拮抗放線菌YH6的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

趙柏霞等

摘要：為探討拮抗菌YH6在食品工程中的應(yīng)用潛力，通過形態(tài)觀察及16S rDNA序列分析確定了其分類地位，采用牛津杯法測定其發(fā)酵液的抑菌活性，并采用單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)方法篩選出該菌株的優(yōu)化發(fā)酵配方和發(fā)酵條件。結(jié)果表明，YH6為球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）；該菌株發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有較強(qiáng)的抑制活性。培養(yǎng)基優(yōu)化組合為：甘薯粉8.0 g/L、硫酸銨 10.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、CaCO3 1.0 g/L，優(yōu)化發(fā)酵條件為：初始pH值8.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速120 r/min。

關(guān)鍵詞：抑菌活性；放線菌；分類鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號： S482.2+8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0180-04

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、大腸桿菌（Escherichia coli）是動(dòng)物和人類化膿感染中最常見的病原菌[1]，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可以找到，因此，食品受其污染的機(jī)會很多，產(chǎn)生的腸毒素可以沾染食物而致食物中毒。

放線菌是生物農(nóng)藥中農(nóng)用抗生素制劑的重要來源，已研制開發(fā)具有較強(qiáng)抗菌防病作用的放線菌源農(nóng)用抗生素如放線菌酮、井岡霉素、中生菌素、春雷霉素、武夷菌素、農(nóng)抗120、多抗霉素等，均已成功應(yīng)用于植物各種病害的生物防治[2-3]。海洋環(huán)境特殊，孕育著豐富的微生物資源，包括能產(chǎn)生各種次級代謝產(chǎn)物的海洋放線菌，并且也有從海水中篩選出許多對植物病原真菌、細(xì)菌病害以及對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抗菌活性的放線菌，因此，海洋放線菌在新型代謝產(chǎn)物以及生物農(nóng)藥的開發(fā)方面具有巨大的潛力[4-8]。

本研究室從海洋沉積物中篩選到1株對金黃色葡萄球菌具有強(qiáng)拮抗活性的放線菌株YH6，對該菌進(jìn)行形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，并對其發(fā)酵培養(yǎng)液成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究抗菌機(jī)制、測定活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：拮抗菌YH6由大連開發(fā)區(qū)泊石灣海泥中分離獲得；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由筆者所在的研究室分離鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基：A～D號發(fā)酵培養(yǎng)基（A培養(yǎng)基，馬鈴薯20%、葡萄糖2%；B培養(yǎng)基，大豆粉1%、葡萄糖1%、氯化鈉0.25%、碳酸鈣0.2%、蛋白胨0.3%；C培養(yǎng)基，葡萄糖1%、蛋白胨0.3%、氯化鈉0.25%、碳酸鈣0.2%；D培養(yǎng)基，葡萄糖2%、大豆粉2%、蛋白胨0.3%、硫酸銨0.2%、硫酸鎂005%、碳酸鈣0.6%，pH值7.8-8.0；LB培養(yǎng)基，胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5 %、NaCl 1%、瓊脂1.5%，pH值7.8～80）。A～D培養(yǎng)基用于菌株YH6發(fā)酵液的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基用于指示菌培養(yǎng)以及抑菌活性的測定。

主要試驗(yàn)儀器：ZHWY211B型恒溫?fù)u床（上海，智誠公司）；CT15RT冷凍離心機(jī)（上海，天美公司）；TC-512型PCR擴(kuò)增儀（英國，Techne公司）；S-4800型掃描電鏡（日本，日立公司）。

1.2拮抗菌YH6的分類鑒定

1.2.1形態(tài)特征觀察在高氏1號培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)、菌絲顏色及是否產(chǎn)生色素。

1.2.216S rDNA序列測定及分析采用微波法[8]提取拮抗菌株YH6總DNA，應(yīng)用通用引物（F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增?？寺y序后，將測得的16S rDNA全序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得序列登錄號，并應(yīng)用MEGA 5.0軟件在Ezbiocloud（www.ezbiocloud.net）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，與已報(bào)道的放線菌模式菌株的16S rDNA全系列進(jìn)行比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3YH6抑菌譜測定

采用牛津杯法分別測定菌株YH6發(fā)酵液的上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，以無菌培養(yǎng)液為對照。

1.4發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1最佳基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選以A～D號培養(yǎng)基作為初始的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別以10%的濃度接種100 mL菌株YH6的發(fā)酵液，置于28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，5 d后發(fā)酵液經(jīng)過8 000 r/min離心，取100 μL上清，并采用牛津杯法測定其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，篩選出最適的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基的成分優(yōu)化碳源：以“1.4.1”節(jié)中篩選出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其中分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、甘薯淀粉分別替換碳源，并以原始培養(yǎng)基作為對照。氮源：分別用大豆粉、酵母粉、牛肉膏、（NH4）2SO4等分別替換氮源，以原始培養(yǎng)基作對照。上述試驗(yàn)均在 28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5 d，離心發(fā)酵液，并取上清液測定其活性，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選用4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合。

1.4.3發(fā)酵條件的優(yōu)化以“1.4.2”節(jié)得到的優(yōu)化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別改變培養(yǎng)基的初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵溫度（21、25、28、31、34、37 ℃）和發(fā)酵時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d），以發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，確定最佳pH值、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間；在篩選出的最佳pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間的條件下改變接種量（1%、3%、5%、8%、10%、15%）、裝液量（250 mL三角瓶分別裝液25、50、75、100、125、150、175 mL）、轉(zhuǎn)速（100、120、150、180、200 r/min）進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)上述處理后測定對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性，確定最佳發(fā)酵條件，每組處理重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌YH6的生物學(xué)特性及分類鑒定

2.1.1形態(tài)學(xué)鑒定拮抗菌YH6在高氏1號培養(yǎng)基上氣絲粉狀，秸草色、乳脂色或微黃秸草色，基絲無色，有時(shí)反面微黃色。掃描電鏡觀察（圖1）孢子絲非螺旋形，長條狀，孢子圓柱形，表面光滑。

2.1.216S rDNA測序結(jié)果分析YH6總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到1條約為1.5 kb的特征條帶，回收后連接轉(zhuǎn)化，陽性克隆子菌液測序，得到序列長為1 431 bp，GenBank登錄號為HQ696549 。將該序列與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），并結(jié)合形態(tài)特征，分析結(jié)果表明，YH6菌株與球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）的同源性最高，初步將該菌鑒定為球孢鏈霉菌。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.2.1最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選利用A～D等4種培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，B培養(yǎng)基產(chǎn)生活性物質(zhì)較多，抑菌圈直徑可達(dá)253 mm；A培養(yǎng)基產(chǎn)生的活性物質(zhì)最少，抑菌圈直徑僅為10.7 mm；而C、D培養(yǎng)基產(chǎn)生活性物質(zhì)的抑菌圈直徑分別為20.5、15.0 mm（圖3）。表明B培養(yǎng)基為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2.2最佳碳源、氮源的篩選不同碳源對YH6發(fā)酵液的抑菌效果見圖4-A，從強(qiáng)到弱依次為甘薯粉>蔗糖>淀粉>玉米粉>葡萄糖，選擇甘薯粉為最佳碳源；不同氮源抑菌活性見圖4-B，從強(qiáng)到弱依次為硫酸銨>大豆粉>牛肉膏>酵母粉，因此選用硫酸銨作為最佳氮源。

2.2.3碳源、氮源、無機(jī)鹽配比的正交優(yōu)化根據(jù)單因素碳氮源篩選結(jié)果，選取4因素3水平的L9（34）正交表設(shè)計(jì)9種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果（表1）表明，甘薯粉對

活性物質(zhì)產(chǎn)生影響最大，CaCO3 影響最小，其優(yōu)化后的最佳發(fā)酵配方為A1B2C1D1，即甘薯粉8.0 g/L，硫酸銨 10.0 g/L，NaCl 2.0 g/L，CaCO3 1.0 g/L。

2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1初始pH值發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對活性物質(zhì)的產(chǎn)生影響較小，當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為8.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)；在pH值為5.0時(shí)，活性物質(zhì)產(chǎn)生達(dá)到最低值。與pH值自然的發(fā)酵液相比，pH值調(diào)為8.0時(shí)抑菌活性增加12.4%，因此發(fā)酵的最佳初始pH值為8.0（圖5-A）。

2.3.2發(fā)酵溫度培養(yǎng)溫度對YH6產(chǎn)生活性物質(zhì)的影響較大，在21～28 ℃抑菌活性緩慢增強(qiáng)，在28 ℃達(dá)到最大，當(dāng)溫度超過28 ℃時(shí)抑菌活性明顯下降，因此，該菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃（圖5-B）。

2.3.3發(fā)酵時(shí)間拮抗菌YH6在優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，抑菌圈直徑達(dá)16 mm，培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑可達(dá)28.5 mm；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，發(fā)酵液的抑菌活性逐漸降低，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量增加而導(dǎo)致了菌株活性物質(zhì)產(chǎn)量降低，同時(shí)活性產(chǎn)物的降解率提高所導(dǎo)致。因此，最佳培養(yǎng)時(shí)間選擇5 d（圖5-C）。

2.3.4接種量YH6發(fā)酵培養(yǎng)的接種量在1%～15%范圍內(nèi)均有一定的抑菌活性，當(dāng)接種量為8%時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為27.6 mm，因此，YH6發(fā)酵培養(yǎng)過程中宜采用8%的接種量（圖5-D）。

2.3.5裝液量在裝液量為50 mL（250 mL的三角瓶中裝液50 mL）時(shí)，所得的發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抑菌活性，隨著裝液量的逐漸增大，發(fā)酵液的抑菌活性則逐漸降低，這可能是由于發(fā)酵培養(yǎng)過程中，三角瓶中的空氣含量減少影響了YH6產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力，說明該菌株在溶氧量較高的情況下容易產(chǎn)生活性物質(zhì)。因此，培養(yǎng)的最佳裝液量為50 mL/250 mL（圖5-E）。

2.3.6轉(zhuǎn)速當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到27.5 mm，轉(zhuǎn)速過高或者過低都會影響菌株YH6活性物質(zhì)的產(chǎn)生，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因?yàn)榫闥H6屬于好氧菌，對于好氧菌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速可以達(dá)到增加溶氧量的目的，進(jìn)而會提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量，但當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時(shí)，會對菌體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而抑制了活性物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速選擇120 r/min（圖5-F）。

3結(jié)論與討論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，初步得到了適合搖瓶條件下菌株YH6發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：甘薯粉8.0 g/L、硫酸銨 10.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、NaCl 2.0 g/L、CaCO3 1.0 g/L；最適培養(yǎng)條件為：初始pH值為8.0、發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量8%、裝液量50 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速為120 r/min。在此條件下，YH6的抑菌圈直徑高達(dá)29.8 mm，比在原始B培養(yǎng)基上抑菌圈25.3 mm 有了明顯提高。在優(yōu)化培養(yǎng)條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌株最適培養(yǎng)基pH值為8.0左右，表明該菌株喜歡在偏堿性的環(huán)境中生長，溫度在31 ℃以上時(shí)菌株抑菌活性顯著減弱，說明該菌株不耐高溫。

放線菌廣泛存在于自然界中，種類繁多，是一類有著很大應(yīng)用潛力的微生物資源，從Cohn發(fā)現(xiàn)放線菌至今，有大量關(guān)于放線菌是重要的醫(yī)藥和農(nóng)藥資源的報(bào)道。據(jù)報(bào)道，從海洋中分離獲得的具有抗菌活性的放線菌多為Streptomyces、Micromonospora、Pseudonocardia等[9-12]。

本試驗(yàn)篩選出的來自大連海域的放線菌YH6對金黃色葡萄球菌具有很好的拮抗作用，經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析將菌株YH6初步鑒定為球孢鏈霉菌。該菌株發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物對大腸桿菌也有很好的抑制效果，因此具有較高的潛在價(jià)值。據(jù)報(bào)道，將該菌與其他菌種混合施入番茄幼苗可促進(jìn)番茄地上部、地下部和整株鮮質(zhì)量增加，根系活力增強(qiáng)和葉綠素含量提高[13]。此外，該菌對油菜菌核病有拮抗作用[14]，對甜瓜、棉花、草莓等作物常見土傳病害具有抑制作用[15]。因此，本試驗(yàn)優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，為進(jìn)一步分離純化其活性代謝產(chǎn)物以及開發(fā)高效生防制劑奠定基礎(chǔ)，期望在優(yōu)化其發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究抑菌機(jī)

制及在食品、農(nóng)產(chǎn)品防腐上的應(yīng)用效果，從而有利于發(fā)揮其綠色保鮮功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]高濤. 食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 福建分析測試，2003，12（2）：39-42.

[2]朱昌雄，謝德齡，倪楚芳. 農(nóng)抗120防治西瓜枯萎病菌的室內(nèi)藥效試驗(yàn)[J]. 生物防治通報(bào)，1990，6（3）：124-127.

[3]蔣細(xì)良，謝德齡，倪楚芳，等. 中生菌素的抗生作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，1997，27（2）：40-45.

[4]李曉虹，裴永娜，李學(xué)鋒，等. 幾株農(nóng)用拮抗鏈霉菌的初步研究[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（1）：26-28.

[5]姜健，楊寶靈，魯紅凱，等. 海洋微生物生物活性物質(zhì)的研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，26（增刊1）：91-95.

[6]溫占波，裴月湖，田黎. 海洋微生物產(chǎn)抑真菌、抑腫瘤次生代謝產(chǎn)物的初步研究[J]. 中國海洋藥物，2003，22（6）：6-9.

[7]竇會娟，李林珂，劉新勝，等. 高抑制金黃色葡萄球菌活性放線菌的分離及分子鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5076-5077.

[8]徐平，李文均，徐麗華，等. 微波法快速提取放線菌基因組DNA[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2003，30（4）：82-84.

[9]陳義光，張曉蓉，張麗，等. 具抗菌活性海洋放線菌菌株JMC 06001的分離和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（1）：40-44.

[10]邵彥坡，方麗萍，魏少鵬，等. 海洋放線菌B5菌株發(fā)酵液抗菌譜及穩(wěn)定性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（3）：248-251，256.

[11]劉姝，陸兆新，呂鳳霞，等. 一株海洋放線菌的分類鑒定及抗菌活性研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（4）：124-129.

[12]劉妍，李志勇. 海洋放線菌研究的新進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2005（6）：34-39.

[13]宋金枝. 放線菌不同施入方式對連作番茄幼苗生長的影響[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（2）：187-190.

[14]胡磊，牛世全，景彩虹，等. 拮抗油菜菌核病菌的鏈霉菌分離篩選與鑒定[J]. 中國油料作物學(xué)報(bào)，2013，35（1）：69-73.

[15]趙娟，薛泉宏，杜軍志，等. 廣譜拮抗放線菌C28的鑒定及其對甜瓜蔓枯病的防治效果[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，40（9）：65-71.蔣桂芳，宋力. 拮抗放線菌F2發(fā)酵液的穩(wěn)定性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：184-185，330.