采收期谷物中真菌毒素產(chǎn)毒菌的篩選鑒定

裴世春，李 妍，高建偉，王 巖，王 琳，韓基東

（1.通化師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 通化 134002；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.普菲特益斯生物科技（北京）有限公司，北京 101111；4.嶺南大學(xué)生命應(yīng)用科學(xué)學(xué)院，韓國(guó) 大邱 38541）

真菌毒素是真菌在一定的條件下分泌的有毒二次代謝產(chǎn)物，主要是由Fusarium sp.、Penicillium sp.和Aspergillus sp.中的部分產(chǎn)毒真菌代謝所產(chǎn)生，其中常見(jiàn)的真菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素、伏馬毒素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（fumonisin B2，F(xiàn)B2）、橘青霉素、展青霉素（patulin，Pat）、黃曲霉毒素B1（afulatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）等10余種[1-3]。

從國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果可知[2-3]，各種糧食作物、水果蔬菜和加工食品中均有不同程度的真菌及真菌毒素的污染，其中糧食作物中真菌毒素的污染普遍較為嚴(yán)重，因此世界多數(shù)國(guó)家和地區(qū)均制定了嚴(yán)格的真菌毒素法定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)也在最新實(shí)施的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中對(duì)ZON、DON、Pat、AFB1、AFM1和OTA等真菌毒素在不同農(nóng)產(chǎn)品及其加工制品中的殘留限量進(jìn)行了設(shè)定[4]，該標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)不僅保障了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品及其加工制品的安全性，同時(shí)也為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中真菌和真菌毒素污染相關(guān)的基礎(chǔ)性調(diào)查研究提供了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

東北地區(qū)是我國(guó)主要的商品糧生產(chǎn)基地，該地區(qū)生產(chǎn)的商品糧安全性關(guān)系到全國(guó)消費(fèi)者的飲食安全，特別是東北地區(qū)采收期間谷物是否污染有產(chǎn)毒性真菌，對(duì)后期商品糧的儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和加工中的安全性具有決定性的影響，因此有必要對(duì)東北地區(qū)采收期間谷物中的產(chǎn)毒性真菌開展調(diào)查研究。

本實(shí)驗(yàn)將利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為分析工具，通過(guò)篩選和鑒定東北地區(qū)采收期間小麥、玉米和水稻中的產(chǎn)毒性真菌，分析東北地區(qū)采收期糧食中潛在的真菌毒素安全風(fēng)險(xiǎn)，以期為相關(guān)部門針對(duì)性的制定真菌危害防控措施和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥、玉米和水稻東北糧食種植區(qū)采收期間田間采集；ZON、AFB1、FB、DON 美國(guó)Sigma公司；真菌毒素檢測(cè)ELISA試劑盒 普菲特益斯生物科技（北京）有限公司；DNA提取試劑盒 杭州博日科技有限公司；DNA Marker、正反引物、蛋白酶K、Agarose M、1×TE等 生工生物工程（上海）股份有限公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶 寶生物工程（大連）有限公司；PDA培養(yǎng)基 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2720 Theraml Cycler PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；UPLC-MS/MS聯(lián)用儀（LC-30A色譜與LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（配置LC-30AD×2輸液泵、DGU-20A5在線脫氣、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-30A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、LabSolutions Ver. 5.50色譜工作站）） 日本島津公司；VICTOR X4多功能酶標(biāo)儀、Wahser 400 96 孔洗板機(jī) 美國(guó)GE公司；超濾杯、超純水系統(tǒng) 美國(guó)密理博公司；WP25AB臺(tái)式電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WD-9413A凝膠成像分析儀、DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鐮刀菌分離

樣品根據(jù)GB 4789.1—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》[5]中樣品的采集規(guī)則進(jìn)行采樣。于2016年10月采集東北三省糧食種植區(qū)的小麥、玉米和水稻樣品共300 份。每份小麥、水稻和玉米樣品中隨機(jī)選取50～100 粒，分別放入50 mL的離心管內(nèi)，加入20～30 mL的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液表面消毒1 min后將離心管內(nèi)的乙醇倒掉，無(wú)菌水重復(fù)清洗4 次，將清洗消毒好的樣品，放置于無(wú)菌濾紙上干燥，干燥好的樣品放到滅菌，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，挑選長(zhǎng)出的菌絲無(wú)菌接種到新的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃的恒溫培養(yǎng)，經(jīng)多次反復(fù)分離，直至菌絲純化后4 ℃保存待用。

1.3.2 基于ELISA的產(chǎn)毒菌初篩

將純化菌絲無(wú)菌接種到10 mL滅菌PSC（peptone sucrose Czapek）培養(yǎng)基（蔗糖30 g、硝酸鉀0.75g、酵母浸出膏0.5 g、蛋白胨10 g、硝酸鈉3.0 g、硫酸鎂0.25 g、磷酸氫二鉀0.5 g、氯化鉀0.25 g、硫酸鐵0.012 5 g、500 mL蒸餾水）中，120 r/min，25 ℃的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)14 d后進(jìn)行高溫滅菌，滅菌培養(yǎng)基利用Whatman No. 1濾紙過(guò)濾后，濾液離心取上清液，稀釋后利用ELISA試劑盒篩選陽(yáng)性樣品。

1.3.3 基于LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀的產(chǎn)毒性能定性分析

經(jīng)ELISA初篩陽(yáng)性的PSC培養(yǎng)基用正己烷和石油醚進(jìn)行脫脂，脫脂菌液用苯（1∶1，V/V）為萃取劑萃取3 次，合并萃取液旋蒸至干后用甲醇定容，UPLC-MS/MS儀進(jìn)行定性檢測(cè)。

色譜柱：Shim-pack XR-ODS III（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：A為0.02%乙酸和2 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積3 μL；柱溫40 ℃；梯度洗脫 0～1 min 20% B，1～11 min 35% B，11～13 min 50% B，13～14 min 50% B，14～18 min 95% B，18～20 min 95% B，20～21 min 10% B，21～21.1 min 20% B。

離子源：電噴霧電離，正負(fù)離子掃描；干燥氣：氮?dú)?，流?5 L/min；離子源接口電壓：4.5～3.5 kV；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：450 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；駐留時(shí)間：10 ms。

1.3.4 基于PCR的產(chǎn)毒菌鑒定

基于PCR的產(chǎn)毒菌鑒定參照White[6]和Pei[7]等方法調(diào)整后進(jìn)行，具體是將產(chǎn)毒菌提取DNA后，采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系為25 μL，所需試劑及用量如表1所示。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性40 s，各組引物53 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物：用1.0×TAE電泳緩沖液制備1.0%的瓊脂糖凝膠，將8 μL PCR產(chǎn)物加入到對(duì)應(yīng)的凝膠孔中，另在一孔加入適量的DNA分子質(zhì)量標(biāo)記物，電泳后凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物片段。

PCR產(chǎn)物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中使用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)。

表1 PCR所需試劑及用量Table 1 Volumes of reagents used for PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ELISA的產(chǎn)毒陽(yáng)性菌初篩

通常真菌毒素的定性定量測(cè)定方法有薄層色譜、HPLC、氣相色譜以及UPLC-MS/MS聯(lián)用等方法[8-11]，雖然色譜的方法具有精確可靠的優(yōu)勢(shì)，但是色譜方法通常需要進(jìn)行真菌毒素的有機(jī)溶劑提取、濃縮、過(guò)柱和純化等處理過(guò)程，對(duì)大量分離菌的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要耗費(fèi)大量的樣品前處理時(shí)間和前處理費(fèi)用，而基于抗原抗體特異性反應(yīng)的ELISA的方法篩選產(chǎn)毒性陽(yáng)性菌的過(guò)程中可以省略繁瑣的前處理過(guò)程，直接將培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行高通量檢測(cè)[12-17]。

因此，本實(shí)驗(yàn)是采用ELISA試劑盒對(duì)采集的300 份谷物樣品中分離出的菌進(jìn)行了產(chǎn)毒性檢測(cè)，其結(jié)果如圖1所示，基于ELISA共初篩出73 株產(chǎn)毒陽(yáng)性真菌，其中以產(chǎn)DON為主的陽(yáng)性菌株有51株，產(chǎn)毒性在1.4～190.0 ng/mL之間，產(chǎn)ZON為主的菌株16 株，產(chǎn)毒性在4.9～161.3 ng/mL之間，產(chǎn)FB為主的陽(yáng)性菌株6 株，產(chǎn)毒性在5.0～97.4 ng/mL之間，AFB1產(chǎn)毒菌沒(méi)有篩選到。

圖1 真菌毒素產(chǎn)毒性陽(yáng)性真菌的ELISA初篩Fig. 1 Screening of positive mycotoxin-producing strains by ELISA

李妍等[18]對(duì)糧食樣品中ZON的ELISA檢測(cè)方法和UPLC法比較研究結(jié)果表明，ELISA檢測(cè)為陰性的樣品利用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)100%為陰性，而ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品中經(jīng)UPLC-MS/MS法鑒定也有近60%的假陽(yáng)性；余容等[19]對(duì)比國(guó)內(nèi)外DON檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)也顯示ELISA的檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)普遍高于HPLC的檢測(cè)結(jié)果；劉師文等[20]對(duì)FB1的ELISA和HPLC檢測(cè)方法對(duì)比結(jié)果表明，二者雖然具有良好的相關(guān)性，但是針對(duì)同一個(gè)陽(yáng)性樣品，ELISA的檢測(cè)數(shù)據(jù)普遍高于HPLC的檢測(cè)數(shù)據(jù)。分析以上研究結(jié)果可知ELISA檢測(cè)方法假陽(yáng)性率較高，但是基于這一點(diǎn)，可以利用ELISA檢測(cè)結(jié)果排除陰性樣品方面卻具有良好的可行性，因此，本實(shí)驗(yàn)中分離菌的液體培養(yǎng)樣品中利用ELISA檢測(cè)為產(chǎn)毒性陰性的分離菌均判斷為不產(chǎn)真菌毒素的菌株，實(shí)驗(yàn)中免去了后續(xù)進(jìn)一步鑒定和分析的步驟，加快了產(chǎn)毒菌的篩選效率，對(duì)ELISA篩選出的陽(yáng)性樣品則通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行了進(jìn)一步的陽(yáng)性驗(yàn)證。

2.2 基于LC MS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀的陽(yáng)性分離菌的驗(yàn)證

為了應(yīng)用LC MS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)一步驗(yàn)證ELSIA初篩陽(yáng)性菌的產(chǎn)毒性，首先對(duì)DON、ZON、FB和AFB1等真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了定性測(cè)定，其結(jié)果如圖2所示。DON出峰時(shí)間為2.152 min，AFB1出峰時(shí)間為13.955 min，F(xiàn)B1出峰時(shí)間為16.343 min，F(xiàn)B2出峰時(shí)間為17.351 min，ZON出峰時(shí)間為17.272 min，分離效果良好，可以同時(shí)精確定性分析5 種真菌毒素。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)毒素MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of standard toxins

表2 LC MS-8040三重四極桿質(zhì)譜驗(yàn)證分離菌的產(chǎn)毒性Table 2 Identification of mycotoxin-producing strains by LC-MS/MS

利用LC MS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀對(duì)ELISA篩選出的73 株產(chǎn)毒性陽(yáng)性菌進(jìn)行驗(yàn)證分析結(jié)果如表2所示，共驗(yàn)證出6 株分離菌產(chǎn)DON毒素，其中有4 株分離菌產(chǎn)DON的同時(shí)也產(chǎn)ZON毒素，有一株分離菌產(chǎn)FB毒素。

本實(shí)驗(yàn)篩選經(jīng)LCMS-8040-三重四極桿質(zhì)譜儀驗(yàn)證的陽(yáng)性菌株顯著小于ELISA分離的陽(yáng)性菌株，這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了ELISA檢測(cè)結(jié)果雖然靈敏度高，但是在痕量真菌毒素檢測(cè)中極易產(chǎn)生假陽(yáng)性，另外，由于本實(shí)驗(yàn)是從幾百份谷物樣品中分離真菌，分離菌的數(shù)量龐大，無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法制備富集高濃度的樣品后進(jìn)行產(chǎn)毒性UPLC-MS/MS分析，因此利用試管小量液體培養(yǎng)分離菌后經(jīng)提取進(jìn)行的質(zhì)譜分析有可能因液體培養(yǎng)過(guò)程中受到基質(zhì)等因素影響[21]以及分泌的毒素含量過(guò)低而未能檢測(cè)出分泌微量真菌毒素的產(chǎn)毒菌。即便如此，也能聯(lián)合運(yùn)用ELISA和LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜方法能夠從大量分離菌中快速篩查到產(chǎn)毒性真菌，因此，該方法適用于高產(chǎn)毒性真菌的分離篩選，該方法體系對(duì)快速判斷采收期谷物中是否污染有產(chǎn)毒性真菌，進(jìn)而對(duì)采收的谷物運(yùn)輸、儲(chǔ)藏和加工之前采取安全相關(guān)措施具有良好的實(shí)用價(jià)值。

2.3 基于PCR的產(chǎn)毒菌鑒定

PCR技術(shù)可以在真菌的鑒定過(guò)程中減少鑒定難度，是具有良好應(yīng)用前景的技術(shù)方法，眾多研究者[22-25]都對(duì)基于PCR技術(shù)的產(chǎn)毒性菌株的鑒定給予了良好的評(píng)價(jià)。

圖3 利用ITs1和ITs4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鐮刀菌的電泳圖Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified roducts from Fusarium using ITs1 and ITs4 primers

本實(shí)驗(yàn)利用通用引物ITS1、ITS4擴(kuò)增了菌的基因組DNA，其擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶如圖3所示，DNA片段大小為520 bp左右，并且擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且清晰可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后利用BLAST進(jìn)行了基因序列比對(duì)，結(jié)果如圖4、表3所示，所測(cè)定的菌與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中相應(yīng)菌株的相似度均超過(guò)99%，進(jìn)而可以判斷本實(shí)驗(yàn)的分離菌分別為F. asiaticum、F. graminearum、F. poae和F. fujikuroi。

圖4 F. poae（a）、F. asiaticum（b）、F. graminearum（c）和F. fujikuroi（d）測(cè)序結(jié)果比對(duì)Fig. 4 Comparison of sequencing results among F. poae (a),F. asiaticum (b), F. graminearum (c) and F. fujikuroi (d)

表3 所測(cè)菌株基因序列與基因庫(kù)中現(xiàn)有序列比對(duì)結(jié)果Table 3 Comparison of the sequences of the tested strains with GenBank sequences

綜合表2、3可知，本實(shí)驗(yàn)采集的東北地區(qū)采收期糧食中產(chǎn)DON和ZON的產(chǎn)毒菌種類經(jīng)鑒定為F. asiaticum、F. graminearum、F. poae和F. fujikuroi等鐮刀菌屬菌株，其中分離的F. asiaticum和F. graminearum與史文琦等[26]的分析結(jié)果類似，均具有DON的產(chǎn)毒性能，說(shuō)明我國(guó)DON產(chǎn)毒菌主要包括了F. asiaticum和F. graminearum。本實(shí)驗(yàn)分離的F. poae具有同時(shí)產(chǎn)DON和ZON的性能，而張楓等[27]分離的F. poae為產(chǎn)T-2毒素的產(chǎn)毒菌，由于本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行T-2毒素的檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)中分離的F. poae是否同時(shí)具有T-2毒素產(chǎn)毒性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證?？紤]到王晉等[28]也在小麥中分離出F. poae菌株，雖然沒(méi)有進(jìn)行產(chǎn)毒菌的測(cè)定，但是可以推測(cè)F. poae菌株也是我國(guó)糧食中常污染的鐮刀菌之一。研究[29-30]表明，F(xiàn). fujikuroi是產(chǎn)FB毒素的主要產(chǎn)毒菌之一，本實(shí)驗(yàn)調(diào)查中分離的C-130507-3-3菌株經(jīng)與NCBI中相應(yīng)菌株比對(duì)結(jié)果與F. fujikuroi真菌相同，同時(shí)經(jīng)UPLC-MS/MS方法鑒定，該菌具有FB毒素的產(chǎn)毒性，由此可知，我國(guó)東北采收期糧食中污染有產(chǎn)FB毒素的產(chǎn)毒菌。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用ELISA的快速篩選和UPLC-MS/MS的精密鑒定的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合PCR技術(shù)，通過(guò)基因比對(duì)發(fā)現(xiàn)我國(guó)東北地區(qū)糧食主產(chǎn)區(qū)采收期的小麥、玉米和水稻中存在一定的產(chǎn)DON、ZON和FB毒素的產(chǎn)毒性真菌污染，并成功分離鑒定了6 個(gè)產(chǎn)毒菌，由此可知，東北地區(qū)糧食主產(chǎn)區(qū)糧食具有潛在的真菌毒素污染的可能性，如果采收后的糧食在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和加工過(guò)程中管理不善，將會(huì)危害糧食的安全性，因此，后期有必要持續(xù)跟蹤開展采收后的糧食在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和加工過(guò)程中真菌的生長(zhǎng)情況和真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，同時(shí)也需要制定針對(duì)性的安全控制措施。

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