淀粉芽孢桿菌HAB—7對18株植物病原真菌的抑制作用

劉文波++秦春秀++熊燕紅++孫亮++林春花++繆衛(wèi)國++鄭服叢

摘 要 HAB-7是一株分離自豇豆根際土壤、具有較強抑菌作用的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。研究HAB-7對18株植物病原真菌及其發(fā)酵液粗提蛋白對植物病原的抑制作用，并測定其對番茄種子的促生作用。采用平板對峙法測定其對18株植物病原真菌的抑制活性，以橡膠樹炭疽菌為指示菌，對其發(fā)酵上清液經(jīng)60%、80%硫酸銨鹽析獲得的抗菌粗蛋白進行測試；并將HAB-7菌液稀釋成6個濃度梯度，分別用來對番茄種子進行促生測試。結(jié)果顯示：HAB-7對18株植物病原真菌的平均抑菌率為61.03%；其發(fā)酵上清液對橡膠樹炭疽病菌的抑制率為56.80%，80%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭疽病菌的抑制率為38.88%；10-4 CFU/mL的HAB-7菌液濃度促進了番茄種子胚根的伸長，長度比CK提高67.76%。HAB-7菌株對植物病原菌有較廣譜的抑菌活性，其分泌的活性物質(zhì)除了活性蛋白外，可能還有其他的活性物質(zhì)，低濃度的HAB-7菌液能促進植物根系生長。本研究結(jié)果為后續(xù)研究其致病機理起到重要的作用。

關(guān)鍵詞 解淀粉芽孢桿菌 ；抑菌活性 ；抑真菌蛋白 ；促生作用

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.013

Analysis of Antifungal Activity of Bacillus amyloliquefaciens

HAB-7 Against 18 Phytopathogens

LIU Wenbo1） QIN Chunxiu1） XIONG Yanhong1）

SUN Liang2） LIN Chunhua1） MIU Weiguo1） ZHENG Fucong1）

（1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/

College of Environment and Plant Protection，Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China；

2 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737，China）

Abstract HAB-7 is a strain of Bacillus amyloliquefaciens isolated from the rhizosphere of Vigna unguiculata and has a strong inhibitory effect on phytopathogen. The strain HAB-7 was tested against 18 phytopathogenic fungi， and the crude protein extracted from the fermented HAB-7 was also tested against the phytopathogens to observe their inhibitory activities. The tomato seeds were treated with the strain HAB-7 to observe their germination and growth. Dural culture assay was used to test the antibacterial activity of HAB-7 against 18 plant pathogens. The antifungal crude protein extracted from the supernatant of fermented HAB-7 via precipitation of 60% or 80% ammonium sulfate was tested against the fungi of rubber anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides Penz. CGR-1 strain which was used as an indicator pathogen. The HAB-7 was diluted into 6 different concentrations， with which tomato seeds were treated to observe their germination and growth. The HAB-7 had an average inhibition rate of 61.03% against the 18 fungi； the supernatant of the fermented HAB-7 inhibited 56.80% of C. gloeosporioides； the crude protein of HAB-7 extracted via 80% ammonium sulfate precipitation also inhibited 38.88% of C. gloeosporioides. HAB-7 bacterial suspension at 1×104 CFU/mL improved the radical growth of the tomato seeds， 67.76% longer than the control. The HAB-7 displayed a broad-spectrum antagonistic activity， and its secreted antagonistic active substance contained antifungal protein and probably other active substances since HAB-7 bacterial liquid at a low concentration promoted plant root growth. This study plays an important role in follow-up study about its pathogenicity.

Keywords Bacillus amyloliquefaciens ； antifungal activity； antifungal protein； growth promotion

芽孢桿菌屬（Bacillus spp）中，許多菌株能抑制植物病原菌，部分能促進植物生長[1]，有些菌株兩種功能同時兼有。目前研究的芽孢桿菌中具有抑菌活性的主要有：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）、萎縮芽孢桿菌（B. atropheaus）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）等[2-6]。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）在其生長過程中，可以產(chǎn)生抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量的胞外代謝活性物質(zhì)，能很好地抑制多種植物病原菌[7-8]，這些胞外物質(zhì)在防治植物病害中起著重要的作用[9]，有些菌株除了能防治病害還能促進植物生長[10]。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布廣，容易分離，大多分離自植物根系土壤附近[11]，對環(huán)境友好，且對人畜無毒，在環(huán)境中也不容易產(chǎn)生抗性[12-13]。由于分泌的抗菌蛋白對植物病原菌抑制機理特殊，不容易產(chǎn)生抗性，因而受到了國內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注[14]。

本實驗室從豇豆根際土壤中分離篩選到對植物病原真菌有較強拮抗作用的細菌HAB-7菌株，初步研究HAB-7菌株及其代謝產(chǎn)物對植物病原真菌的抑制效果，為今后進一步研究其抗菌機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細菌和真菌

供試細菌：HAB-7是本實驗室從豇豆根際土壤中分離獲得的一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

供試植物病原真菌（表1）為本實驗室分離鑒定后保存，均經(jīng)過單孢分離純化備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PBA培養(yǎng)基；優(yōu)化培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母粉30 g/L、胰蛋白胨40 g/L）。往以上培養(yǎng)基加入18 g/L瓊脂粉制即可作成固體培養(yǎng)基。其中PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)植物病原真菌。

1.2 方法

1.2.1 HAB-7對18株植物病原真菌的拮抗作用

將供試植物病原真菌接種至PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d；用打孔器在菌落邊緣打直徑0.4 cm的菌餅，將其接種到優(yōu)化培養(yǎng)基平板（9 cm）中央，在菌餅4個角等距離接種HAB-7菌株，以不接HAB-7菌株的培養(yǎng)基為對照，均置于28℃恒溫暗培養(yǎng)；待對照組菌落直徑生長至整個培養(yǎng)皿（9 cm）的三分之二時，測量植物病原真菌菌落直徑[15]，并測定HAB-7對供試病原真菌的拮抗作用。

抑制率=（對照組菌圈直徑-處理組菌圈直徑）/對照組菌圈直徑×100%

1.2.2 HAB-7發(fā)酵上清液及發(fā)酵液粗蛋白對植物病原真菌的抑制作用

（1）HAB-7發(fā)酵上清液對橡膠樹炭疽菌的抑制作用：將HAB-7接種到優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，置于 28℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72 h；取出后用高速冷凍離心機（eppendorf，5804R）以4℃、11 000 r/min離心30 min，取上清液；在超凈工作臺上，將上清液用細菌過濾器（Φ=0.22 μm）過濾除菌，把濾液存放在10 mL已滅菌的離心管中，于 4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。在PDA 培養(yǎng)基平板上，用打孔器打4個成等邊形的圓孔，在等邊形中心處接上 1 個橡膠樹炭疽菌菌餅，于28℃培養(yǎng)1 d后，將過濾除菌的胞外代謝物分別加到4個孔中，重復(fù)3次，將平板放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果并測量[15]。

（2）HAB-7發(fā)酵液粗蛋白對橡膠樹炭疽菌的抑制作用：將HAB-7接種于優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，置于 28℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72 h；取發(fā)酵液，用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心，取發(fā)酵上清液100.0 mL，緩緩地向上清液中加入固體硫酸銨至60%飽和度，于4℃靜止過夜；用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和沉淀。向收集的上清液中繼續(xù)加入固體硫酸銨，按照同樣的方法調(diào)節(jié)至80%硫酸銨飽和度，收集沉淀蛋白；用適量的10.0 mmol/L、pH 7.0 的磷酸緩沖液（PBS）溶解，裝入透析袋中，用相同濃度的PBS緩沖液透析過夜；用高速冷凍離心機以4℃、11 000 r/min離心透析液20 min，棄沉淀，將上清液過濾除菌，稀釋成相同的濃度，接種方法同（1）。

1.2.3 HAB-7對番茄種子的促生作用

用75%酒精浸泡番茄種子15 s，再將種子用3%的NaClO消毒30 min，最后用無菌水漂洗6次；將HAB-7菌液分別稀釋成0倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍的菌懸液，分別取菌懸液和無菌水各5 mL，存放在10 mL的離心管中；分別將處理過的30粒番茄種子放入上述不同濃度的稀釋液中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后取出，用無菌水清洗番茄種子6遍；將每個處理的番茄種子整齊地擺放在無菌的培養(yǎng)皿中，往培養(yǎng)皿中加入少量無菌水，每個培養(yǎng)皿放入6粒番茄種子，置于4℃冰箱72 h，再放入28℃光照培養(yǎng)箱光暗交替培養(yǎng)5 d。每個處理組3次重復(fù)，記錄番茄種子根的長度[16-17]，以無菌水處理為對照（CK）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌作用測定

采用平板對峙法培養(yǎng)后，HAB-7對18株植物病原真菌的抑菌作用見圖1。通過計算得出HAB-7對18株植物病原真菌的平均抑菌率為61.03%，并在0.05及0.01的水平上差異均顯著，表明其對18株植物病原真菌的抑菌率存在差異，具有很好的抑菌潛力；對病原菌抑菌率最高的真菌是CGR-1（70.13%），最低的是COC-1（50.22%）（圖2，表2）。同一種病原菌，來源不同，HAB-7對其抑制率也不相同，可能跟其抗藥性及致病性有關(guān)。

2.2 HAB-7發(fā)酵上清液對病原真菌的影響

HAB-7發(fā)酵上清液對橡膠樹炭疽病菌有明顯的抑制作用（圖3），經(jīng)計算可知其抑制率為56.80%。初步推測HAB-7發(fā)酵上清液中可能含有某些活性物質(zhì)（抗菌蛋白、多肽或者一些低分子量抗生素等），其抑菌活性跟HAB-7菌株直接作用相當，說明HAB-7菌株主要是靠分泌活性物質(zhì)來抑制病原菌菌絲的生長。

2.3 HAB-7粗蛋白對橡膠樹炭疽病菌的影響

HAB-7的80%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭疽病的抑制率可達42.88%；60%硫酸銨粗提蛋白對橡膠樹炭病菌無抑菌活性，在后期能被真菌菌絲全部覆蓋?。▓D4）。在80%硫酸銨高濃度提取下，所得粗蛋白才對橡膠樹炭疽病菌具有強烈的抑制效果，可知沉淀蛋白中含有抗菌活性蛋白，但含量可能少，其平均抑制率僅為38.88%，比其上清液的抑制率少17.92%。說明HAB-7菌株的發(fā)酵上清液中，除了抗菌蛋白，還有其他的活性物質(zhì)抑制了植物病原真菌的生長。

2.4 HAB-7對番茄種子的促生作用

從圖5可知，用10-4 CFU/mL的稀釋菌液處理的番茄種子，其促生效果比以無菌水作對照（CK）的好。高濃度（10-2、10-1、原液）對番茄種子的胚根伸長具有一定的抑制作用，其它經(jīng)稀釋的菌液對番茄種子胚根都具有一定的伸長作用，尤其是在10-4 CFU/mL菌液濃度下，胚根長度與CK相比差異達到極顯著水平，提高了67.76%（圖6，表3），可見在此條件下，促生作用最為強烈，說明HAB-7的分泌物中存在對植物具有促生作用的物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布比較廣，是一種重要的生防資源，對植物病原真菌或植物病原細菌能產(chǎn)生抑制作用[18]。本研究結(jié)果顯示，HAB-7菌株對供試的18株植物病原真菌（主要是半知菌類）都有明顯的抑制作用，平均抑菌率為61.03%，表明HAB-7菌株對半知菌類植物病原真菌具有抑制作用，且具有較強的次生代謝物產(chǎn)生能力，能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)[19]。解淀粉芽孢桿菌易于發(fā)酵， 且會將抑真菌蛋白分泌到胞外，抑真菌蛋白又具有性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性等優(yōu)點[20]。利用最優(yōu)培養(yǎng)基（另文發(fā)表）培養(yǎng)HAB-7菌株，將其發(fā)酵上清液及80%硫酸銨沉淀蛋白與橡膠樹炭疽病菌進行對峙培養(yǎng)，結(jié)果顯示，上清液的抑制效果比粗提蛋白抑制效果提高了17.82%，表明發(fā)酵上清液中除了少量的抑菌蛋白，還有其他抑制病原菌的活性物質(zhì)。芽孢桿菌的細胞膜上，有3種類型的蛋白泌出通道，能分泌出不同種類及大小的蛋白[21]；其分泌的抗菌蛋白和活性蛋白與環(huán)境和培養(yǎng)條件有關(guān)[22]。番茄種子發(fā)芽實驗表明，高濃度的HAB-7能抑制番茄種子的萌發(fā)生長；在10-4 CFU/mL濃度下平均根長比CK長45.92 mm，促生效果明顯。說明HAB-7菌株的次級代謝產(chǎn)物中含有一類植物激素類物質(zhì)，可促進植物的生長，但是具體哪類物質(zhì)還需進一步研究。

近年來，拮抗芽孢桿菌的篩選研究工作開展得較多，研究者也甚多[23]。目前的許多研究都僅僅停留在實驗室階段，真正分離純化得到的活性物質(zhì)尚達不到要求或穩(wěn)定性較差[24]。雖然很多的芽孢桿菌已經(jīng)獲得農(nóng)藥登記許可證[25]，但是還有很多只能在實驗室條件下才能表現(xiàn)出良好的抑菌活性，而在大田條件下，由于環(huán)境條件的改變，許多拮抗微生物不能很好地適應(yīng)田間微環(huán)境，因此無法快速地生長繁殖，從而難以發(fā)揮抑菌作用。提高生防菌在田間葉片及根際的快速繁殖能力，是研究者需要考慮并解決的問題。

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① 基金項目：2015年海南省自然科學(xué)基金（No.20153131）；海南省產(chǎn)學(xué)研項目（No.CXY20140038）；國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（No.CARS-34-GW8）；農(nóng)業(yè)部2013年熱作農(nóng)技推廣與體系建設(shè)項目（No.13RZNJ-20）。

收稿日期：2016-10-12；責(zé)任編輯/林海妹；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 劉文波（1978～），男，碩士，主要研究方向為從事熱帶植物病理，E-mail：saucher@163.com。

③ 通訊作者：繆衛(wèi)國（1969～），男，博士，教授，主要研究方向為分子植物病理等，E-mail： weiguomiao1105@126.com；

鄭服叢（1956～），男，教授，主要研究方向為植物病理學(xué)，E-mail： zhengfucong@126.com。