產(chǎn)表面活性劑解烴菌的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

摘要：為了獲得產(chǎn)表面活性劑解烴菌，經(jīng)血平板篩選和發(fā)酵液排油活性測定，從新疆石油污染土壤中分離出1株能產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌B-1。通過形態(tài)和生理生化特征分析，初步鑒定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。通過產(chǎn)量指標(biāo)對菌株B-1 產(chǎn)生物表面活性劑的條件進行優(yōu)化，確定其最適發(fā)酵條件為：pH值7.5、溫度30 ℃、鹽濃度5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產(chǎn)量可達1.76 g/L。薄層色譜分析結(jié)果表明，B-1產(chǎn)脂肽、脂蛋白類生物表面活性劑，可將發(fā)酵液表面張力從68.20 mN/m降低到31.70 mN/m，乳化指數(shù)（E24）達到92.80%。

關(guān)鍵詞：石油降解菌；生物表面活性劑；表面張力；發(fā)酵條件

中圖分類號： S182文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0437-03

收稿日期：2014-11-17

基金項目：新疆石河子大學(xué)優(yōu)秀青年項目（編號：2012ZRKXYQ10）。

作者簡介：楊樂（1980—），女，河南南陽人，碩士，講師，從事環(huán)境污染修復(fù)研究工作。E-mail：yl_shzu@163.com。生物表面活性劑是微生物在一定條件下分泌的胞外或者膜結(jié)合型的具有表面活性的兩性化合物，具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液等特性。由于微生物的差異性，其代謝產(chǎn)生的表面活性劑具有多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括脂肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、中性脂質(zhì)和聚合類生物表面活性劑[1-2]。與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑低毒，可生物降解，能適應(yīng)極端環(huán)境，具有更好的選擇性和專一性、環(huán)境友好性等優(yōu)點，因而越來越受到人們的青睞，在社會生產(chǎn)和生活各領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

碳氫化合物是導(dǎo)致環(huán)境退化的主要污染物，具有一定的毒性和疏水性，在土壤環(huán)境中難以自然降解，給生態(tài)安全和生物健康帶來了巨大風(fēng)險。大量研究表明，生物表面活性劑通過乳化作用和降低油水界面張力，對疏水性石油烴具有增溶作用，提高了石油烴的可生物利用性，進而加快油污土壤的修復(fù)過程[5-8]。因此，篩選具有產(chǎn)表面活性劑和降解石油烴功能的微生物，在修復(fù)石油污染土壤方面具有重要的應(yīng)用潛力。

本研究的目的是從新疆地區(qū)石油污染土壤中篩選具有高效產(chǎn)表面活性劑能力的石油烴降解菌，優(yōu)化該菌株產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵條件，同時考察其產(chǎn)生的生物表面活性劑類型和性能，以期為探索產(chǎn)表面活性劑的解烴菌在新疆石油污染土壤中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌株分離土壤采自新疆獨山子石油污染土壤；原油取自獨山子煉油廠。

試驗所用培養(yǎng)基：（1）無機鹽培養(yǎng)基：1.0 g/L K2HPO4·3H2O，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L NH4NO3，0.02 g/L CaCl2，痕量FeCl3，pH值7.5；（2）血平板，購自上海撫生生物科技有限公司；（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，pH值75；（4）降解培養(yǎng)基：為無機鹽培養(yǎng)基，含1 g/L原油，pH值7.5。

1.2產(chǎn)生物表面活性劑解烴菌的篩選

稱取10 g土樣加入到含1 000 mg/L石油的100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min進行富集培養(yǎng)，每隔5 d取培養(yǎng)液并以10%的轉(zhuǎn)接量依次轉(zhuǎn)入新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，并逐步提高石油濃度到1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L。通過觀察石油消失與否判斷石油的降解程度，連續(xù)馴化傳代5次后，取0.1 mL培養(yǎng)液涂布于血平板上培養(yǎng)24 h，選擇周圍有溶血圈的菌落，挑取單菌落，連續(xù)劃線純培養(yǎng)3次，得到1株純化菌株，命名為B-1，挑取菌株到LB斜面進行保存?zhèn)溆?。將斜面保存的菌株B-1接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫（30 ℃、150 r/min）培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液排油圈大小，以確定其是否能夠產(chǎn)生生物表面活性劑。

1.3菌株鑒定

將所篩選菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落外部形態(tài)特征，參照《常見細菌鑒定手冊》[9]對菌株B-1進行生理生化特性鑒定。

1.4種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：從LB斜面中挑取1環(huán)菌接種于裝有100 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)24 h的種子液，以1%的接種量接種至裝有100 mL發(fā)酵液的錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min培養(yǎng) 48 h。

1.5生物表面活性劑的提取

將菌株B-1培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液離心（4 ℃、6 000 r/min，10 min）去除菌體，上清液用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為2.0，4 ℃靜置過夜收集沉淀物（4 ℃、8 000 r/min，15 min），再用二氯甲烷萃取沉淀物并離心收集（4 ℃、10 000 r/min，10 min），抽真空干燥至恒質(zhì)量，確定表面活性劑產(chǎn)量。

1.6發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1pH值對生物表面活性劑產(chǎn)量的影響 將菌株B-1的種子液按體積分數(shù)1%接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用HCl、NaOH溶液分別將pH值調(diào)節(jié)為6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，在 30 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，按照上述提取生物表面活性劑的方法，研究初始pH值對生物表面活性劑產(chǎn)量的影響。

1.6.2溫度對生物表面活性劑產(chǎn)量的影響確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適pH值后，將菌株B-1接種于新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別放置于20、25、30、35、40 ℃條件下，在初始pH值為7.5的條件下培養(yǎng)48 h，按照生物表面活性劑的提取方法對生物表面活性劑進行提取和測定，研究發(fā)酵培養(yǎng)基的最適溫度。

1.6.3鹽濃度對生物表面活性劑產(chǎn)量的影響用NaCl調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基中的鹽濃度分別為0、5、10、30、50、70 g/L，在pH值為7.5、溫度30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，提取發(fā)酵液中的生物表面活性劑，研究發(fā)酵培養(yǎng)基的最適鹽濃度。

1.7生物表面活性劑性能的測定

生物表面活性劑的定性分析：取0.1 g生物表面活性劑溶解于50 mL甲醇中，在硅膠板上采用薄層色譜法進行分析[10]。

生物表面活性劑穩(wěn)定性評價：以未接菌的培養(yǎng)液作對照，將菌株B-1活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h，參照文獻[11-12]的方法，取一定量的發(fā)酵上清液進行排油試驗，以及表面張力、乳化指數(shù)（E24）的測定，相應(yīng)公式如下：

E24=乳化層高度/混合液總高度×100%。2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)生物表面活性劑解烴菌的篩選與鑒定

2.1.1菌株的篩選經(jīng)富集分離和純化，從獨山子石油污染土壤中篩選出能夠降解石油并在血平板培養(yǎng)過程中出現(xiàn)溶血圈的菌株1株，命名為B-1。通過發(fā)酵培養(yǎng)和排油活性測定，石油降解菌B-1能夠形成6.0 cm的排油圈，而對照液滴則由石蠟穿過，沒有排油圈形成。一般而言，排油圈的直徑與表面活性劑含量成正比，試驗結(jié)果表明，菌株B-1能夠產(chǎn)生表面活性物質(zhì)。

2.1.2菌株的鑒定菌株B-1菌落呈乳白色，不透明，較干燥，有褶皺，在血瓊脂培養(yǎng)基上形成溶血圈；菌體為革蘭氏陽性桿菌，有芽孢，無莢膜，有鞭毛，能運動。B-1主要生理生化特征見表1，分析可知，菌株B-1為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。

表1菌株B-1主要的生理生化特性

指標(biāo)類型特性氧化酶-H2O2酶+淀粉水解+M.R試驗-V.P.試驗+吲哚試驗-葡萄糖利用產(chǎn)酸不產(chǎn)氣硝酸鹽還原+明膠液化+注：“+”“-”分別表示試驗結(jié)果為陽性、陰性。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化

生物表面活性劑是微生物的次生代謝產(chǎn)物，不同微生物合成代謝物的最適環(huán)境條件差異較大。環(huán)境條件會影響微生物的生長及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此需要從pH值、溫度、鹽濃度方面對B-1的發(fā)酵條件進行考察優(yōu)化。

2.2.1初始pH值對菌株B-1產(chǎn)表面活性劑的影響從圖1可見，初始pH值對菌株B-1產(chǎn)表面活性劑的影響較小，在pH值6.0～9.0的范圍內(nèi)都可以產(chǎn)生表面活性物質(zhì)；隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，菌株分泌表面活性劑的量增加，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.5時表面活性劑產(chǎn)量達到最大值，為176 g/L；隨后隨著pH值增加，產(chǎn)量下降，與已報道的表面活性劑產(chǎn)生菌的最適pH值6.0～7.0相比，芽孢桿菌B-1更適應(yīng)于偏堿性的環(huán)境。

2.2.2溫度對菌株B-1產(chǎn)表面活性劑的影響從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，表面活性劑產(chǎn)量增加，在30 ℃時，菌株B-1的表面活性劑產(chǎn)量達到最大值；隨后表面活性劑產(chǎn)量開始下降，在40 ℃時，B-1表面活性劑產(chǎn)量最低。

2.2.3鹽濃度對菌株B-1產(chǎn)表面活性劑的影響由圖3可見，鹽濃度在0～10 g/L對降解菌B-1產(chǎn)表面活性劑的影響較小，當(dāng)培養(yǎng)基含鹽量為5 g/L時，表面活性劑產(chǎn)量達到最大值；鹽濃度超過30 g/L時，開始抑制表面活性劑的產(chǎn)生；菌株B-1有較高的耐鹽能力，在鹽濃度為 70 g/L時仍然分泌表面活性物質(zhì)。研究結(jié)果表明，菌株B-1受低滲透壓的影響不大，有一定耐受高滲透壓的能力，具備在一定鹽堿環(huán)境中降解石油污染物的基礎(chǔ)。綜合以上研究，石油降解菌B-1產(chǎn)表面活性劑的最適條件為pH 值7.5、溫度 30 ℃、鹽濃度5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產(chǎn)量可達1.76 g/L。

2.3生物表面活性劑的定性分析

生物表面活性劑包括糖脂、脂肽、磷脂質(zhì)、中性脂、脂肪酸和高分子脂類物質(zhì)，生物表面活性劑的類型既與菌株有關(guān)，又與底物有關(guān)。先將菌株B-1培養(yǎng)48 h，再將發(fā)酵液離心，取上清液酸化（pH值為2），放置于冰箱中過夜，有白色沉淀產(chǎn)生；經(jīng)薄層色譜法定性分析，與莫氏試劑接觸后不顯色，表明樣品中沒有糖類成分，而與茚三酮接觸后顯色，表明樣品中有氨基存在，初步判定生物表面活性劑為脂肽、脂蛋白類物質(zhì)。

2.4生物表面活性劑性能評價

表面活性劑性能評價方法包括測定排油活性、表面張力、油水乳化穩(wěn)定性、臨界膠束濃度及HLB值（親水親油平衡值）等，以未接菌的發(fā)酵液為對照，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，分別測定菌株B-1發(fā)酵上清液的排油活性、表面張力和油水乳化穩(wěn)定性。

研究結(jié)果表明，菌株B-1在石蠟液面能夠形成直徑為7.5 cm的排油圈，而對照沒有排油圈形成；此外，解烴菌B-1能顯著降低發(fā)酵液的表面張力，由最初的68.20 mN/m降到31.70 mN/m，表明該菌株具有較高的表面活性。將B-1發(fā)酵液與液體石蠟混合，靜置24 h后測定的乳化指數(shù)為9280%，大于50%，表明該菌株具有較強的乳化活性和穩(wěn)定性。

3結(jié)論

從新疆石油污染土壤中篩選出1株產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌，命名為B-1，形態(tài)和生理生化初步鑒定表明，B-1為芽孢桿菌屬細菌（Bacillus sp.）。菌株B-1所產(chǎn)的生物表面活性劑初步判定為脂肽、脂蛋白類物質(zhì)，采用單因素試驗對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到其最適pH值為7.5，培養(yǎng)溫度為30 ℃，鹽濃度為5 g/L，在此條件下，生物表面活性劑產(chǎn)量可達1.76 g/L。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，菌株B-1能將發(fā)酵液的表面張力由68.20 mN/m降至31.70 mN/m，表明該菌株具有較強的降低表面張力的能力；油水乳化指數(shù)為92.80%，表明該菌株具有較強的乳化活性和穩(wěn)定性，在石油污染土壤生物修復(fù)過程中具有較高的實用價值和應(yīng)用前景。

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