蟲癭籃狀菌和偽子座籃狀菌-籃狀菌屬紫籃狀菌組的兩個我國新記錄種

王 龍，阮永明，金世宇

(1.中國科學(xué)院 微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，北京100101；2.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004；3.北京市京西林場，北京 102300)

0 引言

藍(lán)狀菌屬(TalaromycesC.R. Benj.)物種是土壤植物殘體的主要分解者，有些種類分解能力非常強(qiáng)大，如嗜松藍(lán)狀菌(T.pinophilus(Hedgc.) Samson, N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert)和小疣藍(lán)狀菌(T.verruculosus(Peyronel) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert)分泌強(qiáng)大的纖維素酶從而有效分解木質(zhì)纖維素[1, 2]。還有些種類，如T.pinophilus和產(chǎn)紫藍(lán)狀菌(T.purpurogenusSamson，N. Yilmaz，Houbraken，Spierenb，Seifert，Peterson，Varga & Frisvad)分泌有機(jī)酸和磷酸酯酶，溶解無機(jī)磷酸鈣及磷酸酯從而促進(jìn)植物對磷元素的吸收[3, 4]。另外，沃特曼藍(lán)狀菌(T.wortmanni(Kl?cker) C.R. Benj.)在植物根際分泌揮發(fā)性有機(jī)物 (volatile organic compounds，VOCs) 從而促進(jìn)植物生長及增強(qiáng)對病原菌的抗性[5]。該屬的大多數(shù)物種通常產(chǎn)生紅色、粉色、黃色和橙色的菌絲體、滲出液和可溶性色素. 這些色素屬于聚酮類嗜氮酮次級代謝產(chǎn)物(polyketide azaphilone secondary metabolites)，如絲紅素(mitorubrins)和紅曲紅色素(Monascusred pigments)，有些色素有望開發(fā)為食品添加劑，如暗玫瑰藍(lán)狀菌(T.atroroseusN. Yilmaz, Frisvad，Houbraken & Samson)產(chǎn)生的色素[6]。藍(lán)狀菌許多物種及特性有待發(fā)現(xiàn)和開發(fā)利用，而物種調(diào)查、分離、鑒定和保藏是這些工作的重要基礎(chǔ)。

藍(lán)狀菌屬絕大多數(shù)種的無性階段產(chǎn)生對稱雙輪生帚狀枝和披針形瓶梗，若存在有性階段，則產(chǎn)生裸囊殼(gymnothecia)型子囊果，其內(nèi)不規(guī)則著生不定數(shù)目的子囊，每個子囊內(nèi)生有8個不規(guī)則分布的子囊孢子。子囊孢子通常呈橢球形，壁帶刺。Pitt[7]根據(jù)雙命名系統(tǒng)(dual naming system)將藍(lán)狀菌物種分別劃歸在藍(lán)狀菌屬和青霉屬的雙輪亞屬(PenicilliumLink subgenusBiverticillium)中。后來的分子種系發(fā)生學(xué)(phylogenetics，Gr. phyle=tribe，genesis=birth)顯示藍(lán)狀菌屬和青霉屬的雙輪亞屬的物種應(yīng)屬于同一個單系類群，從而支持取消雙重命名系統(tǒng)而采用“一個真菌一個名稱(one fungus，one name)”的命名系統(tǒng)[8-11]，最終確定Talaromyces作為這類物種的合法屬。2014年，Yilmaz et al.承認(rèn)了Talaromyces的88 個種，并將Talaromyces分成7個組(sections)，即藍(lán)狀菌組(sectionTalaromyces)、螺旋藍(lán)狀菌組(sectionHeliciYilmaz，F(xiàn)risvad & Samson)、紫藍(lán)狀菌組(sectionPurpureiStolk & Samson)、糙孢藍(lán)狀菌組(sectionTrachyspermiYaguchi & Udagawa)、桿孢藍(lán)狀菌組(sectionBacillisporiYimaz，F(xiàn)risvad & Samson)、近膨藍(lán)狀菌組(sectionSubinflatiYilmaz，F(xiàn)risvad & Samson)和島藍(lán)狀菌組(sectionIslandici(Pitt) Yilmaz，F(xiàn)risvad & Samson)，其中TalaromycessectionPurpurei只有10個種[12]。紫藍(lán)狀菌組的種類通常在培養(yǎng)較長時間后會產(chǎn)生菌絲束(synnemata或coremia)，具有該特征的物種曾經(jīng)被Pitt劃歸于雙輪亞屬產(chǎn)束組(sectionCoremigenum(Biourge) Pitt)的樹狀系(seriesDendriticaPitt)和杜克勞系(seriesDuclauxiiRaper & Thom)[7]。

紫藍(lán)狀菌組的物種屬于稀有種(rare species)，自從2014年以后，該組沒有新的物種報道. 我國2007年的《中國真菌志第35卷·青霉屬及其相關(guān)有性型屬》專著中該組無記錄種[13]，直到本文投稿時我國也尚未報道過該組的物種。藍(lán)狀菌物種鑒定工作比較困難，主要因?yàn)槠湮锓N間的顯微結(jié)構(gòu)特征差別較小，因此除了一些特征明顯的物種外，如繩狀籃狀菌(T.funiculosus(Thom) Samson)、馬爾尼菲藍(lán)狀菌(T.marneffei(Segretain，Capponi & Sureau) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert)，其準(zhǔn)確鑒定主要依據(jù)分子種系學(xué)方法。國際上雖然選定了rDNA ITS1-5.8S-ITS2(ITS)作為真菌的分子遺傳標(biāo)記碼(genetic barcode)，但 ITS 不能區(qū)分Talaromyces的近緣種，如艾米斯托克籃狀菌(T.amestolkiaeN. Yilmaz，Houbraken, Frisvad & Samson)和斯托爾籃狀菌(T.stolliiN. Yilmaz，Houbraken, Frisvad & Samson)。因此必須選擇蛋白質(zhì)基因作為候選遺傳標(biāo)記，如鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin gene)和β-微管蛋白基因(β-tubulin gene,BenA)，β-微管蛋白基因幾乎可以區(qū)分Talaromyces的各個物種[12]。在本研究中，我們依據(jù)形態(tài)學(xué)和基于BenA和ITS序列的分子種系學(xué)，鑒定出了TalaromycessectionPurpurei的2個物種, 即蟲癭藍(lán)狀菌T.cecidicola(Seifert，Hoekstra & Frisvad) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert和偽子座藍(lán)狀菌T.pseudostromaticus(Hodges，G.M. Warner & Rogerson) Samson，N. Yilmaz, Frisvad & Seifert，其中T.cecidicola菌株WH6-2=AS3.16006分離自河南衛(wèi)輝農(nóng)田土壤，T.pseudostromaticus菌株EJ2-12=AS3.16005分離自內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗土壤。

1 材料與方法

1.1 菌株分離

土壤樣品采自我國河南衛(wèi)輝和內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗，樣品約25 g置于無菌的塑料袋中封好。樣品分離采用改進(jìn)的Malloch[14]的倍比稀釋傾倒平皿法，即采用滅菌的 0.1% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，carboxymethyl cellulose sodium salt)或瓊脂水溶液(agar water solution)代替無菌水制作樣品懸濁液[15]，采用該分離方法分離效果很好，得到很多株藍(lán)狀菌。其中兩株菌，即WH6-2 和EJ2-12 經(jīng)鑒定屬于TalaromycessectionPurpurei并保存于中國普通微生物菌種保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏號分別為 AS3.16006和AS3.16005。

1.2 形態(tài)學(xué)研究

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為查氏酵母精瓊脂(CYA)25 ℃、37 ℃和5 ℃，麥芽精瓊脂(MEA)25 ℃，均培養(yǎng)7 d后觀察和描述[16]，菌落顏色的描述參照Ridgway的色譜[17]。顯微結(jié)構(gòu)挑取在MEA 25 ℃ 7 d時的產(chǎn)分生孢子結(jié)構(gòu)做光學(xué)顯微鏡載片觀察和描述。

表1 用于分子種系學(xué)分析的Talaromyces Sect. Purpurei的10種12株菌及外群T. helices CBS 335.48T

1.3 分子種系學(xué)研究

DNA的提取參考Wang and Zhuang[18]。擴(kuò)增BenA的引物為bt2a和bt2b[19]；擴(kuò)增ITS引物選擇ITS5和ITS4[20]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在無菌的0.2 mL薄壁平蓋Eppendorf管中進(jìn)行，20 μL反應(yīng)體系含有基因組DNA 1.0 μL，正向和反向引物(10 μM)各0.5 μL，雙蒸水8 μL，2×PCR擴(kuò)增緩沖液(0.05 u/μL Taq polymerase，4 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs)10 μL. PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 加熱3 min；然后共進(jìn)行30個循環(huán)：94 ℃ 變性30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s；最后在72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物各取5 μL與5 μL的100 bp DNA ladder用2.0%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在80 V電壓下電泳15 min，再用0.5 g/mL的溴乙錠(EB，ehidium bromide)染色10 min后在波長365和254 nm的紫外燈下觀察。顯示單一、明亮擴(kuò)增區(qū)段長度條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(BenA約400 bp，ITS約600 bp)由生物技術(shù)有限公司用ABI3730(Applied Biosystems，Drive Foster City，CA，USA)進(jìn)行雙向直通測序。原始序列用軟件Bioedit 7.0.9[21]進(jìn)行人工校對、編輯，得到準(zhǔn)確無誤的全區(qū)段序列并提交到GenBank。紫籃狀菌組的10個物種的模式菌株和本研究的2個菌株及外群螺旋藍(lán)狀菌(T.helicus(Raper & Fennell) C.R. Benj)模式菌株CBS 335.48的BenA和ITS序列(Table 1)，以及BenA-ITS的組合序列分別用MEGA 5[22]進(jìn)行對位排列(alignment)后，修剪掉序列不對齊的位點(diǎn)做成3個序列矩陣，然后采用最大可能法(Maximum Likelihood，ML)分析，并用自展法(bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù)評估各分支的可靠性，其中空格(gaps)選擇“partial deletion[23]”。另外，這3個序列矩陣還采用貝葉斯法推斷(Bayes Inference，BI)計(jì)算各分支的后驗(yàn)概率(posterior probability)[24]。

2 結(jié)果

2.1 新紀(jì)錄種的形態(tài)學(xué)描述

蟲癭籃狀菌Talaromyces cecidicola(Seifert, Hoekstra & Frisvad) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert，Stud. Mycol. 71: 175. 2011(圖1)。

≡PenicilliumcecidicolaSeifert，Hoekstra & Frisvad，Stud. Mycol. 50: 520. 2004[25]。

注：(a, b) 在CYA和MEA上25 ℃7 d；(c, d) 分生孢子梗；(e，f) 分生孢子，標(biāo)尺：10 μm。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃7 d，菌落直徑27-29 mm，較薄，平坦，中央稍帶短絮，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，流蘇狀；質(zhì)地絨狀兼短束狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，暗綠色，近于俄羅斯綠色至鎳綠色(Russian Green to Nickel Green，R. Pl. XLII，XXXIII)；菌體白色；無色小滴滲出液少量；無可溶性色素；背面中央呈暗紅色，近于栗色(Maroon，R. Pl. I)，邊緣變淺至暖皮黃色(Warm Buff，R. Pl. XV)。

在麥芽精瓊脂(MEA )上25 ℃7 d，菌落直徑31-33 mm，較薄，表面平坦，中部稍厚，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，流蘇狀；質(zhì)地絨狀兼短束狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，中部呈淺藍(lán)綠色，近于尼亞加拉綠色至深瓷綠色(Niagara Green to Dark Porcelain Green，R. Pl. XXXIII )；菌絲體呈白色；淡黃小滴滲出液少量；可溶性色素?zé)o；背面中部呈褐紅色，近于維多利亞色(Victoria Lake，R. Pl. I)，外圍變淺至淺褐黃色。

在CYA上37 ℃ 7 d，形成2 mm的菌落，在CYA上5 ℃ 7 d，未生長。分生孢子梗發(fā)生于表面菌絲和菌絲束，菌絲束300-1000 μm，孢梗莖60-200 μm×3-3.5 μm，壁光滑；帚狀枝雙輪生、三輪生和四輪生或更復(fù)雜，排列不緊密；?；枯?-8個，10-15 μm×2.5-3 μm；瓶梗披針形，每輪4-6個，10-15 μm×2.5-3 μm，梗頸較短較細(xì)；分生孢子橢球形至檸檬形，3-4 μm×2-3 μm，壁光滑。

主要特征：生長較快，在37 ℃生長局限，產(chǎn)生菌絲束但不明顯，分生孢子暗藍(lán)綠色；顯微鏡載片帶綠色，帚狀枝雙輪生、三輪生和四輪生或更復(fù)雜，排列不緊密；瓶梗披針形，分生孢子橢球形至檸檬形，3-4 μm×2-3 μm，壁光滑. 該種產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物apiculide A及其它未定產(chǎn)物[25]。

分布和基物：河南衛(wèi)輝市龐寨鄉(xiāng)柳衛(wèi)村農(nóng)田土壤AS3.16006=WH6-2，35° 26′ 31.2″N 114° 18′ 10.8″E，70 m。

偽子座籃狀菌Talaromyces pseudostromaticus(Hodges，G.M. Warner & Rogerson) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert，Stud. Mycol. 70: 176. 2011(圖 2) 。

≡Penicillium pseudostromaticumHodges，G.M. Warner & Rogerson, Mycologia 62: 1106. 1970[26]。

注：(a, b)在CYA和MEA上25 ℃7 d；(c) 在MEA上25 ℃14 d，可見向光性菌絲束；(d) 菌絲束結(jié)構(gòu)；(e) 分生孢子；(f-h) 分生孢子梗，標(biāo)尺：10 μm。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃7 d，菌落直徑21-23 mm，較薄，平坦，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，無規(guī)則；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，暗灰綠色，近于(Andover Green，R. Pl. XLVII)；菌體白色；無滲出液；無可溶性色素；背面呈暗紅色，近于牛血紅色(Ox-Blood Red，R. Pl. XXXII)。

在麥芽精瓊脂(MEA )上25 ℃7 d，菌落直徑36-38 mm，較薄，表面平坦，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，流蘇狀；質(zhì)地絨狀，14 d后產(chǎn)生長約5-8 mm的菌絲束，具有向光性；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，暗灰綠色，近于(Andover Green to Pea Green，R. Pl. XLVII)；菌絲體呈白色；滲出液無；可溶性色素?zé)o；背面呈紅木色(Mahogany Red，R. Pl. II)。

在CYA上37 ℃7 d，未生長，在CYA上5 ℃7 d，未生長。

分生孢子梗發(fā)生于表面菌絲和菌絲束，14 d后菌絲束長達(dá)5-8 mm，孢梗莖50-150 μm×3-5 μm，壁光滑；帚狀枝雙輪生，偶見三輪生和不規(guī)則生，排列緊密；副枝2-4個，排列緊，密, 15-25 μm×3-4 μm；?；枯?-6個，排列緊密，10-15 μm×2.5-4 μm；瓶梗披針形，每輪4-6個，排列緊密，10-15 μm×2.5-3 μm；分生孢子近球形至橢球形，3-4 μm×2-3μm，壁光滑。

主要特征：生長適度，在MEA上14 d后產(chǎn)生具有向光性的菌絲束；帚狀枝雙輪生，偶見三輪生和不規(guī)則生，排列緊密；瓶梗披針形，分生孢子近球形至橢球形，壁光滑。該種產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，如mitorubrinic acid，secalonic acid D 和Monascusred pigment (azaphilone)[12]。

分布和基物：內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗胡楊林(Populuseuphraticaforest)土壤AS3.16005=EJ2-12，42° 0′ 36.0″ N 101° 13′ 26.4″ E，1300 m。

2.2 新紀(jì)錄種的分子種系學(xué)證據(jù)

PCR擴(kuò)增BenA和ITS分別得到長約400 bp和600 bp序列的擴(kuò)增子(amplicon), 經(jīng)與Sect.Purpurei的10種模式菌株和外群模式菌株(Table 1)進(jìn)行對位排列并修剪后分別得447(BenA)個位點(diǎn)和522(ITS)個位點(diǎn)的矩陣，BenA-ITS鏈接矩陣共 969 位點(diǎn)。

基于BenA、ITS和BenA- ITS這三個序列矩陣得到的系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示菌株AS3.16006與T.cecidicola模式菌株CBS 101419同在一個分支，bootstrap支持率分別為100%、95%、99%，后驗(yàn)概率分別為 1.00、0.98、1.00；菌株AS3.16005與T.pseudostromaticus模式菌株CBS 470.70同在一個分支，bootstrap支持率分別為99%、99%、90%，后驗(yàn)概率分別為1.00、1.00、1.00。但在ITS的系統(tǒng)樹中，T.pseudostromaticus和T.pittii(Quintan.) Samson，N. Yilmaz，F(xiàn)risvad & Seifert 無法區(qū)分。BenA和BenA-ITS 均支持菌株AS3.16006鑒定為T.cecidicola，AS3.16005鑒定為T.pseudostromaticus. 單獨(dú)ITS系統(tǒng)樹分辨率較低，無法確定菌株AS3.16005的鑒定(圖 3-5)。

圖3 基于BenA的ML系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株AS3.16006與T. cecidicola的模式菌株CBS 101419同在一個分支，bootstrap支持率為100%，BI后驗(yàn)概率為1；菌株AS3.16005與T. pseudostromaticus的模式菌株CBS 470.70同在一個分支，bootstrap支持率為99%，BI后驗(yàn)概率為1，標(biāo)尺=0.05每核苷酸替代率

圖4 基于ITS1-5.8S-ITS2的ML系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株AS3.16006與T. cecidicola的模式菌株CBS 101419同在一個分支，bootstrap支持率為95%，BI后驗(yàn)概率為0.98；菌株AS3.16005與T. pseudostromaticus的模式菌株CBS 470.70同在一個分支，bootstrap支持率為99%，BI后驗(yàn)概率為1，標(biāo)尺=0.02每核苷酸替代率

圖5 基于BenA-ITS的ML系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株AS3.16006與T. cecidicola的模式菌株CBS 101419同在一個分支，bootstrap支持率為99%，BI后驗(yàn)概率為1；菌株AS3.16005與T. pseudostromaticus的模式菌株CBS 470.70同在一個分支，bootstrap支持率為90%，BI后驗(yàn)概率為1，標(biāo)尺=0.02每核苷酸替代率

3 討論

我國的T.cecidicola菌株AS3.16006比模式菌株CBS 101419生長稍慢 (CYA: 27-29 vs. 33-34，MEA: 31-33 vs. 37-38 mm)，而且其在CYA和MEA上產(chǎn)生絨狀兼稍微顆粒狀菌落，模式菌株則產(chǎn)生絮狀兼繩狀菌落。但在其它菌落形態(tài)上二者非常相似，比如它們均產(chǎn)生大量藍(lán)綠色分生孢子，菌落背面呈棕紅色，在37 ℃生長局限。在顯微形態(tài)上，我國菌株AS3.16006產(chǎn)生一些比模式菌株相對復(fù)雜的分生孢子梗，但在其它方面則幾乎完全相同，比如它們均產(chǎn)生大型的三輪生帚狀枝，分生孢子呈橢球形至檸檬型，壁光滑[12, 26]。在分子特征上，我國菌株AS3.16006與模式菌株的BenA和ITS序列完全相同, 因此可以確定菌株AS3.16006鑒定為T.cecidicola(圖3-5)。

Talaromycespseudostromaticus是一個特征比較明顯的種，比如其在培養(yǎng)時間較長時會產(chǎn)生向光性的菌絲束，產(chǎn)生雙輪生和三輪生及不規(guī)則帚狀枝和壁光滑的分生孢子。我國菌株AS3.16005均具有上述特征，而且其BenA和ITS序列與模式菌株CBS 470.70完全相同. 雖然T.pseudostromaticus和T.pittii的ITS序列完全一樣，但他們在形態(tài)上比較容易區(qū)分，例如T.pittii產(chǎn)生浸潤狀菌落且產(chǎn)生稀疏的分生孢子或幾乎不產(chǎn)生分生孢子，而T.pseudostromaticus則產(chǎn)生絨狀菌落和大量分生孢子。雖然T.pittii也產(chǎn)生菌絲束，但其長度要比T.pseudostromaticus的小得多(≤1 mm vs. 5-8 mm)。還有，T.pittii產(chǎn)生比較簡單的雙輪生和單輪生帚狀枝，而T.pseudostromaticus則產(chǎn)生比較復(fù)雜的帚狀枝，如雙輪生、三輪生和不規(guī)則生[12, 26]。根據(jù)以上這些形態(tài)區(qū)別，菌株AS3.16005不會被錯誤鑒定為T.pittii，而且依據(jù)BenA序列則可以可靠地區(qū)分它們(圖3)。