彝醫(yī)藥防疫古方的核心成分青蒿素和槲皮素抑制新冠病毒刺突蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯

吳偉 吳俊汐 紀(jì)旭旭 劉戟 劉彬 耿福昌

摘要：目的 研究青蒿素和槲皮素單用或聯(lián)合使用是否可以通過(guò)抑制刺突蛋白（spike protein， S）的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)治療新冠病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）。方法 采用梯度濃度的青蒿素或槲皮素處理Vero E6細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定；采用新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）的S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞，而后采用青蒿素或槲皮素單獨(dú)或聯(lián)合處理，以檢測(cè)S蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平。結(jié)果 青蒿素或槲皮素處理可以顯著降低SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01， P<0.05），并且，20 ?mol/L或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥能夠更為顯著地降低S蛋白的蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 單獨(dú)和聯(lián)合使用青蒿素和槲皮素均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。

關(guān)鍵詞：青蒿素；槲皮素；SARS-CoV-2；刺突蛋白；轉(zhuǎn)染；基因轉(zhuǎn)錄；蛋白翻譯；彝族藥物

中圖分類(lèi)號(hào)：R966文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Artemisinin and quercetin， the core components of the ancient prescriptions for epidemic prevention of Yi medicine， inhibit the transcription and translation of SARS-COV-2 spike protein

Wu Wei1，2，3.4， Wu Junxi5， Ji Xuxu3， Liu Ji3， Liu Bin2， and Geng Fuchang2

（1 Research Institute of Medicine and Herbs of Yi Nationality & Gastroenterology Department， Liangshan Prefecture Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Xichang 615000; 2 Good Doctor Pharmaceutical Group Co.，Ltd. Chengdu 610073; 3 Department of Biochemistry and Molecular Biology， West China School of Basic Medical Science and Forensic Medicine， Sichuan University， Chengdu 610041; 4 Remeadjohn Technology Co.， Ltd.， Chengdu 610044; 5 School of Medical and Life Science， Chengdu University of TCM， Chengdu 610000）

Abstract Objective To investigate whether the single or combined treatments with artemisinin and quercetin can improve corona virus disease 2019 （COVID-19） via inhibiting the transcription and translation of spike protein （S）. Methods Vero E6 cells were treated with artemisinin or quercetin in gradient concentration， and the cell viability was determined. Vero E6 cells were transfected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS CoV-2） S gene plasmid， and then treated with artemisinin or quercetin alone or combined to detect the level of the gene transcription and protein translation of S protein. Results The treatments with artemisinin or quercetin could significantly reduce the expression levels of mRNA and protein of S protein in Vero-E6 cells after transfected with SARS CoV-2 S gene plasmid， and the difference was statistically significant（P<0.01， P<0.05）. In addition， the combined treatment of 20 or 200 ?mol/L artemisinin and 50 ?g/mL quercetin could significantly more decreased the protein expression level of S protein compared to the single treatments， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The single or combined treatments with artemisinin and quercetin can effectively inhibit the gene transcription and protein translation of SARS-CoV-2 S protein.

Key words Artemisinin; Quereetin; SARS-CoV-2; Spike protein; Transfection; Gene transcription; Protein translation; Medicine and Herbs of Yi Nationality

世界衛(wèi)生組織于2023年2月發(fā)布的最新數(shù)據(jù)表明，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒感染（coronavirus disease-2019， COVID-19）大流行已在全球范圍內(nèi)造成7.55億確診病例感染，680多萬(wàn)死亡[1]。目前，SARS-CoV-2已衍生出多種變體，包括奧密克戎變體，它是一種嚴(yán)重變異的病毒，具有極高的感染風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前的新型冠狀病毒感染疫苗能否有效預(yù)防這些新菌株仍在調(diào)查中[3]。鑒于此，一些國(guó)家在預(yù)防和抗擊新型冠狀病毒感染的健康指南中也納入了替代療法[4]。天然產(chǎn)物中的化合物具有廣泛的生物和治療特性，對(duì)新型冠狀病毒感染具有潛在的預(yù)防和治療作用[5]。尋求有效且容易獲得的天然產(chǎn)品或化合物作為新型冠狀病毒感染的替代和補(bǔ)充藥物，可能有助于降低發(fā)病率、住院率、疾病嚴(yán)重程度和死亡率。

新冠病毒進(jìn)入細(xì)胞由病毒表面錨定的刺突蛋白（S蛋白）介導(dǎo)，該蛋白具有明顯的β屬冠狀病毒S蛋白特性，S1亞基發(fā)揮與受體識(shí)別和結(jié)合的功能，S2亞基參與膜融合過(guò)程[6]。冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是病毒感染性和發(fā)病機(jī)制的重要決定因素，也是宿主免疫監(jiān)視的主要目標(biāo)[7]。因此，S蛋白成為了臨床治療新冠病毒感染藥物以及疫苗研制傾向選擇的靶點(diǎn)。

據(jù)彝醫(yī)藥古籍《聶蘇諾期》記載，中國(guó)有一種古老的彝族醫(yī)藥防疫藥方。彝族醫(yī)藥采用該熏蒸法防治流行性傳染病，至今仍經(jīng)常使用[8]。該方劑主要藥材是青蒿（ARTEMIAE ANNUAE HERBA）和側(cè)柏葉（PLATYCLADI CACUMEN）。青蒿素 （artemisinin， A） 是青蒿中一種具有過(guò)氧化物部分的倍半萜內(nèi)酯[9]，研究發(fā)現(xiàn)青蒿素在Vero E6細(xì)胞中測(cè)定的預(yù)處理或后處理抗SARS-CoV-2測(cè)定中顯示出優(yōu)異的效果（選擇性指數(shù)分別為35或54）[10]。槲皮素 （quercetin， Q） 是側(cè)柏葉中的一種黃酮類(lèi)化合物，經(jīng)常用作檢測(cè)6種黃酮類(lèi)化合物的內(nèi)部參照物[11]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在VeroE6細(xì)胞中測(cè)定的抗SARS-CoV-2測(cè)定中也顯示出良好的效果（選擇性指數(shù)=39.81）[12]。

綜上，本文旨在研究青蒿素和槲皮素單用或聯(lián)合使用是否可以通過(guò)抑制S蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯來(lái)減輕新冠病毒感染癥狀。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品和試劑

Vero E6非洲綠猴腎細(xì)胞購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；青蒿素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；槲皮素購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bimake生物科技有限公司；GAPDH單克隆鼠抗和SARS-CoV-2 spike protein單克隆鼠抗購(gòu)自Cell signaling公司；SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒和pUC57質(zhì)粒購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、HisScript? III 1st Strand cDNA合成試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、雙色SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、蛋白酶抑制劑PMSF、DEPC水（DNase、RNase free）、Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NEWZERUM標(biāo)準(zhǔn)級(jí)胎牛血清購(gòu)于新西蘭Newzerum公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將含有1 mL Vero E6細(xì)胞懸液凍存管在37℃水浴中快速搖晃解凍，加4 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基混合均勻；在1000 r/min條件下離心4 min，棄去上清液，加1～2 mL培養(yǎng)基后用槍輕輕吹打混勻；將Vero E6細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板， 在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；Vero E6細(xì)胞密度達(dá)80%～90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將pUC57質(zhì)粒轉(zhuǎn)染設(shè)為NC組，SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒設(shè)為SARS-COV-2 S組。轉(zhuǎn)染前1～2 d，將細(xì)胞以適宜密度接種到96孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到約70%～90%；將孔內(nèi)培養(yǎng)基更換為新鮮含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；取兩個(gè)潔凈無(wú)菌離心管，分別加入對(duì)應(yīng)體積無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，然后于其中一管加入質(zhì)粒DNA，另一管加入Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑，并用槍輕輕吹打混勻；室溫靜置5 min后，將含有質(zhì)粒DNA的培養(yǎng)液用槍輕輕加入含Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻；室溫靜置5 min后，均勻滴加到整個(gè)孔內(nèi)，隨后輕輕混勻；繼續(xù)培養(yǎng)約24～48 h后，提取RNA及蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

將細(xì)胞以適宜密度接種到96孔板內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到約70%～90%；吸出96孔板孔內(nèi)的培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗細(xì)胞；而后使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基和CCK8溶液配置反應(yīng)液（比例為10：1），混合均勻后，每孔加入100 μL反應(yīng)液，并設(shè)置空白未鋪細(xì)胞對(duì)照孔加入100 μL反應(yīng)液，放置于37 ℃和5%CO2恒溫箱內(nèi)孵育1 h；在450 nm處測(cè)量吸光度。

1.5 Western Blot

從pUC57質(zhì)粒和SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Vero E6細(xì)胞中提取所有蛋白。使用BCA試劑定量蛋白質(zhì)裂解物。蛋白質(zhì)通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS–PAGE）分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜（0.45 μm NC）上，然后室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃下用特異性一級(jí)抗體進(jìn)行免疫印跡過(guò)夜，使用HRP結(jié)合的二級(jí)抗體在室溫下孵育1 h。使用高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

1.6 qPCR檢測(cè)S-蛋白基因表達(dá)

使用TRIzol從pUC57質(zhì)粒和SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Vero E6細(xì)胞中提取RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用Primer BLAST軟件設(shè)計(jì)S蛋白的特異性正向和反向引物，參見(jiàn)表1。而后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行絕對(duì)定量分析。數(shù)據(jù)顯示為對(duì)照組的平均折疊變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過(guò)GraphPad Prism 7.0進(jìn)行，計(jì)量資料以（x±s）兩組比較均采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿素與槲皮素對(duì)Vero E6細(xì)胞活力的影響

采用青蒿素（0、5、10、20、50、100、150、200、300、500 ?mol/L）和槲皮素（0、3、5、6.25、12.5、25、50、100、150、200 ?g/mL）分別與Vero E6細(xì)胞在7 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)條件下共孵育24 h，而后使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性。如圖1所示，結(jié)果如下，與對(duì)照組（0 ?moL/L的青蒿素或0 ?g/mL的槲皮素）比較，青蒿素在小于500 ?moL/L的濃度范圍內(nèi)以及槲皮素在小于200 ?g/mL的濃度范圍內(nèi)并不能誘導(dǎo)Vero E6細(xì)胞細(xì)胞活力的顯著性下降（P>0.05）。青蒿素在小于500 ?moL/L的濃度范圍內(nèi)以及槲皮素在小于200 ?g/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)Vero E6細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)Vero E6細(xì)胞毒性作用

將預(yù)先鋪設(shè)在96孔板中的Vero E6細(xì)胞分為4組：①對(duì)照組; ②Lipo6000?組（Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑）; ③NC組（pUC57質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）; ④SARS-CoV-2 S組（SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染），使用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果如下，與對(duì)照組比較，Lipo6000?組、NC組和SARS-CoV-2 S組的細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異（P>0.05），參見(jiàn)圖2，證明pUC57質(zhì)粒和SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以及Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑對(duì)Vero E6細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。

2.3 SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)

將預(yù)先鋪設(shè)在96孔板中的Vero E6細(xì)胞分為2組：NC組（pUC57質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和SARS-CoV-2 S組（SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染24 h后，分別提取細(xì)胞RNA和蛋白，采用qPCR和Western Blot檢測(cè)mRNA與蛋白的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，與NC組比較，SARS-CoV-2 S組的S蛋白mRNA表達(dá)水平增加了4.8倍（P<0.01），蛋白表達(dá)水平增加了2.7倍（P<0.001），參見(jiàn)圖3，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功且能在Vero E6細(xì)胞中順利表達(dá)。

2.4 青蒿素或槲皮素單獨(dú)使用對(duì)SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用

為研究青蒿素對(duì)SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，實(shí)施步驟如下：①將SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鋪設(shè)于96孔板中的Vero E6細(xì)胞中；②將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（青蒿素0 ?mol/L濃度組）、青蒿素5 ?mol/L濃度組、青蒿素20 ?mol/L濃度組、青蒿素50 ?mol/L濃度組、青蒿素100 ?mol/L濃度組和青蒿素200 ?mol/L濃度組；③將步驟B設(shè)定的處理藥物分別加入孔內(nèi)與細(xì)胞共孵育24 h；④提取細(xì)胞RNA和蛋白，并進(jìn)行qPCR和Western Blot檢測(cè)。

結(jié)果表明：①與對(duì)照組比較，其他濃度組的青蒿素均誘導(dǎo)了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著性下調(diào)（P<0.05，P<0.01）；②與5、50和100 ?mol/L濃度組比較，20和200 ?mol/L濃度的青蒿素能夠更為顯著地誘導(dǎo)SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），抑制率達(dá)到80%；③與對(duì)照組比較，20和200?mol/L濃度的青蒿素誘導(dǎo)了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表達(dá)水平的顯著性下調(diào)（P<0.05）。

為研究槲皮素對(duì)SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：①對(duì)照組（槲皮素0濃度組）， ②槲皮素6.25 ?g/mL濃度組， ③槲皮素12.5 ?g/mL濃度組， ④槲皮素25 ?g/mL濃度組， ⑤槲皮素50 ?g/mL濃度組， ⑥槲皮素100 ?g/mL濃度組；其他實(shí)施步驟參照“2.4”。結(jié)果如下：①與對(duì)照組比較，除12.5 ?g/mL濃度組外，其他濃度組的槲皮素均誘導(dǎo)了SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達(dá)水平的顯著性下調(diào)（P<0.05，P<0.01）；②與6.25、25和100 ?g/mL濃度組比較，50 ?g/mL濃度的槲皮素能夠更為顯著地誘導(dǎo)SARS-CoV-2 S蛋白的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），抑制率達(dá)到60%；③與對(duì)照組比較，50 ?g/mL濃度的槲皮素誘導(dǎo)了SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA表達(dá)水平的顯著性下調(diào)（P<0.001）。

2.5 青蒿素與槲皮素聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥對(duì)SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的蛋白表達(dá)的抑制作用比較

為探討青蒿素與槲皮素聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥對(duì)SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的蛋白表達(dá)的抑制作用比較，步驟如下：①根據(jù)本研究“2.4”部分的研究結(jié)果，選擇20、200 ?mol/L濃度的青蒿素及50 ?g/mL濃度的槲皮素作為干預(yù)藥物；②將SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鋪設(shè)于96孔板中的Vero E6細(xì)胞中；③將細(xì)胞隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（青蒿素和槲皮素濃度均為0）、青蒿素（20 ?mol/L）組、青蒿素（200 ?mol/L）組、槲皮素（50 ?g/mL）組、青蒿素（20 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）組、青蒿素（200 ?mol/L）+槲皮素（50 ?g/mL）組；④將步驟C設(shè)定的干預(yù)藥物分別加入孔內(nèi)與細(xì)胞共孵育24 h；⑤提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

結(jié)果如下：①與對(duì)照組比較，其他各組的S蛋白的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P<0.05）；②20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥能夠更為顯著地下調(diào)S蛋白的蛋白表達(dá)水平（P<0.05），參見(jiàn)圖6， 證明20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥能夠更為有效地抑制SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Vero E6細(xì)胞內(nèi)S蛋白的蛋白表達(dá)。

3 討論

有效地控制新冠病毒基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制表達(dá)過(guò)程，是控制新冠病毒傳播的重要環(huán)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)青蒿素（<500 ?mol/L）和槲皮素（<200 ?g/mL）以及SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)Vero E6細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性作用。SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，S蛋白的基因在Vero E6細(xì)胞內(nèi)成功地進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。而后，使用彝藥防疫古方的核心組分青蒿素和槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)染SARS-CoV-2 S基因質(zhì)粒后的細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)青蒿素與槲皮素單獨(dú)用藥在部分濃度對(duì)S蛋白的基因表達(dá)和蛋白翻譯有著顯著的抑制作用，且20或200 ?mol/L的青蒿素與50 ?g/mL的槲皮素聯(lián)合用藥的抑制效果顯著優(yōu)于單獨(dú)用藥。以上證據(jù)表明：彝藥防疫古方的核心組分青蒿素和槲皮素單獨(dú)和聯(lián)合使用均能有效地抑制SARS-CoV-2 S蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。

參 考 文 獻(xiàn)

https：//www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019.

Araf Y， Akter F， Tang Y D， et al. Omicron variant of SARS-CoV-2： Genomics， transmissibility， and responses to current COVID-19 vaccines[J]. J Med Virol， 2022， 94（5）： 1825-1832.

Ferré V M， Peiffer-Smadja N， Visseaux B， et al. Omicron SARS-CoV-2 variant： What we know and what we don't[J]. Anaesth Crit Care Pain Med， 2022，? 41（1）： 100998.

Afroz S， Fairuz S， Joty J A， et al. Virtual screening of functional foods and dissecting their roles in modulating gene functions to support post COVID-19 complications[J]. J Food Biochem， 2021， 45（12）： e13961.

He Y Q， Zhou C C， Yu L Y， et al. Natural product derived phytochemicals in managing acute lung injury by multiple mechanisms[J]. Pharmacol Res， 2021， 163： 105224.

Xia X. Domains and functions of spike protein in Sars-Cov-2 in the context of vaccine design[J]. Viruses， 2021， 14， 13（1）： 109.

Sallenave J M， Guillot L. Innate immune signaling and proteolytic pathways in the resolution or exacerbation of SARS-CoV-2 in Covid-19： Key therapeutic targets[J]？ Front Immunol， 2020， 28， 11： 1229.

張吉仲，降擁彭措（噶布）， 納順達(dá)來(lái)， 等. 民族醫(yī)藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的認(rèn)識(shí)及防治措施[J]. 中草藥， 2020， 51（6）： 1463-1475.

劉俊婉， 謝夢(mèng)玥. 基于Citespace的青蒿素文獻(xiàn)可視化分析[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2016， 41（10）： 735-741.

Zhou Y， Gilmore K， Ramirez S， et al. In vitro efficacy of artemisinin-based treatments against SARS-CoV-2[J]. Sci Rep，? 2021， 16， 11（1）： 14571.

石典花， 戴衍朋， 蘇本正， 等. 基于一測(cè)多評(píng)和色度識(shí)別的側(cè)柏炭?jī)?nèi)外在質(zhì)控方法研究[J].中國(guó)中藥雜志， 2020， 45（24）： 5996-6002.

Yi L， Li Z， Yuan K， et al. Small molecules blocking the entry of severe acute respiratory syndrome coronavirus into host cells[J].? J Virol， 2004，? 78（20）： 11334-11339.

Zhang J Z， Chen X Y， Wu Y J， et al. Identification of active compounds from Yi Nationality herbal formula Wosi influencing COX-2 and VCAM-1 signaling[J]. Front Pharmacol， 2020， 11： 568-585.