短乳桿菌天然質(zhì)粒分類

孫大慶，李洪飛，楊 健，宋大巍,3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 牡丹江食品與生物技術(shù)創(chuàng)新研究院，黑龍江 牡丹江 157000；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

短乳桿菌是乳桿菌屬重要的菌種之一，它們廣泛分布于植物、動物及人體多種復(fù)雜環(huán)境中，是乳桿菌中環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)的菌種之一。短乳桿菌具有發(fā)酵能力強(qiáng)、耐酸、產(chǎn)細(xì)菌素等多種優(yōu)良表型[1-3]，至今已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)，與人們飲食、衛(wèi)生和健康息息相關(guān)[4-6]，因此開展短乳桿菌相關(guān)研究具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會應(yīng)用價(jià)值。

目前，NCBI的Genome數(shù)據(jù)庫已收錄60 個短乳桿菌天然質(zhì)粒基因組序列，從質(zhì)粒大小、數(shù)量和復(fù)制類型而言，短乳桿菌是乳桿菌屬中攜帶天然質(zhì)粒最豐富的菌種之一[7]，這一現(xiàn)象表明，質(zhì)粒在短乳桿菌生長、代謝、遺傳和進(jìn)化等生物學(xué)過程中可能扮演著特殊且重要的角色，此外，眾多天然質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和測定為短乳桿菌基因工程改造和生物技術(shù)應(yīng)用提供了必要的研究和材料基礎(chǔ)。然而，目前對短乳桿菌天然質(zhì)粒的了解和研究比較有限，現(xiàn)有研究主要集中于載體構(gòu)建[8-10]和特殊功能質(zhì)粒[11-12]。本研究以短乳桿菌天然質(zhì)粒為研究對象，在原有質(zhì)粒復(fù)制起始蛋白（replication initiation protein，Rep）進(jìn)化樹分類方法[13-14]基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)?；蚪M共線性分析方法，探索建立一種更加準(zhǔn)確、有效的天然質(zhì)粒的分類方法，從而為今后短乳桿菌天然質(zhì)粒的科學(xué)分類和理性應(yīng)用提供有益的探索和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)?；蚪M數(shù)據(jù)來源

短乳桿菌質(zhì)粒基因組由NCBI Genome數(shù)據(jù)庫下載獲得，質(zhì)粒詳細(xì)信息見表1。質(zhì)粒pC194、pMV158、pUCL287基因組登錄號分別為NC_002013.1、NC_010096.1、X75607.1。質(zhì)粒pAD1和pIP501基因組序列來自文獻(xiàn)[15-16]。

表1 短乳桿菌質(zhì)粒信息Table 1 Information about plasmids in Lactobacillus brevis

1.2 質(zhì)?；蚪M序列的收集、整理和初步分析

篩查Genome數(shù)據(jù)庫中所有短乳桿菌質(zhì)?；蚪M序列完整性和每個質(zhì)粒Rep編碼情況，對注釋或疑似的Rep進(jìn)行BLAST比對分析，鑒定其保守結(jié)構(gòu)域，確定其所屬蛋白家族。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹構(gòu)建及分類

利用MEGA 6.0軟件[17]中Muscle法進(jìn)行Rep氨基酸多序列比對，之后利用Neighbor-Joining法進(jìn)行質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹構(gòu)建。進(jìn)化樹檢驗(yàn)采用Bootstrap法進(jìn)行，自展值設(shè)定為1 000。

1.3.2 質(zhì)?；蚪M共線性分析及分類

利用Mauve 2.4.0軟件[18]進(jìn)行質(zhì)?；蚪M共線性分析，所有參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。DNA多序列對比分析利用DNAMAN 5.2.2軟件進(jìn)行。DNA重復(fù)序列分析利用DNASTAR 7.1.0 GeneQuest軟件包進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)?；蚪M基本特征

表2 短乳桿菌質(zhì)?；蚪M和Rep基本特征Table 2 Basic characteristics of plasmid genome and Rep in Lactobacillus brevis

經(jīng)檢索、比對和統(tǒng)計(jì)分析，Genome數(shù)據(jù)庫收錄的60 個質(zhì)粒，有9 個質(zhì)?；蚪M序列不完整或存在拼接錯誤，其余51 個質(zhì)粒為完整基因組序列，完整質(zhì)?；蚪M特征及編碼Rep情況見表2。由表2可知，短乳桿菌51 個完整質(zhì)?；蚪M大小為1.81～107.03 kb，GC含量為34.40%～45.63%，其中39 個質(zhì)粒編碼了Rep，35 個質(zhì)粒含有1 個Rep（質(zhì)粒pRH45II的Rep為本研究推定），4 個質(zhì)粒含有2 個Rep，12 個質(zhì)粒不含有已知Rep。根據(jù)Rep含有的保守結(jié)構(gòu)域，所有Rep可劃分為5 個Rep蛋白家族（表1）。

2.2 質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹分類

圖1 短乳桿菌質(zhì)粒Rep氨基酸序列進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of plasmid Rep in Lactobacillus brevis

基于Rep氨基酸序列同源性，構(gòu)建了短乳桿菌質(zhì)粒和5 個蛋白家族參考質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹（圖1）。進(jìn)化樹沒有包括假基因編碼和推定的Rep，這些質(zhì)粒將在后文論述。由圖1可以看出，短乳桿菌34 個質(zhì)粒編碼的38 個Rep和5 個參考質(zhì)粒編碼的Rep，根據(jù)各自含有的保守結(jié)構(gòu)域不同，能夠明顯聚類為5 個不同的質(zhì)粒家族，因此短乳桿菌30 個含有1 個Rep質(zhì)粒可以有效地劃分為5 個類型，即5 個質(zhì)粒家族。

家族3質(zhì)粒pl12108-8和pl12111-4的Rep（WP085769753.1和ARN96593.1）雖然都含有Rep_3家族蛋白共有的保守結(jié)構(gòu)域（pfam01051），但它們與該家族其他質(zhì)粒Rep存在很遠(yuǎn)的進(jìn)化距離和較低的自展值（40），進(jìn)一步序列比對發(fā)現(xiàn)，這2 個Rep不僅序列較短，而且與該家族其他質(zhì)粒Rep序列一致性較低，因此將家族3質(zhì)粒劃分為2 個分類亞家族。

由圖1可以看出，短乳桿菌4 個復(fù)合質(zhì)粒（2 個及以上復(fù)制子融合形成的質(zhì)粒）的8 個Rep與各自同源Rep明顯聚類。復(fù)合質(zhì)粒pl12108-2和pl12111-2含有2 個家族5 Rep，且聚類在一個分支的2 個Rep氨基酸序列一致性均為100%，這表明兩個復(fù)合質(zhì)粒由2 個不同的家族5質(zhì)粒融合形成，它們具有非常近的進(jìn)化關(guān)系，由于融合前兩個質(zhì)粒都屬于家族5，因此這兩個復(fù)合質(zhì)粒也屬于家族5。由于復(fù)合質(zhì)粒pL747-2和pl12111-4分別含有1 個家族3 Rep和1 個家族4 Rep，因此它們不能簡單歸屬于一個家族，只能暫時歸屬于兩個家族（家族3和4）。

綜上可知，根據(jù)Rep進(jìn)化樹，32 個短乳桿菌質(zhì)?？梢苑诸悶? 個不同的質(zhì)粒家族，2 個復(fù)合質(zhì)粒pL747-2和pl12111-4同時歸屬于家族3和家族4，由參考質(zhì)?？芍易?和2質(zhì)粒屬于滾環(huán)型復(fù)制質(zhì)粒，家族3～5屬于theta型復(fù)制質(zhì)粒。

2.3 質(zhì)粒基因組共線性分類

復(fù)制子是質(zhì)粒復(fù)制和生存必不可少的保守區(qū)域，因此本實(shí)驗(yàn)利用基因組共線性分析結(jié)果進(jìn)行質(zhì)粒分類時，將是否具有同源性復(fù)制子作為分類的優(yōu)先原則，其次根據(jù)質(zhì)?；蚪M共線性程度大小進(jìn)行分類。根據(jù)質(zhì)?；蚪M的同源性和差異性，對短乳桿菌所有51 個質(zhì)粒進(jìn)行了基因組共線性分析，并按照上述分類原則進(jìn)行質(zhì)粒分類，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族1含有3 個成員，它們都含有RCR質(zhì)粒家族pC194同源復(fù)制子，該復(fù)制子由單鏈起點(diǎn)、rep和雙鏈起點(diǎn)組成[19]，是家族1質(zhì)粒共有序列，因此可以作為該家族質(zhì)粒分類的遺傳標(biāo)記。進(jìn)一步序列分析顯示，質(zhì)粒pSD11和pLB925A02均編碼一個高度同源的轉(zhuǎn)移蛋白，這使質(zhì)粒在一定條件下可以發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，而質(zhì)粒pL747-7沒有編碼任何功能基因，因此家族1質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步劃分為2 個亞家族類群。

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族2只含有1 個成員，它與RCR質(zhì)粒家族pMV158具有同源的復(fù)制子序列，該復(fù)制子由拷貝數(shù)調(diào)控基因、單鏈起點(diǎn)、rep和雙鏈起點(diǎn)組成[20]，是它們的共有序列，同樣可以作為該家族質(zhì)粒分類的遺傳標(biāo)記。

圖2 短乳桿菌質(zhì)?；蚪M共線性Fig. 2 Plasmid genome colinearity in Lactobacillus brevis

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族3含有4 個成員，均未編碼Rep，含有大于4 kb共有序列，共有序列注釋了2 個共有基因，分別編碼推定蛋白和移動蛋白。這些分析結(jié)果表明，家族3質(zhì)粒均為可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，很可能屬于完全依賴宿主酶系進(jìn)行theta復(fù)制的質(zhì)粒，如著名的ColE1家族質(zhì)粒[21-23]。

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族4含有12 個成員，均含有theta復(fù)制質(zhì)粒pUCL287[24-25]同源的Rep（屬于Rep_3家族），需要說明的是，質(zhì)粒pl12113-4 Rep注釋為假基因，經(jīng)序列比對，該基因提前出現(xiàn)終止密碼子，因此編碼的Rep不完整（290 aa）。家族4質(zhì)?；蚪M整體共線性較差，除了Rep編碼序列，12 個質(zhì)粒沒有發(fā)現(xiàn)共有序列，因此Rep編碼序列可以作為家族4質(zhì)粒分類的遺傳標(biāo)記。由參考質(zhì)粒pUCL287可知，rep基因上游重復(fù)序列（即復(fù)制起點(diǎn)）具有該家族復(fù)制子典型特征[26]，因此對所有14 個Rep_3家族Rep編碼序列進(jìn)行了比對分析，分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，家族4質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)可以分為2 種類型，其中11 個質(zhì)粒與pUCL287具有相同或相近的復(fù)制起點(diǎn)（4×11 bp＋4.5×22 bp）（圖3A），而家族4質(zhì)粒pl12108-8和復(fù)合質(zhì)粒pl12111-4具有另外一種類型的復(fù)制起點(diǎn)（3.5×21 bp）（圖3B），這一分析結(jié)果與Rep進(jìn)化樹（圖1）對該家族質(zhì)粒的分類結(jié)果一致，這進(jìn)一步證明家族4質(zhì)?？梢詣澐譃? 個亞家族類型。

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族5含有23 個成員，包括15 個編碼Rep（屬于RepA_N家族[27-28]）質(zhì)粒和8 個非編碼Rep質(zhì)粒。根據(jù)基因組共線性和序列比對，家族5質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步分為3 個亞家族。亞家族1含有18 個質(zhì)粒，其中3 個質(zhì)粒沒有發(fā)現(xiàn)Rep，大多數(shù)質(zhì)粒編碼了接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，因此推測這些質(zhì)粒起源于一個接合質(zhì)粒。亞家族2含有3 個質(zhì)粒，均為非編碼Rep質(zhì)粒，它們共有一個約20 kb噬菌體相關(guān)基因編碼區(qū)域，因此推測它們可能起源于一個編碼噬菌體質(zhì)粒。亞家族3含有2 個同源性很高的質(zhì)粒，它們沒有編碼Rep，與家族5其他質(zhì)粒具有少量的同源性區(qū)域，但都編碼的是一些未知蛋白。

由圖2可知，短乳桿菌質(zhì)粒家族6含有8 個成員，均含有theta復(fù)制質(zhì)粒pIP501同源的Rep（屬于RepR家族[29]），多數(shù)為大型質(zhì)粒。根據(jù)基因組共線性差異，8 個質(zhì)?？梢悦黠@劃分為2 個亞家族。此外，由基因組共線性可知，雖然家族6質(zhì)粒普遍較大，編碼了眾多功能基因，但與家族4、5質(zhì)粒相比，家族6質(zhì)粒基因組普遍顯示了良好共線性，這一結(jié)果表明，家族6質(zhì)粒之間可能具有親密的進(jìn)化關(guān)系，并且/或者它們可能較少發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)座重組等進(jìn)化事件。

圖3 短乳桿菌家族3質(zhì)粒rep基因上游重復(fù)序列Fig. 3 Repeat sequences of rep gene flank of Family 3 plasmids in Lactobacillus brevis

3 討 論

乳桿菌屬菌種數(shù)量和菌種多樣性是乳酸菌中最豐富的菌屬[30]，同時乳桿菌屬攜帶的天然質(zhì)粒數(shù)量和多樣性也是乳酸菌中最豐富的菌屬[31]，乳桿菌屬這兩種特性是一種巧合，還是存在某種聯(lián)系，目前還是未知的。為了探究質(zhì)粒多樣性與乳桿菌生理、遺傳等生物多樣性之間是否存在聯(lián)系，本課題組對乳桿菌屬中質(zhì)粒數(shù)量最多的植物乳桿菌進(jìn)行了質(zhì)粒進(jìn)化、分類和起源研究，建立了一種準(zhǔn)確、有效的分析方法，揭示了植物乳桿菌天然質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)化、分類和起源[13-14]。本研究以短乳桿菌（乳桿菌屬中質(zhì)粒多樣性僅次于植物乳桿菌）天然質(zhì)粒為研究對象，在以往質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹分類方法研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)?；蚪M共線性分析方法，建立了一種更加準(zhǔn)確、有效的短乳桿菌天然質(zhì)粒分類方法，清晰、準(zhǔn)確的揭示了短乳桿菌天然質(zhì)粒的分類關(guān)系，為今后短乳桿菌天然質(zhì)?？茖W(xué)分類和理性應(yīng)用奠定了理論研究基礎(chǔ)。

本研究經(jīng)多序列比對和重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌家族4質(zhì)粒復(fù)制子可以分為明顯不同的2 個亞家族類型（圖3），亞型1質(zhì)粒與參考質(zhì)粒pUCL287復(fù)制子的重復(fù)序列相似，均由兩組不同長度的串聯(lián)重復(fù)序列組成，該特征由Benachour等[26]1997年首次鑒定，而亞型2質(zhì)粒重復(fù)序列僅由一組串聯(lián)重復(fù)序列組成，這在以往有關(guān)乳桿菌質(zhì)粒的文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)報(bào)道，因此這個新的Rep_3家族復(fù)制子是否具有復(fù)制功能仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，亞型1質(zhì)粒復(fù)制子重復(fù)序列也并非完全一致，質(zhì)粒pL747-2、pLB925A03和pL747-6與其他質(zhì)粒重復(fù)序列也存在不同程度的差異性（圖3A）。這些分析結(jié)果表明，短乳桿菌家族4質(zhì)粒Rep及其結(jié)合位點(diǎn)（即重復(fù)序列）并非嚴(yán)格保守，顯示出較豐富的多樣性，因此短乳桿菌家族4質(zhì)粒的復(fù)制起始機(jī)制很可能因此存在一定的靈活性和魯棒性。

4 結(jié) 論

本研究通過質(zhì)粒Rep進(jìn)化樹分析，將短乳桿菌34 個編碼Rep質(zhì)粒劃分為5 個家族類型，之后通過質(zhì)粒基因組共線性分析，將短乳桿菌所有51 個質(zhì)粒劃分為6 個家族類型，以及更詳細(xì)的11 個亞家族類型，推測家族1、2質(zhì)粒屬于滾環(huán)型復(fù)制質(zhì)粒，家族3～6質(zhì)粒屬于theta型復(fù)制質(zhì)粒。基因組共線性質(zhì)粒分類方法克服了Rep進(jìn)化樹分類方法對質(zhì)粒編碼Rep的依賴和不足，Rep進(jìn)化樹和基因組共線性兩種分析方法對編碼Rep質(zhì)粒的分類結(jié)果一致，兩種方法互為補(bǔ)充和證明，因此本研究表明，Rep進(jìn)化樹和基因組共線性相結(jié)合的分析方法可以準(zhǔn)確、有效的分析和分類短乳桿菌天然質(zhì)粒，該方法是短乳桿菌天然質(zhì)粒系統(tǒng)分類的一種有效方法。

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