蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建

張至瑋等

摘要：從前期建立的蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆得到1個(gè)編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因。結(jié)果表明，AmDREB2.2基因序列全長(zhǎng)1 045 bp，開放閱讀框（ORF）為597 bp，編碼198個(gè)氨基酸，具有典型的DREB轉(zhuǎn)錄因子保守的AP2結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達(dá)，但對(duì)干旱、低溫響應(yīng)不同，AmDREB2.2主要參與根的干旱脅迫應(yīng)答。在AmDREB2.2基因的編碼區(qū)兩端分別加入BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)，雙酶切植物表達(dá)載體pPZP212和帶有酶切位點(diǎn)的AmDREB2.2基因PCR產(chǎn)物，成功獲得了AmDREB2.2的植物過表達(dá)載體pPZP212-AmDREB2.2。

關(guān)鍵詞：蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]；AmDREB2.2基因；表達(dá)特征；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-4065-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.061

Cloning of AmDREB2.2 Gene of Ammopiptanthus mongolicus and Construction of Its Plant Expression Vector

ZHANG Zhi-wei， LI Zhang-lei， GAO Fei， CAO Yu-zhen， XIA Bo-lin， ZHOU Yi-jun

（College of Life and Environmental Sciences， Minzu University of China， Beijing 100081， China）

Abstract： A new dehydration responsive element binding protein（DREB） transcription factor gene， which was named as AmDREB2.2， was cloned from Ammopiptanthus mongolicus （Masxim.） （cheng f.） root transcriptome database. The full length of the AmDREB2.2 cDNA was 1 045 bp， including a single 597 bp opening reading frame which encoded a 198-amino acid peptide with a conserved AP2 domain. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the AmDREB2.2 expressed in leaf and root of A. mongolicus，but there were different expression patterns under drought or low temperature stress respectively， and it could be mainly induced by drought in root. The plant expression vector pPZP212 and AmDREB2.2 with BamH I and Sac I site were digested by these two restriction enzymes， were ligated and recombinant， and then plant expression vector pPZP212-AmDREB2.2 was successfully constructed.

Key words： Ammopiptanthus mongolicus； AmDREB2.2 gene； sequence analysis； expression pattern； plant expression vector

植物中應(yīng)答逆境脅迫的基因通常按照功能分為兩類，一類是功能基因；另一類是調(diào)控基因。轉(zhuǎn)錄因子基因作為調(diào)控基因的一種，可以與真核基因啟動(dòng)子的順式作用元件結(jié)合，從而達(dá)到激活或者抑制轉(zhuǎn)錄的目的[1，2]。目前，已經(jīng)獲得了多種轉(zhuǎn)錄因子基因，將其應(yīng)用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要進(jìn)展[3，4]。其中，對(duì)DREB（Dehydration responsive element binding）轉(zhuǎn)錄因子基因的研究較多[5-7]。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）家族成員，受干旱、高鹽或低溫誘導(dǎo)表達(dá)，其氨基酸序列的N末端具有核定位信號(hào)，C末端具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，而位于中部的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域非常保守，由58個(gè)氨基酸組成，能形成3個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋，兩個(gè)結(jié)構(gòu)都可以結(jié)合到DRE元件的核心結(jié)構(gòu)PUCCGAC上[3，8]。研究表明，DREB2轉(zhuǎn)錄因子基因主要參與調(diào)控植物應(yīng)答干旱、高鹽和熱激脅迫的基因表達(dá)[3，9]。

蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]隸屬豆科沙冬青屬，為中亞荒漠中的孑遺植物，具有極強(qiáng)的耐旱、耐低溫、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科學(xué)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值于一身的研究材料。近年來，關(guān)于蒙古沙冬青的抗逆機(jī)理和抗逆基因資源的挖掘受到關(guān)注，并取得了重要研究進(jìn)展[10-14]。本研究以蒙古沙冬青為研究材料，基于實(shí)驗(yàn)室前期建立的蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)[10]，克隆獲得1個(gè)新的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，對(duì)其結(jié)構(gòu)和逆境表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并構(gòu)建了AmDREB2.2基因的植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步通過異源表達(dá)驗(yàn)證AmDREB2.2基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 蒙古沙冬青種子采自于寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)縣。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 pPZP212植物表達(dá)載體由中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司、pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司。

1.1.3 酶和試劑 Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR Master Mix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；SYBR Green Supermix和限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自Thermo公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)蒙古沙冬青根轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的DREB相關(guān)基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物P2.2F-A：5′-GCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′；P2.2R-A：5′-TCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′擴(kuò)增目標(biāo)基因。

根據(jù)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)基因檢測(cè)引物和內(nèi)參引物。引物P2.2F-B：5′-CTGGGGTAGGCACAGAAGAG -3′；P2.2R-B：5′-GCCCAAAACCAGGAAGAAAT-3′擴(kuò)增目標(biāo)基因AmDREB2.2片段。用引物PAmeIF1-F：5′-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3′；PAmeIF1-R：5′-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3′擴(kuò)增內(nèi)參基因AmeIF1。

根據(jù)植物表達(dá)載體和目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引入BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn)，下游加入Sac Ⅰ酶切位點(diǎn)。引物序列為P2.2F-C：5′- CGCGGATCCGCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′（劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；P2.2R-C：5′-CGCGAGCTCTCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′（劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.2.2 材料培養(yǎng)與處理 種子萌發(fā)培養(yǎng)4周后，用含20% PEG 6 000的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液澆灌，分別處理1、6、24、72 h，然后4 ℃下分別處理1、3、6、24 h。以未脅迫處理（0 h）為對(duì)照，分別取脅迫處理和未經(jīng)脅迫處理后的植物根和葉片組織，稱量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表達(dá)模式分析。

1.2.3 AmDREB2.2基因的克隆 采用改良的Trizol 法分別提取不同脅迫處理的植物根和葉片組織總RNA[15]，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。

以反轉(zhuǎn)錄得到的未經(jīng)脅迫處理的cDNA為模板，以P2.2F-A和P2.2R-A為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，PCR反應(yīng)體系（40 μL）：2×Pfu PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。膠回收目的片段，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆，送至北京華大基因研究中心測(cè)序。

1.2.4 AmDREB2.2基因的生物信息學(xué)分析 分別采用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的蒙古沙冬青編碼DREB基因AmDREB2.2及演繹的氨基酸序列進(jìn)行分析，具體分析目標(biāo)及選用的相關(guān)軟件見表1。

1.2.5 AmDREB2.2的表達(dá)模式分析 采用qRT-PCR對(duì)不同脅迫處理下AmDREB2.2在根和葉片中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以未處理（0 h）為對(duì)照，以AmeIF1為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×SYBR Green Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，稀釋后cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，循環(huán)40次；55 ℃退火10 s（0.5 ℃/循環(huán)），循環(huán)81次。采用基因表達(dá)相對(duì)定量分析，將對(duì)照樣本的基因表達(dá)量設(shè)為1，處理樣本中的基因表達(dá)量變化的倍數(shù)用2-△△Ct來表示，其中，△△Ct=△Ct（處理）-△Ct（對(duì)照），△Ct=Ct（目標(biāo)基因）-Ct（內(nèi)參基因），計(jì)算在不同處理下基因的表達(dá)量，其中每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)做3個(gè)平行。

1.2.6 AmDREB2.2的表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

1）含酶切位點(diǎn)AmDREB2.2基因的擴(kuò)增。以反轉(zhuǎn)錄得到的未脅迫處理的cDNA為模板，以P2.2F-C和P2.2R-C為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（40 μL）：2×Taq PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。膠回收含酶切位點(diǎn)的AmDREB2.2基因，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆，送至北京華大基因研究中心測(cè)序。

2）AmDREB2.2表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定。以pPZP212作為植物表達(dá)載體。以BamHⅠ和SacⅠ雙酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T載體和pPZP212表達(dá)載體，分別膠純化回收目的片段，將兩個(gè)目的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，在含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落。提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 AmDREB2.2基因全長(zhǎng)的克隆

用改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA，根據(jù)蒙古沙冬青根的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得的DREB基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段大小為600 bp左右，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖1）。

2.2 AmDREB2.2基因的生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN 7.0分析獲得的AmDREB2.2基因全長(zhǎng)序列，序列全長(zhǎng)為1 045 bp，其中5′ UTR 長(zhǎng)度為204 bp，3′ UTR長(zhǎng)度為244 bp。ORF編碼區(qū)長(zhǎng)度為597 bp，可編碼198個(gè)氨基酸，其等電點(diǎn)（pI）為8.63，分子質(zhì)量為21 141.54 u。采用NCBI在線分析序列表明，此基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，具有11個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)屬于AP2超家族成員（圖2A）。

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明AmDREB2.1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有3種類型組成：α-螺旋、β-折疊片和無規(guī)則卷曲，3種結(jié)構(gòu)所占比例不同，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊片較少（圖2B）。

用SignalP 3.0 Server在線軟件分析確定AmDREB2.2不具有信號(hào)肽。用PSORT對(duì)AmDREB2.2的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，推測(cè)其定位于細(xì)胞核中。采用cNLS Mapper對(duì)AmDREB2.2的氨基酸序列進(jìn)行核定位信號(hào)分析，確定其核定位信號(hào)序列由27個(gè)氨基酸構(gòu)成。

2.3 AmDREB2.2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將AmDREB2.2氨基酸序列與相近的12個(gè)編碼DREB氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，各序列盡管長(zhǎng)短有別，但都具有12個(gè)保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能與AP2結(jié)構(gòu)域有關(guān)（圖3A）。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，在選取的13種DREB蛋白質(zhì)中，AmDREB2.2與白刺花（Sophora davidii）SdDREB2/AFP89590.1、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C，水稻（Oryza sativa）OsDREB2A/Q0JQF7.1和玉米（Zea mays）ZmDREB2A/ANP_001105876.1聚為一類，其中與SdDREB2最近；與大豆（Glycine max）GmDREB1/AAP47161.1、GmDREB2/ABB36645.1和GmDREB3/ABB36646.1、鹽豆木（Halimodendron halodendron）HhDREB2/ACJ66376.1以及已有文獻(xiàn)報(bào)道的2個(gè)蒙古沙冬青中編碼DREB序列AmDREB1[16]和AmDREB3[17]關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3B）。

2.4 AmDREB2.2的表達(dá)模式分析

2.4.1 干旱脅迫下AmDREB2.1的表達(dá)特征 以20% PEG 6 000模擬干旱脅迫處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在干旱脅迫下不同組織中的響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)果見圖4A。AmDREB2.2在根和葉片中的逆境表達(dá)模式不同，在不同干旱脅迫處理下根中AmDREB2.2表現(xiàn)為迅速上調(diào)表達(dá)，其中1 h表達(dá)量為對(duì)照水平的7.84倍，6 h表達(dá)量達(dá)到最大值，為對(duì)照水平的13.45倍；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，24、72 h表達(dá)量呈明顯的回落趨勢(shì)，與對(duì)照基本相同。而葉中AmDREB2.2在不同干旱脅迫條件下表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，24 h表達(dá)量顯著下調(diào)，為對(duì)照水平的0.26；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量有上升趨勢(shì)。

2.4.2 低溫脅迫下AmDREB2.2的表達(dá)特征 以4 ℃進(jìn)行處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在低溫脅迫下的響應(yīng)特點(diǎn)，結(jié)果見圖4B。AmDREB2.2在根和葉片中的逆境表達(dá)模式相似，與對(duì)照相比均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，但未達(dá)到顯著水平。

2.5 AmDREB2.2表達(dá)載體的構(gòu)建

以BamHⅠ和SacⅠ雙酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T載體和pPZP212表達(dá)載體，分別膠純化回收目的片段。將兩個(gè)目的片段進(jìn)行連接，獲得重組載體pPZP212-AmDREB2.2，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α菌株，并在含有抗生素壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化菌落。以P2.2F-C和P2.2R-C為上、下游引物，以含有重組載體pPZP212-AmDREB2.2的菌液為模板，擴(kuò)增得到約600 bp的AmDREB2.2特異條帶（圖5A）。從兩個(gè)單克隆1和3的菌液中提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖5B。圖中5B為雙酶切產(chǎn)物，大片段長(zhǎng)度約為10 kb，小片段大小約為600 bp；2和3分別為BamHⅠ和SacⅠ的單酶切產(chǎn)物，大小約為10 000 bp；4和5為重組質(zhì)粒，表明AmDREB2.2表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 小結(jié)與討論

植物中的DREB類轉(zhuǎn)錄因子成員較多，參與不同的逆境脅迫應(yīng)答，如在擬南芥中，DREB1基因主要受低溫誘導(dǎo)表達(dá)，DREB2基因則受干旱、高鹽和高溫誘導(dǎo)表達(dá)[1]。蒙古沙冬青為主要生長(zhǎng)于中亞荒漠地區(qū)惟一的常綠闊葉灌木，具有極強(qiáng)的耐干旱、耐低溫、耐貧瘠、耐受沙埋等特性。本研究從蒙古沙冬青中獲得了1個(gè)編碼DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因AmDREB2.2，生物信息學(xué)分析表明其編碼蛋白具有典型的DREB 類轉(zhuǎn)錄因子所共有的保守AP2結(jié)構(gòu)域和保守的氨基酸序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AmDREB2.2與同為豆科的白刺花SdDREB2親緣關(guān)系最近，但與同為豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB1和GmDREB2以及已經(jīng)報(bào)道的蒙古沙冬青AmDREB1[16]和AmDREB3[17]分屬在不同的進(jìn)化支上，同科植物以及同種植物不同成員之間的進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果提示，這些成員可能存在功能上的差異。

Li等[18]研究了大豆GmDREB不同成員的表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)GmDREBc僅在根中受鹽、干旱和ABA誘導(dǎo)。本研究結(jié)果表明，AmDREB2.2在蒙古沙冬青的根和葉片中均能表達(dá)，但在不同脅迫條件下，AmDREB2.2在根與葉片的表達(dá)模式不同。AmDREB2.2主要在根中受干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而不受低溫脅迫誘導(dǎo)，表明AmDREB2.2主要參與蒙古沙冬青應(yīng)答干旱脅迫的反應(yīng)，且具有組織特異性，僅在根中積極響應(yīng)，符合DREB2類基因主要受干旱、高鹽和高溫誘導(dǎo)表達(dá)的特征。endprint

植物的抗逆性是一個(gè)受多基因控制的數(shù)量性狀，轉(zhuǎn)化單一下游耐逆基因僅能在一定程度上提高植物的抗性，存在一定的局限性。而通過超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子可以激活更多的下游靶基因獲得抗逆性，故而被認(rèn)為是植物抗性基因工程的首選基因。本研究選擇花椰菜花葉病毒（CaMV）35S作為啟動(dòng)子的pPZP212表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPZP212-AmDREB2.2，為進(jìn)行異源表達(dá)驗(yàn)證基因功能以及植物抗性基因工程研究奠定了基礎(chǔ)。

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