樹莓乙醇提取物抑菌活性研究

劉亞紅++張婷婷++張敏

摘要： 研究以大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、酵母（Yeast）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillums niger）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）為供試菌，測定樹莓（Rubus chingii Hu）乙醇提取物的抑菌活性。結(jié)果表明，樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有比較顯著的抑菌效果；在一定溫度及pH范圍內(nèi)，其抑菌率與時間呈正相關(guān)；而在時間相同的情況下，其抑菌率與乙醇提取物濃度呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：樹莓（Rubus chingii Hu）； 乙醇提取物； 抑菌活性

中圖分類號：Q949.32；R151 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4485-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.024

樹莓（Rubus chingii Hu），薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L），廣泛分布于江浙地區(qū)、以及南部沿海省份[1]。樹莓的果實極具經(jīng)濟價值與藥用價值，可以直接食用，也可以釀酒、做糖等；樹莓的藥用部位主要是其經(jīng)干燥處理后的果實，主要功效是補肝、固精等。樹莓果實中有大量樹莓酸、β-谷甾醇等活性物[2-4]，有較為顯著的溫腎、抗氧化、延緩衰老功效[5-7]。

而針對樹莓果實的提取物的抑菌功能研究則尚不多見，本研究將樹莓乙醇提取物的抑菌圈和最低抑菌濃度做為評估標準，測試樹莓果實的乙醇提取物對一些常見菌的抑菌能力[8]，在此基礎(chǔ)上進一步測定在不同溫度、不同pH條件下樹莓乙醇提取液抑菌活性的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹莓乙醇提取物，其中樹莓原料于2013年6月5～10日采集于江蘇鎮(zhèn)江地區(qū)，以沸水煮5 min，陰涼干燥處風干，用粉碎機粉碎，過0.25 mm篩，密封存于冰箱備用。大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、酵母（Yeast）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillums niger）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）。試驗所需以上各菌種來自河北經(jīng)貿(mào)大學生物與食品實驗中心。

恒溫培養(yǎng)箱（BPH-92722），購自上海精密儀器有限責任公司；高壓滅菌鍋（G154DW），為深圳博大精科有限責任公司產(chǎn)品；超凈無菌操作臺（VD-650），為北京華威興業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；干燥箱（202A-1），為南京萊步科技有限公司產(chǎn)品；磁力攪拌機（FCH202-S），為上海弗魯克科學儀器公司產(chǎn)品；離心機（LW-250A），為浙江天恩儀器制造公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE2000E），為上?？粕齼x器有限責任公司產(chǎn)品；另有酒精燈、三角瓶、培養(yǎng)皿等。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備乙醇提取物 取已經(jīng)制備好并過篩冷藏的樹莓100 g，充分溶解于500 mL體積分數(shù)為75%乙醇溶液中。用攪拌機充分攪拌1.5 h，再用離心機進行離心分離，過濾后得到樹莓乙醇提取液，以蒸發(fā)儀進行濃縮處理，減壓真空干燥，得到樹莓乙醇提取物備用。

1.2.2 制備培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基，取馬鈴薯300 g，洗凈，去除外皮，切塊，入鍋加水沸騰后，繼續(xù)煮20 min，以8層紗布過濾，將所得濾物取葡萄糖20 g，瓊脂20 g，攪拌均勻，定容至1 000 mL，置于滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

1.2.3 制備菌懸液 將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母、匍枝根霉、黑曲霉、灰綠青霉接種于培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，活化36 h，使其處于指數(shù)生長期后期，再選取處于一環(huán)位置的菌種，以RPMI 1 640培養(yǎng)液制成每種菌種的菌懸液，調(diào)整菌液濃度至107～108 CFU/mL。

1.2.4 制備濾紙片 取濾紙，用打孔器將其處理為半徑3 mm的圓形紙片，置于干燥箱，設(shè)置250 ℃進行滅菌處理，取出冷卻至常溫，浸入樹莓乙醇提取液，浸泡60 min，取出。

1.2.5 測定抑菌圈 在無菌操作臺測定樹莓乙醇提取液抑菌效果。將PDA培養(yǎng)基置于微波爐2 min使其熔化并冷卻至常溫凝固，然后在其表面均勻涂抹107～108 CFU/mL濃度的菌液，再把樹莓乙醇提取液濾紙片貼放于涂抹菌液的培養(yǎng)基表面。每一菌種重復8次。在37 ℃恒溫箱里培養(yǎng)48 h，以濾紙片抑菌圈直徑描述樹莓乙醇提取液的抑菌效果。

1.2.6 測定抑菌濃度 在10個試管中均注入3 mL液態(tài)培養(yǎng)基，然后在第1個試管里注入3 mL濃度為3.5 mg/mL的樹莓乙醇提取液，攪拌均勻；再從第1個試管抽取3 mL液體注入第2個試管，以相同的方法進行到第9個試管，從而使前9個試管中樹莓乙醇提取液濃度逐步下降，且容量維持在3 mL 。再把這9個試管均加入300 μL細菌，第10個試管不加細菌，為無菌對照。細菌培養(yǎng)后，考察樹莓乙醇提取液最小抑菌濃度。

1.2.7 樹莓抑菌效果的影響因素 pH的影響：以NaOH改變培養(yǎng)基的pH，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，測量每一種細菌在樹莓乙醇提取物作用下的抑菌濃度最小值。

溫度的影響：取2 mL具有最小抑菌濃度的樹莓乙醇提取液注入三角瓶，每個三角瓶里分別加入200 μL每種菌種的菌懸液，分別在25、45、60、75 ℃水浴鍋中加熱30 min，測定每種被試菌種最小抑菌濃度的抑菌效果，測定溫度對樹莓乙醇提取物抑菌效果的影響。

時間的影響：以去離子水將樹莓乙醇提取物稀釋到所需的濃度，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種作為被試菌，測定不同濃度下的抑菌效果與作用時間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓乙醇提取物抑菌圈試驗結(jié)果

由表1樹莓乙醇提取物抑菌圈試驗數(shù)據(jù)可知，樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉4種被試菌種均有抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為明顯，抑菌圈直徑達到12.75 mm，而抑菌效果相對小些的黑曲霉抑菌圈直徑也達到了6.45 mm。對酵母、匍枝根霉及灰綠青霉則未測出顯著抑菌效果。

2.2 樹莓乙醇提取物最低抑菌濃度

由表2可知，樹莓乙醇提取物具有較為明顯的抑菌效果。測量得到對各類被試菌種的抑菌濃度最小值，對大腸桿菌的抑菌濃度最小值為0.16 mg/mL，對枯草芽孢桿菌的抑菌濃度最小值為0.16 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度最小值為0.34 mg/mL，對黑曲霉的抑菌濃度最小值為0.64 mg/mL。由綜合抑菌濃度最小值及表2可知，樹莓乙醇提取物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌效果較好，而對灰綠青霉的抑菌效果則較弱。

2.3 樹莓抑菌的影響因素

2.3.1 pH的影響 由表3可知，當pH≤6.0時，均未發(fā)現(xiàn)被試菌種，說明抑菌效果顯著；pH為7.0時，部分被試菌種（酵母、匍枝根霉、灰綠青霉）開始檢出，說明樹莓乙醇提取物抑菌活性開始降低；pH為9.0時，所有被試菌種均被測出，說明樹莓乙醇提取物抑菌活性顯著下降。因此樹莓乙醇提取物抑菌活性在pH≤6.0時更容易發(fā)揮。

2.3.2 溫度的影響 由表4可知，當溫度從25 ℃升高到75 ℃過程中，溫度對樹莓抑菌并無明顯影響。故可知，溫度對樹莓乙醇提取物的抑菌效果無明顯影響。

2.3.3 時間的影響 選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種作為被試菌，測定不同濃度情況下抑菌效果與作用時間的關(guān)系。圖1、圖2和圖3分別是3種被試菌種的抑菌率測定結(jié)果，其中橫坐標表示樹莓乙醇提取物濃度（mg/mL），縱坐標表示抑菌率（%）。

由圖1-3數(shù)據(jù)可知，隨著作用時間的延長，樹莓乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌3種菌種抑菌率均有所提升，抑菌率與時間呈正相關(guān)。其中對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為顯著，在濃度相同的情況下，樹莓乙醇提取物對金葡菌抑菌率顯著高于其他2種被試菌種。

3 小結(jié)與討論

樹莓的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有比較顯著的抑菌效果，對黑曲霉抑菌效果一般，而對酵母、匍枝根霉、灰綠青霉則沒有明顯效果；同時證實在一定溫度范圍及pH范圍之內(nèi)（75 ℃范圍內(nèi)，pH 3.0～9.0），樹莓乙醇提取物的抑菌率與時間呈正相關(guān)；而在時間相同的情況下，樹莓乙醇提取物的抑菌率則與乙醇提取物濃度正相關(guān)。

基于植物的殺菌產(chǎn)品其主要成分均是復合抑菌成分，而作用的位點及機制也不盡相同，最大的優(yōu)勢是環(huán)保，是當前農(nóng)藥領(lǐng)域的研究熱點，本研究證明樹莓對各類細菌具有抑制效果，能夠在天然抑菌產(chǎn)品中發(fā)揮作用，發(fā)展前景可期，可以為植物殺菌產(chǎn)品的研發(fā)制作提供借鑒。

同時由于天然植物的無公害農(nóng)藥的抑菌機理目前仍然處于初級研究階段，沒有系統(tǒng)的研究成果，研究的方式和方法尚需進一步探索，也需要其他相關(guān)學科進行互補，以獲取進一步的成果。

參考文獻：

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