含量，提高諾沃霉素有效組分的產(chǎn)量。以高效液相色譜檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的峰面積作為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)獲得最佳碳源及氮源。使用正交試驗(yàn)等獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。相關(guān)發(fā)酵條件為pH 7.0，種齡96 h，接種量10%，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間120 h。根據(jù)高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件下，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量比對(duì)照培養(yǎng)基提高了657%。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基優(yōu)化；正交試驗(yàn)；諾沃霉素；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-3928-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.024

Optimization of Fermentation Media with Novonestmycin Streptomyces phytohabitans

DING Jing-jian， WAN Zhong-yi， FANG Wei， PENG Dong-lin

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesticide， Hubei Agricultural Sciences and Technology Innovation Center， Wuhan 430064， China ）

Abstract： In order to increase the production of Novonestmycin produced by Streptomyces phytohabitans HBERC-20821，the composition and content of the fermentation media were optimized using single-factor test and orthogonal design. According to the result of HPLC， the optimum parameters were obtained as follows： 4.0% glucose， 0.5% yeast extract， 1.0% soybean meal， 0.035% K2HPO4，0.05% CaCO3， 0.1% soybean oil. pH 7.0，seed age 96 h， inoculum volume 10%， fermentation temperature 28 ℃， fermentation time 120 h. Under the optimized conditions，the product output of Novonestmycin increased by 657% compared with the contrast medium.

Key words： media optimization； orthogonal design； Novonestmycin； fermentation conditions

隨著化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期大量使用，各種問(wèn)題逐漸暴露出來(lái)，如利用率低、難降解、污染范圍廣、選擇性不高、害蟲產(chǎn)生抗藥性、危害人類健康等。因此，生物農(nóng)藥逐漸受到人們的重視[1]。相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥而言，生物農(nóng)藥具有選擇性高、環(huán)境相容性好、對(duì)天敵較安全、不容易產(chǎn)生抗性、生產(chǎn)工藝比較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2]。

根據(jù)來(lái)源，生物農(nóng)藥可分為植物源、微生物源等，農(nóng)用抗生素是源于微生物的一類具有明確化學(xué)結(jié)構(gòu)、明確活性的天然產(chǎn)物[3]。在中國(guó)農(nóng)用抗生素屬于生物化學(xué)農(nóng)藥，它具有生物農(nóng)藥環(huán)境相容性好的優(yōu)點(diǎn)，也有化學(xué)農(nóng)藥活性明確、使用效果好的優(yōu)點(diǎn)，因而是現(xiàn)在和將來(lái)最受歡迎的生物農(nóng)藥種類。

諾沃霉素（Novonestmycin）是湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心在世界上首次發(fā)現(xiàn)的一種新的32元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[4]，具有廣譜抗真菌活性。該抗生素對(duì)很多植物病原真菌如黃瓜棒孢菌、芒果褐斑病菌、立枯絲核菌等具有很強(qiáng)的活性，活性強(qiáng)度（最低抑菌濃度MIC）超過(guò)多烯類抗生素、放線菌酮，具有良好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。提高產(chǎn)生菌發(fā)酵水平，對(duì)于其工業(yè)化生產(chǎn)是十分重要的。試驗(yàn)著重研究其搖瓶培養(yǎng)基的優(yōu)化。

培養(yǎng)基是用來(lái)供抗生素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)、繁殖、代謝合成抗生素的，是按一定比例組成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基的成分和配比合適與否，對(duì)產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成有很大的影響，同時(shí)還會(huì)影響到提取工藝、產(chǎn)品質(zhì)量及成本[5]。因此根據(jù)菌種特點(diǎn)探索出最適合其生長(zhǎng)、并有較高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的培養(yǎng)基是發(fā)酵技術(shù)最重要的一環(huán)，同時(shí)也為將來(lái)的工業(yè)化生產(chǎn)做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植生鏈霉菌（Streptomyces phytohabitans）HBERC-20821，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：ISP-2培養(yǎng)基。采用18 mm×180 mm玻璃試管，每管裝瓊脂培養(yǎng)基8～10 mL。

種子培養(yǎng)基（g/L）：甘露醇20；大豆蛋白胨10；磷酸氫二鉀0.35；碳酸鈣0.5；豆油1； pH 7.0。采用500 mL帶檔板三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min。

對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：同種子培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 大振幅搖床SPH-3222（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速離心機(jī)GL21M（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二極管陣列式檢測(cè)器）；自動(dòng)發(fā)酵罐BIOTECH-20-200JS（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；天平JY6002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的搖瓶發(fā)酵 在無(wú)菌條件下，從斜面取8～10 mm的菌餅轉(zhuǎn)移至種子搖瓶中，在28 ℃，150 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上，振蕩培養(yǎng)96 h，然后按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于28 ℃、150 r/min大振幅搖床上，振蕩培養(yǎng)120～144 h，即完成發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵液鏡檢及提取 取少量發(fā)酵液測(cè)量pH并進(jìn)行鏡檢，再向搖瓶中加入100 mL乙酸乙酯后，于180 r/min大振幅搖床上振蕩萃取1 h，離心分離出酯相，旋蒸，除去溶劑，再以1 mL甲醇溶解后，進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3 產(chǎn)物的高效液相色譜（HPLC）分析 采用Sunfire C18色譜柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒徑3.5 μm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL，流動(dòng)相為去離子水和色譜純乙腈，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm[6]。

1.2.4 HPLC分析結(jié)果的處理 根據(jù)HPLC紫外吸收光譜結(jié)果，可由出峰時(shí)間確定產(chǎn)物組分，由峰面積確定對(duì)應(yīng)組分產(chǎn)量[7]。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[8] 碳源單因素試驗(yàn)：只改變?cè)囵B(yǎng)基中碳源，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，按照“1.2.1”方法進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)。

氮源單因素試驗(yàn)：只改變?cè)囵B(yǎng)基中氮源，使用最佳碳源，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，按照“1.2.1”方法進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)。

碳氮源最佳比例的探索：在獲得最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上，進(jìn)行多組試驗(yàn)摸索碳氮用量的最佳比例。改變碳源及氮源的用量，其他組分不變、培養(yǎng)條件保持不變，按“1.2.1”方法進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，大致確定最佳配比。

培養(yǎng)基的進(jìn)一步改良：在獲得一些優(yōu)化培養(yǎng)基的主要參數(shù)后，同時(shí)考慮降低生產(chǎn)成本等方面的問(wèn)題，對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)一步改良。使用正交試驗(yàn)法[9，10]，最終確定HBERC-20821的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源優(yōu)化

進(jìn)行碳源單因素試驗(yàn)，改變?cè)瓝u瓶培養(yǎng)基中碳源成分，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，培養(yǎng)方法按照“1.2.1”，檢測(cè)方法按照“1.2.3”。試驗(yàn)結(jié)果如表1、圖1所示。

由不同碳源的HPLC檢測(cè)結(jié)果可以看出，HBERC-20821對(duì)葡萄糖和糖蜜的吸收和利用要優(yōu)于其他碳源。HBERC-20821對(duì)于蔗糖和甘油利用效果不佳。鏡檢結(jié)果也與HPLC檢測(cè)結(jié)果相符。根據(jù)產(chǎn)物產(chǎn)量對(duì)幾種碳源進(jìn)行排序，依次為糖蜜、葡萄糖、甘露醇、甘露醇*、飴糖、可溶性淀粉。綜合考慮培養(yǎng)基成本和配制培養(yǎng)基的方便程度考慮，確定葡萄糖為最佳碳源。

2.2 氮源優(yōu)化

改變搖瓶培養(yǎng)基中氮源成分，使用葡萄糖作為氮源，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，培養(yǎng)方法按照“1.2.1”，檢測(cè)方法按照“1.2.3”。試驗(yàn)結(jié)果如表2、圖2所示。

由不同氮源的HPLC檢測(cè)結(jié)果可以看出，HBERC-20821對(duì)酵母浸粉的吸收和利用要明顯好于其他氮源。根據(jù)諾沃霉素產(chǎn)量，將幾種氮源進(jìn)行排序，由多到少依次為酵母浸粉、玉米漿、黃豆粕、豆餅、大豆蛋白胨、棉子粉、玉米粉、硫酸銨。HBERC-20821對(duì)于不溶性和無(wú)機(jī)氮源的利用效果不佳。由以上試驗(yàn)結(jié)果確定酵母浸粉為最佳氮源。

2.3 碳氮源最佳比例的探索

在進(jìn)行碳源、氮源單因素試驗(yàn)確定最佳碳氮源后。進(jìn)行多組試驗(yàn)摸索碳氮用量的最佳比例，試驗(yàn)培養(yǎng)基配方見(jiàn)表3。

只改變?cè)瓝u瓶培養(yǎng)基中碳源與氮源的用量，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，培養(yǎng)方法按照“1.2.1”，檢測(cè)方法按照“1.2.3”。試驗(yàn)結(jié)果如表4、圖3所示。

根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，組別4和6中產(chǎn)物產(chǎn)量極低，推測(cè)培養(yǎng)基中碳源含量高于4%，氮源含量高于2%時(shí)菌株代謝將會(huì)明顯受到影響。最適宜HBERC-20821生長(zhǎng)的為組別5中的配方，相對(duì)于對(duì)照組中諾沃霉素產(chǎn)量提高了45.7%，即最適碳氮源比為4∶1。在搖瓶水平上，獲得HBERC-20821最高產(chǎn)量的配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。

2.4 碳氮源正交試驗(yàn)

通過(guò)上面的試驗(yàn)已經(jīng)獲得了HBERC-20821生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源及其比例，但由于酵母浸粉作為氮源成本相對(duì)較高，從降低生產(chǎn)成本考慮，在保證較高產(chǎn)量的條件下使用更為廉價(jià)的豆粕代替部分酵母浸粉作為該菌生長(zhǎng)所需的氮源。使用正交試驗(yàn)法進(jìn)一步改良培養(yǎng)基，試驗(yàn)因素水平設(shè)置見(jiàn)表5，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

按照因素水平設(shè)置表，改變?cè)瓝u瓶培養(yǎng)基中碳源與氮源的用量，其他組分、培養(yǎng)條件保持不變，培養(yǎng)方法按照“1.2.1”，檢測(cè)方法按照“1.2.3”。

L9（33）試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，由表6可知，影響程度由R值可知：B>A>C，即在葡萄糖、酵母浸粉、豆粕三種影響因素中，酵母浸粉影響因素最大。由表6可知，諾沃霉素A+B峰面積最大值為編號(hào)8，即產(chǎn)量最高的組合為A3B2C1。

綜合以上結(jié)果，可以得出HBERC-20821最佳發(fā)酵配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。改良過(guò)的培養(yǎng)基相對(duì)于原配方培養(yǎng)基，諾沃霉素產(chǎn)量提高了657%。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)碳氮源單因素試驗(yàn)獲得植生鏈霉菌HBERC-20821最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母浸粉。通過(guò)多組試驗(yàn)確定碳氮源的最佳比例約為4∶1。根據(jù)前面試驗(yàn)獲得的相關(guān)參數(shù)，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4.0%，酵母浸粉0.5%，豆粕1.0%，磷酸氫二鉀0.035%，碳酸鈣0.05%，豆油0.1%。根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件下，諾沃霉素產(chǎn)量比對(duì)照培養(yǎng)基提高了657%。

本試驗(yàn)僅對(duì)諾沃霉素?fù)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方進(jìn)行優(yōu)化，其他發(fā)酵參數(shù)如pH、接種量、發(fā)酵溫度、攪拌、發(fā)酵時(shí)間等也會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生重要影響。下一步的發(fā)酵工作，將在小型自動(dòng)發(fā)酵罐上進(jìn)行，以優(yōu)化發(fā)酵工藝，并進(jìn)行中試放大，將諾沃霉素向產(chǎn)業(yè)化方向推進(jìn)。

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