頭孢他啶/阿維巴坦、多黏菌素B和替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌活性分析

陳怡麗 劉平娟 余廣超 伍眾文 郭鵬豪 彭雅琴 李雨芯 劉敏 廖康

摘要：目的 評價(jià)頭孢他啶/阿維巴坦（CAZ-AVI）、多黏菌素B和替加環(huán)素對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）的體外抗菌效應(yīng)研究，指導(dǎo)臨床正確選擇并合理使用抗菌藥物。方法 收集2018—2021年期間從廣東地區(qū)8家三級綜合醫(yī)院臨床分離的對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌172株，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）以及NG-Test?CARBA5檢測菌株的5種常見碳青霉烯酶耐藥基因；采用微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)分別檢測CAZ-AVI、多黏菌素B和替加環(huán)素的單藥最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）值。結(jié)果 172株CRKP對CAZ-AVI耐藥率為13.4%，對多黏菌素B的耐藥率為1.7%，對替加環(huán)素耐藥率為1.2％。PCR檢測172株CRKP菌株產(chǎn)碳青霉烯酶基因，其中產(chǎn)碳青霉烯酶菌株166株（96.5%）。以PCR檢測產(chǎn)碳青霉烯酶基因?yàn)閰⒖挤椒ǎ琋G-Test? CARBA5檢測碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like，顯示特異性為100%，靈敏度為99.4%。結(jié)論 CAZ-AVI、多黏菌素B以及替加環(huán)素對本地區(qū)CRKP菌株具有較好的體外抗菌活性，對采用NG-Test? CARBA5試驗(yàn)檢測CRKP產(chǎn)碳青霉烯酶的耐藥基因型，有利于早期指導(dǎo)臨床實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

關(guān)鍵詞：耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌；頭孢他啶/阿維巴坦；多黏菌素B；替加環(huán)素；微量肉湯稀釋法

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

In vitro antibacterial activity of ceftazidime/avibatan， polymyxin B and tigecycline against carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae

Chen Yili1， Liu Pingjuan1， Yu Guangchao2， Wu Zhongwen1， Guo Penghao1， Peng Yaqin1， Li Yuxin3，

Liu Min1， and Liao Kang1

（1 Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510080;

2 Department of Laboratory Medicine， the First Affiliated Hospital of Jinan University （Guangzhou Overseas Chinese Hospital）， Guangzhou 510080；3 Guangdong Medical University， Dongguan 523000）

Abstract Objective To evaluate the in vitro antibacterial effect of ceftazidime/averbactam （CAZ-AVI）， polymyxin B and tegacyclin on carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae， and to guide the clinical correct selection and rational use of antibacterial drugs. Methods 172 strains CRKP were collected from 8 tertiary general hospitals in Guangdong Province from 2018 to 2021. Polymerase chain reaction （PCR） and NG-Test? CARBA5 were used for the detection of the five common carbapenemase resistance genes. The minimal inhibitory concentration （MIC） values of CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline were detected by broth microdilution method. Results The resistance rates of 172 CRKP strains to CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline were 13.4%， 1.7% and 1.2%， respectively. 166 strains （96.5%） among the 172 CRKP strains carried carbapenemase resistance genes by PCR detection which was used as the standard method. NG-Test? CARBA5 were used to detect carbapenem genotypes KPC， NDM， VIM， IMP and oxa-48-like. The specificity was 100% and the sensitivity was 99.4%. Conclusion CAZ-AVI， polymyxin B and tigecycline had good in vitro antibacterial activity against CRKP strains in local region. NG-Test? CARBA5 test is a rapid and accurate method to detect carbapenemase genotypes， which is conducive for early guiding clinical practice and realizing individualized and accurate treatment.

Key words Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae; Ceftazidime/avibatan; Polymyxin B; Tigecycline；Broth microdilution

近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，給臨床治療帶來巨大的困難與挑戰(zhàn)。根據(jù)2021年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥率高達(dá)20.8%，對美羅培南耐藥率達(dá)21.9%。其中，對CRKP體外抗菌活性較好的藥物包括多黏菌素B（耐藥率3.8%），替加環(huán)素（耐藥率3.9%），以及頭孢他啶/阿維巴坦（耐藥率7.4%）[1]。眾所周知，快速準(zhǔn)確的藥物敏感性結(jié)果在臨床精準(zhǔn)合理用藥中發(fā)揮重要作用，然而，現(xiàn)階段臨床實(shí)驗(yàn)室對頭孢他啶/阿維巴坦、黏菌素和替加環(huán)素的常規(guī)體外藥敏試驗(yàn)存在方法上的局限。CAZ-AVI上市不久，目前國內(nèi)沒有任何商品化的檢測試劑可檢測MIC。對于腸桿菌目，紙片擴(kuò)散法會出現(xiàn)假敏感和假耐藥現(xiàn)象[2]。多黏菌素類分子量大，在瓊脂內(nèi)不易擴(kuò)散，2017年CLSI不再推薦錯(cuò)誤率高的紙片擴(kuò)散法、瓊脂擴(kuò)散法和濃度梯度擴(kuò)散法（包括E試驗(yàn)）[3-4]。而替加環(huán)素理化性質(zhì)不穩(wěn)定，不宜在光線或空氣中久置。Vitek 2系統(tǒng)檢測的替加環(huán)素藥敏結(jié)果在驗(yàn)證階段缺少足夠的耐藥菌株，且整體MIC偏高，假耐藥菌株多[5-6]。因此，本研究擬通過微量肉湯稀釋法（broth microdilution，BMD），評價(jià)本地區(qū)臨床分離的CRKP菌株對頭孢他啶/阿維巴坦、多黏菌素B和替加環(huán)素的體外抗菌活性，觀察這3種抗菌藥物對攜帶不同碳青霉烯酶耐藥基因型的CRKP菌株的特征，為臨床精準(zhǔn)合理用藥提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院、中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院、暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院、佛山市第一人民醫(yī)院以及深圳市人民醫(yī)院，共8家本地區(qū)的三級綜合醫(yī)院，自2018—2021年臨床分離的CRKP共172株。CRKP菌株入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)Vitek-2全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀，鑒定為肺炎克雷伯菌的菌株，藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照CLSI 2021 M100標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，厄他培南最低抑菌濃度（MIC）為≥2 μg/mL。剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.1.2 主要儀器與試劑

哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖公司）、Applied biosystems熒光定量擴(kuò)增儀（賽默飛公司）、GeneGreen核酸染料和2×Taq PCR Mix（北京天根生化科技有限公司）、Trans2k DNA Marker（北京全式金生物）、碳青霉烯酶基因PCR引物（上海生工生物）、NG-Test? CARBA5檢測試劑盒（批號： 20120211）（復(fù)星診斷科技（長沙）有限公司）、多黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品（批號130313-201310，效價(jià)7791 UNITs/mg）。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)方法

微量肉湯稀釋法參考2018年CLSI M07-A11（需氧菌的抗菌藥物稀釋法敏感性試驗(yàn)）推薦的方法進(jìn)行。

1.2.2 折點(diǎn)判斷

①頭孢他啶/阿維巴坦：按CLSI M100（2021年版）[7]的推薦：敏感≤8/4 mg/L，耐藥≥16/4 mg/L。②多黏菌素B（PB）：按歐洲抗微生物藥物敏感性委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）10.0版[8]多黏菌素B的折點(diǎn)，即敏感≤2 mg/L，耐藥≥4 mg/L。③替加環(huán)素（TGC）：判定折點(diǎn)按照美國FDA和中國國家藥品監(jiān)督管理局關(guān)于腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)，即敏感≤2 mg/L，中介＝4 mg/ L，耐藥≥8 mg/L。

1.2.3 PCR技術(shù)檢測碳青霉烯酶基因

將保存的臨床菌株轉(zhuǎn)種到室溫的血瓊脂平板，放置37 ℃、5%CO2細(xì)菌孵育箱過夜培養(yǎng)。采用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，采用10 μL的一次性接種環(huán)挑取2～3個(gè)單菌落細(xì)菌，置于100 μL無菌去核酸酶水中制成菌懸液，于100 ℃干式恒溫器中裂解10 min，冰浴10 min，離心12000 r/min，10 min，將含DNA的上清液轉(zhuǎn)到新EP管中，用于PCR檢測。本次實(shí)驗(yàn)共檢測5個(gè)臨床常見的碳青霉烯酶基因，基因名稱及對應(yīng)引物序列參考文獻(xiàn)[9]，引物由上海生工公司合成，引物設(shè)計(jì)如下（表1），循環(huán)體系：預(yù)變性94 ℃，5 min、變性94 ℃，30 s、退火58 ℃，30 s、延伸72 ℃，60 s（變性、退火、延伸共25循環(huán)）、最后延伸72 ℃，10 min。得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行電泳。

1.2.4 NG-Test? CARBA5檢測碳青霉烯酶基因型

按照NG-Test? CARBA5檢測試劑盒（復(fù)星診斷科技（長沙）有限公司批號：20120211）說明書操作：在EP管中滴加150 ?L的提取緩沖液，挑取經(jīng)純化過夜培養(yǎng)的新鮮菌落至EP管緩沖液中，在漩渦震蕩器上震蕩混勻數(shù)秒，靜置15 min待用。使用加樣槍吸取100 ?L制備好的液體加到檢測卡的樣本區(qū)，15 min后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CRKP菌株對3種抗菌藥物的耐藥性分析

微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，172株CRKP對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率為3.4%（MIC50 1 μg/mL，MIC90 256 μg/mL）；多黏菌素B的耐藥率為1.7%（MIC50 0.125 μg/mL，MIC90 0.5 μg/mL）；對替加環(huán)素的耐藥率為1.2%（MIC50 1 μg/mL，MIC90 4 μg/mL），

見表2。

2.2 3種藥物交叉耐藥性分析

本研究通過對172株CRKP菌株的3種藥物MIC值的兩兩對比，13株（7.6%）菌株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥而對多黏菌素B敏感（圖1）；12株（7.0%）菌株對頭孢他啶/阿維巴坦耐藥而對替加環(huán)素敏感（圖2）；3株（1.7%）菌株對多黏菌素B耐藥而對替加環(huán)素敏感（圖3）。

2.3 PCR方法檢測碳青霉烯酶耐藥基因結(jié)果

本研究通過PCR方法分析172株CRKP菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的結(jié)果，得到產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株有166株（96.5%），其中143株CAZ-AVI敏感菌株中143株（100%）產(chǎn)blaKPC，23株CAZ-AVI耐藥菌株中4株（17.4%）產(chǎn)blaKPC，12株（52.2%）產(chǎn)blaNDM，2株（8.7%）產(chǎn)blaIMP，4株（17.4%）產(chǎn)blaNDM+IMP雙酶，1株（4.3%）產(chǎn)blaKPC+NDM雙酶，見圖4。

163株多黏菌素B敏感菌株中146株（89.6%）產(chǎn)blaKPC，3株多黏菌素B耐藥菌株中1株產(chǎn)blaKPC，1株產(chǎn)blaNDM，1株產(chǎn)blaNDM+IMP雙酶。圖5。

138株替加環(huán)素敏感菌株中120株（87.0%）產(chǎn)blaKPC，11株（8.0%）產(chǎn)blaNDM；2株替加環(huán)素耐藥菌株均產(chǎn)blaKPC；26株替加環(huán)素中介菌株中25株產(chǎn)blaKPC，1株產(chǎn)blaNDM，圖6。

2.4 NG-Test? CARBA5檢測結(jié)果

NG-Test? CARBA5結(jié)果顯示：172株CRKP中有165株（95.9%）產(chǎn)碳青霉烯酶。其中KPC型146株（88.5%），NDM型12株（7.3%），IMP型2株（1.2%），同時(shí)產(chǎn)KPC和NDM型1株（0.6%），同時(shí)產(chǎn)NDM和IMP型4株（2.4%）。與PCR法檢測碳青霉烯酶基因型的一致性，見表3。NG-Test?CARBA5檢測碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like的結(jié)果特異性為100%，靈敏度為99.4%。

3 討論

頭孢他啶/阿維巴坦、多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）以及替加環(huán)素被認(rèn)為是目前治療耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌所致感染最有效的藥物[10]，快速準(zhǔn)確的藥物敏感性結(jié)果在臨床精準(zhǔn)合理用藥中發(fā)揮重要作用。然而，由于國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室藥敏方法的可及性問題，目前對于這3種抗生素體外藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果需要謹(jǐn)慎評價(jià)，BMD是多黏菌素類和替加環(huán)素藥敏檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，微量肉湯稀釋法是評價(jià)頭孢他啶/阿維巴坦體外藥敏活性的金標(biāo)準(zhǔn)，有條件的實(shí)驗(yàn)室推薦使用微量肉湯稀釋法評價(jià)這3種藥物體外藥敏活性[11]。

目前針對本地區(qū)臨床收集的CRKP菌株對于CAZ-AVI、多黏菌素B和替加環(huán)素這3種藥物的體外藥敏數(shù)據(jù)鮮有報(bào)道，本研究采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行多中心評價(jià)，填補(bǔ)了本地區(qū)的數(shù)據(jù)空白。本研究結(jié)果顯示，172株CRKP菌株對CAZ-AVI、多黏菌素Ｂ和替加環(huán)素的耐藥率分別為13.4%、1.7%和1.2%。

CAZ-AVI是頭孢他啶和阿維巴坦組成的新型酶抑制劑合劑，阿維巴坦作為新型β-內(nèi)酰胺抑制劑，通過共價(jià)（緩慢可逆）結(jié)合，使自身結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，因此抑酶作用更長效[12]，可有效抑制A類、C類和部分D類酶。有一項(xiàng)研究表明頭孢他啶/阿維巴坦對耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌顯示出了良好的抗菌活性，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌感染患者給予頭孢他啶/阿維巴坦治療，治愈率達(dá)到了95％[13]；但對產(chǎn)B類金屬酶菌株無效，因?yàn)榘⒕S巴坦的抑酶譜缺乏絲氨酸殘基活性位點(diǎn)[14]。因此，早期快速的對CRKP進(jìn)行酶型檢測，有利于臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素時(shí)，選用CAZ-AVI治療B類金屬酶以外的CRKP引起的感染，有效提高患者治療的成功率。本研究結(jié)果顯示，172株CRKP菌株中超過95%產(chǎn)碳青霉烯酶，其中CAZ-AVI敏感株均產(chǎn)A類酶KPC型。值得關(guān)注的是，本地區(qū)13.4%的CRKP菌株對CAZ-AVI耐藥，高于浙江省的耐藥率[14]。在這些CAZ-AVI耐藥株中，超過80%攜帶B類金屬酶基因，約17%攜帶blaKPC，低于浙江省報(bào)道的約40%的KPC型[15]。研究發(fā)現(xiàn)，對CAZ-AVI耐藥的KPC型CRKP主要由于KPC-2型的點(diǎn)突變和KPC高表達(dá)導(dǎo)致CAZ-AVI耐藥[15]。因此，密切監(jiān)測CRKP對CAZ-AVI的耐藥性變化，尋找早期快速的方法對KPC變異體進(jìn)行檢測或鑒別，將是抗菌藥物管理的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

多黏菌素類抗生素是殺菌劑，與細(xì)胞膜的脂多糖結(jié)合，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜[16]。在體外藥敏試驗(yàn)中，黏菌素和多黏菌素B是等效藥，前者可預(yù)測后者的結(jié)果，反之亦然。張鑫等[17]對多黏菌素B治療碳青霉烯類耐藥菌感染167例患者的臨床療效進(jìn)行了評價(jià)，發(fā)現(xiàn)多黏菌素B不僅療效好，且不良反應(yīng)發(fā)生率低；多黏菌素B總累積劑量、多黏菌素B治療時(shí)間、機(jī)械通氣、血管活性藥物和多部位感染是影響多黏菌素B臨床療效的相關(guān)因素。本研究結(jié)果顯示，多黏菌素B對產(chǎn)A類、B類碳青霉烯酶的CRKP均具有較好的體外活性，僅發(fā)現(xiàn)3株多黏菌素B耐藥菌，耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

替加環(huán)素（tigecycline）是新型甘氨酰環(huán)素類抗生素，屬于半合成四環(huán)素米諾環(huán)素的衍生物[18]。主要通過抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，達(dá)到抗菌作用，常用于多重耐藥革蘭陰性桿菌引起的感染[19]。梁等[20]的研究表明替加環(huán)素在CRKP引起的感染，對產(chǎn)KPC型CRKP有較好的抗菌活性。本研究結(jié)果與國內(nèi)報(bào)道一致[20]，替加環(huán)素對產(chǎn)A類、B類碳青霉烯酶的CRKP均具有較好的體外活性。

值得注意的是，體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示多黏菌素B和替加環(huán)素的耐藥率均低于頭孢他啶/阿維巴坦，具有更好的體外抗菌活性。但是，當(dāng)多黏菌素的體外藥物敏感性結(jié)果提示耐藥時(shí)，它的腎毒性、神經(jīng)毒性將大大提高[21]。而替加環(huán)素主要推薦用于3個(gè)適應(yīng)癥[22]，而臨床應(yīng)用大多數(shù)屬于超適應(yīng)癥使用，目前缺乏嚴(yán)格的臨床研究結(jié)果支持和證明其有效性及安全性[23-24]。因此，臨床在應(yīng)用多黏菌素和替加環(huán)素抗感染時(shí)有一定的限制。而頭孢他啶/維巴坦在臨床應(yīng)用中，患者對藥物的耐受性較好，出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)較低[25-26]，是臨床治療CRKP的首選。

本研究結(jié)果顯示，NG-Test?CARBA5檢測碳青霉烯酶基因型KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48-like的結(jié)果特異性為100%，靈敏度為99.4%，與Hopkins等[27]評估用于檢測KPC的NG-Test? CARBA5免疫層析法檢測的結(jié)果一致。在治療方面，CRKP抗感染藥物的選擇取決于特定的碳青霉烯酶[27]。對產(chǎn)KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株，首選頭孢他啶-阿維巴坦，菌株通常僅對替加環(huán)素、多黏菌素或頭孢他啶-阿維巴坦敏感[11，29-30]。如果產(chǎn)生NDM（或任何其他金屬酶），首選的抗生素是頭孢他啶-阿維巴坦加氨曲南，該類型碳青霉烯酶的活性不能被阿維巴坦抑制，產(chǎn)酶菌株通常僅對替加環(huán)素和多黏菌素敏感[11， 31-32]。因此，鑒于不同碳青霉烯酶的獨(dú)特特點(diǎn)，快速、可靠地區(qū)分這些碳青霉烯酶將為適當(dāng)?shù)闹委熖峁┯袃r(jià)值的信息。NG-Test? CARBA5作為一種高效、快速、方便的診斷方法，能夠精準(zhǔn)鑒定最常見的5種碳青霉烯酶，除了操作簡單外，它還能在15 min內(nèi)顯示了5種主要碳青霉烯酶的結(jié)果，有助于簡化碳青霉烯酶檢測的復(fù)雜常規(guī)工作流程，對CRE流行病學(xué)研究和醫(yī)院感染控制都具有重要意義。

本研究存在一些局限性：一方面，對于碳青霉烯酶型未進(jìn)一步測序明確具體的亞型，擬在下一步研究中對這些菌株的型別進(jìn)行確認(rèn)；另一方面，此3種抗菌藥物聯(lián)合用藥的效應(yīng)評估，將在進(jìn)一步研究中繼續(xù)深入。

綜上所述，頭孢他啶/阿維巴坦、多黏菌素B以及替加環(huán)素對本地區(qū)CRKP菌株具有較好的體外抗菌活性，切實(shí)做好細(xì)菌耐藥監(jiān)測工作，可為臨床合理使用抗生素提供重要科學(xué)依據(jù)。對采用NG-Test? CARBA5試劑檢測CRKP產(chǎn)碳青霉烯酶的基因型，有利于指導(dǎo)臨床實(shí)現(xiàn)早期、快速的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

致謝：暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心余廣超教授，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科梁家隱教授，廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科盧景輝教授，南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科孫恒彪教授，廣東省佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科吳奎海教授，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院吳勁松教授，以及中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科劉曉強(qiáng)教授為本研究提供實(shí)驗(yàn)菌株。

參 考 文 獻(xiàn)

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