乳酸左氧氟沙星中乳酸的鑒別和含量測(cè)定

陳 希，鄢雷娜，章 紅，陳偉康

（江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029）

目前，乳酸的測(cè)定方法主要有化學(xué)鑒別[1]、離子色譜法（IC法）、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC法）。乳酸左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)采用化學(xué)反應(yīng)方法鑒別乳酸（采用溴試液氧化乳酸產(chǎn)生乙醛，乙醛與亞硫酸鐵氰化鉀反應(yīng)形成暗綠色環(huán)判斷為陽(yáng)性反應(yīng)），該鑒別方法專(zhuān)屬性不強(qiáng)[1]，有必要建立專(zhuān)屬性更強(qiáng)的測(cè)定方法。IC法專(zhuān)屬性雖然較好，但樣品一般需要蒸餾或固相凈化小柱等凈化步驟以除去有機(jī)雜質(zhì)，前處理步驟多耗時(shí)多[2-4]。GC法更需要將乳酸衍生化處理成揮發(fā)性的化合物，衍生試劑毒性大且前處理過(guò)程復(fù)雜繁瑣[5-7]。HPLC法無(wú)需前處理即可測(cè)定乳酸，但由于乳酸極性較大，在普通C18色譜柱中保留時(shí)間極短，存在與其他有機(jī)酸較難區(qū)分的問(wèn)題[8-10]。本研究采用有機(jī)酸專(zhuān)用色譜柱（月旭UltimateOAA 4.6×300mm）實(shí)現(xiàn)了乳酸等8種有機(jī)酸的分離測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MS205DU型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

左氧氟沙星對(duì)照品（含量：97.3%批號(hào)：130455-201607中國(guó)食品藥品檢定研究院）；L-乳酸鋰對(duì)照品（L-乳酸含量89.1%批號(hào)：MKCK3402廠家：ALDRICH）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品

乳酸左氧氟沙星原料（生產(chǎn)企業(yè)1：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)：2190225-190901；生產(chǎn)企業(yè)2：上虞京新藥業(yè)有限公司，批號(hào)：DK24-1904 281-VI；生產(chǎn)企業(yè)3：江西大地制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：190105-2）。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相A 0.01mol·L-1KH2PO4（用H3PO4調(diào)節(jié)pH值至2.5）；

流動(dòng)相B 甲醇，梯度洗脫，梯度表詳見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution table

流速：1.0mL·min-1；色譜柱：月旭UltimateOAA（4.6×300mm）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

1.4 溶液配制

乳酸儲(chǔ)備溶液 稱(chēng)取L-乳酸鋰對(duì)照品0.5558g，置于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為乳酸儲(chǔ)備溶液（含乳酸約10mg·mL-1）。

系統(tǒng)適用性溶液 稱(chēng)取草酸、酒石酸、甲酸、抗壞血酸、HAc、檸檬酸和琥珀酸7種有機(jī)酸各適量，分別置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含7種有機(jī)酸各約10mg·mL-1的儲(chǔ)備溶液。分別取上述7種有機(jī)酸及乳酸儲(chǔ)備溶液各適量，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成含草酸、酒石酸、甲酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸分別約為50、1000、1000、50、1000、1000、1000和1000μg·mL-1的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

乳酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 分別移取乳酸儲(chǔ)備溶液適量，加水制成含乳酸約為50、100、250、500、750和1000μg·mL-1的溶液。

供試品溶液 稱(chēng)取乳酸左氧氟沙星原料約0.29g，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻（含乳酸約500μg·mL-1，左氧氟沙星約2mg·mL-1）。

左氧氟沙星溶液 稱(chēng)取左氧氟沙星對(duì)照品約20mg，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液，按照“1.3色譜條件”測(cè)定，結(jié)果各組分按草酸、酒石酸、甲酸、抗壞血酸、乳酸、HAc、檸檬酸和琥珀酸的順序依次出峰，各組分的分離度均大于1.5，抗壞血酸峰和乳酸峰之間分離度為3.5，乳酸峰和HAc峰之間分離度為1.8，色圖譜詳見(jiàn)圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig.1 System suitability chromatogram

2.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取水、左氧氟沙星溶液、乳酸溶液（含乳酸約500μg·mL-1）和供試品溶液，按照“1.3色譜條件”測(cè)定。乳酸保留時(shí)間約5.9min，左氧氟沙星保留時(shí)間約17min，且水、左氧氟沙星溶液在乳酸保留時(shí)間均無(wú)色譜峰，即不干擾乳酸測(cè)定，可以采用保留時(shí)間定性方法鑒別乳酸左氧氟沙星中的乳酸。專(zhuān)屬性圖譜詳見(jiàn)圖2。

圖2 專(zhuān)屬性色譜圖Fig.2 Specific chromatogram

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取乳酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別按“1.3色譜條件”測(cè)定。以乳酸峰面積為縱坐標(biāo)（y），以乳酸濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y＝492.490X－544.844，r2＝0.9999；表明乳酸濃度在50～1000μg·mL-1之間與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度 取乳酸溶液（含乳酸約500μg·mL-1），按“1.3色譜條件”測(cè)定6次。計(jì)算乳酸峰面積和保留時(shí)間的RSD，分別為0.07%和0.03%，表明本方法精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of precision

2.3.3 重復(fù)性 精密稱(chēng)取乳酸左氧氟沙星原料（生產(chǎn)企業(yè)：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠）約0.29g，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻（6份）。按“1.3色譜條件”測(cè)定。用回歸方程計(jì)算樣品中乳酸的含量，平均含量為17.3%，RSD為1.1%，乳酸保留時(shí)間RSD為0.02%，結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of repeatability

2.3.4 定量限與檢出限 取乳酸溶液（含乳酸約500μg·mL-1）適量，用水稀釋成濃度約為1.0μg·mL-1和0.3μg·mL-1的乳酸溶液。分別按“1.3色譜條件”測(cè)定，結(jié)果乳酸濃度為1.0和0.3μg·mL-1時(shí)，信噪比分別大于10和3。

本方法乳酸的定量限與檢出限可以定為1.0μg·mL-1和0.3μg·mL-1。

2.3.5 準(zhǔn)確度 精密稱(chēng)取乳酸左氧氟沙星原料（生產(chǎn)企業(yè)：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠）約0.14g，置于100mL量瓶中（9份），分別加濃度約為10mg·mL-1的乳酸儲(chǔ)備溶液1.5、2.5和3.5mL（每個(gè)濃度3份），再分別加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別按“1.3色譜條件”測(cè)定，計(jì)算回收樣中的乳酸濃度和回收率。

結(jié)果乳酸回收率為99.80%～101.55%，平均回收率為100.6%，回收率RSD為0.6%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 乳酸回收率結(jié)果Tab.4 Results table of lactic acid recovery rate

2.4 樣品測(cè)定

分別取3家生產(chǎn)企業(yè)的乳酸左氧氟沙星原料各約0.29g，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“1.3色譜條件”測(cè)定，用回歸方程計(jì)算6份樣品中乳酸的含量，3家企業(yè)原料乳酸含量均約為17%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.5 Determination results of sample

3 結(jié)論

本研究使用有機(jī)酸專(zhuān)用色譜柱采用HPLC法實(shí)現(xiàn)了乳酸等8種有機(jī)酸的分離鑒別，并采用乳酸鋰為對(duì)照品，準(zhǔn)確測(cè)定了乳酸左氧氟沙星中的乳酸的含量。本研究建立的HPLC測(cè)定乳酸的方法具有專(zhuān)屬性高、前處理方法簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、精密度好、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于乳酸左氧氟沙星原料中乳酸的鑒別和含量測(cè)定。