羊肚菌母種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究

王靜之, 黨芳志, 王 玲, 曹建剛, 敬 樊,毛儀楠

(商洛農(nóng)業(yè)科學研究所,陜西 商洛 726000)

羊肚菌(MorchellaesculentaPers. et Amans)營養(yǎng)豐富，味道鮮美，富含人體所需的營養(yǎng)元素，是一種珍稀類野生食藥用菌，幾乎遍布我國各個省區(qū)[1～3]。自明代我國開始有關于羊肚菌藥用功效的記載，但一直對其生物學特性缺乏深入了解[4～5]。2015年以來羊肚菌在商洛各地開始大面積人工栽培，但在母種保藏、分離和菌種培養(yǎng)方面依然存在許多問題。為進一步了解羊肚菌的生物學和營養(yǎng)學特性，本試驗研究了在不同營養(yǎng)元素和濃度下羊肚菌菌絲的生物學特性，并繪制出菌絲生長曲線，以期明晰不同營養(yǎng)元素對菌絲生長的影響大小，篩選出能夠加速或抑制菌絲生長的元素，從而優(yōu)化母種培養(yǎng)基，為菌種培養(yǎng)、保藏、栽培生產(chǎn)和找出適宜羊肚菌母種分離和保藏的培養(yǎng)基的選擇提供可供參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株代號為1號，由陜西省微生物研究所提供。

1.2 試驗配方

PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，水1 000 mL。

無碳培養(yǎng)基：硝酸鉀15 g、瓊脂18 g、水1 000 mL[1]。

無氮培養(yǎng)基：蔗糖20 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL[1]。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌的菌絲生長曲線 將供試羊肚菌菌株菌種塊(直徑4 mm)接在PDA平板培養(yǎng)基中心位置上，在23±1℃溫度下培養(yǎng)，設置5個重復，采用十字交叉法，每12 h測定菌絲生長速度并繪制菌絲生長曲線。

1.3.2 不同磷酸二氫鉀濃度下菌絲生長特性試驗 供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，分別接種于磷酸二氫鉀含量為0 、0.01 g/100 mL、0.02 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.04 g/100 mL、0.05 g/100 mL的培養(yǎng)皿中，每個菌株5個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

1.3.3 不同硫酸鎂濃度下菌絲生長特性試驗 供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，分別接種于硫酸鎂含量為0 mL、0.01 g/100 mL、0.02 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.04 g/100 mL、0.05 g/100 mL的培養(yǎng)皿中，每個菌株5個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

1.3.4 不同碳源對菌絲生長特性的影響試驗 在無糖培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖醇、果糖、甘露糖、乳糖制成不同碳源培養(yǎng)基。供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，分別接種于7種培養(yǎng)皿中，每個菌株5個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

1.3.5 不同氮源對菌絲生長特性的影響試驗 在無氮培養(yǎng)基中分別加入純氮含量為0.2%的玉米粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸鉀、硝酸銨、麩皮制成7種不同氮源培養(yǎng)基。供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，分別接種于不同氮源培養(yǎng)皿中，每個菌株5個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度；

1.3.6 不同淀粉濃度對菌絲生長特性影響試驗 在無碳培養(yǎng)基中分別加入含量為1%、2%、3%、4%、5%、6%的淀粉。供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，接種于不同淀粉濃度的培養(yǎng)皿中，每個菌株3個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

1.3.7 不同酵母膏濃度對菌絲生長特性影響試驗 在無氮培養(yǎng)基中分別加入純氮含量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的酵母膏。供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，接種于不同酵母膏濃度的培養(yǎng)皿中，每個菌株3個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

表1 羊肚菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗因素水平

1.3.8 母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 根據(jù)試驗1.3.4和1.3.5選取淀粉、酵母膏、磷酸二氫鉀和硫酸鎂為4個影響羊肚菌菌絲生理特性的因素，根據(jù)1.3.2、1.3.3、1.3.6、1.3.7確定4個因素適宜的3個水平，列出母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗因素水平表和L9(34)正交試驗表，按照正交試驗表給出的處理配制母種培養(yǎng)基。供試菌株活化后，取直徑4 mm的菌種塊，接種于不同培養(yǎng)基上，每個菌株3個重復，在23℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)。每12 h測量菌絲生長速度，觀察記錄菌絲顏色、長勢、菌絲的濃密程度和氣生菌絲的發(fā)達程度。

表2 羊肚菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌的菌絲生長曲線

由圖1可以看出，在固體培養(yǎng)基上23℃±1℃培養(yǎng)5 h后，接種塊萌發(fā)，培養(yǎng)12 h菌絲延長0.4 cm，菌落直徑達1.2 cm，后隨著培養(yǎng)時間增加菌絲長勢增強，菌落直徑增大。36 h到48 h菌絲延長1.06 cm，菌絲長勢最強，菌落直徑為6.43 cm。隨后菌絲長勢逐漸降低，菌落直徑逐漸增大，直至長滿平皿。

圖1 PDA培養(yǎng)基上菌絲隨時間的生長曲線

2.2 不同硫酸鎂濃度對菌絲生長特性的影響試驗

由表3可知，不同硫酸鎂濃度下菌絲平均生長速度相當，均為2.13 cm/d，4 d長滿平皿。和對照組相比，5個濃度梯度培養(yǎng)基上菌絲生長速度和菌絲濃密度、氣生菌絲旺盛程度差異不大。在培養(yǎng)過程中，硫酸鎂濃度為0.01%和0.03%培養(yǎng)基上菌落直徑最大。0.04%和0.05%時菌絲稀疏細弱、氣生菌絲少，菌落顏色淺。綜合菌絲生長速度、長勢分析，0.03%硫酸鎂為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基。

表3 不同硫酸鎂濃度下菌絲生長特性

2.3 不同磷酸二氫鉀濃度對菌絲生長特性的影響試驗

由表4可得，磷酸二氫鉀濃度為0.00%、0.01%、0.02%時菌絲平均生長速度快，為2.43 cm/d，3.5 d菌絲長滿平皿，其余濃度菌絲平均生長速度相當，均為2.13 cm/d，4 d長滿平皿。磷酸二氫鉀濃度為0.01%和0.02%時，培養(yǎng)基上菌絲整個生長過程中菌落直徑與對照相當；磷酸二氫鉀濃度為0.03%、0.04%、0.05%培養(yǎng)基上菌絲整個生長過程中菌落直小于對照組，且相同時間上，磷酸二氫鉀濃度越大菌落直徑越小。綜合菌絲生長速度、長勢分析，0.02%磷酸二氫鉀為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基。

表4 不同磷酸二氫鉀濃度下菌絲生長特性

2.4 不同碳源對菌絲生長特性影響試驗

由表5可得，不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長隨時間變化的一致，符合菌絲在固體培養(yǎng)基上生長曲線的變化。但不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長速度、菌絲濃密程度、菌絲顏色等都存在差異。3號培養(yǎng)基(淀粉)菌絲平均生長速度最快，為2.43 cm/d，3.5 d菌絲長滿平皿，菌絲白色、健壯、濃密。4號培養(yǎng)基(α-乳糖)菌絲平均生長速度為2.00 cm/d，4d菌絲長滿平皿，菌絲白色、健壯、濃密。1號(葡萄糖)、2號(蔗糖)培養(yǎng)基菌絲平均生長速度相當為1.77 cm/d，4.5 d菌絲長滿平皿，菌絲菌絲白色、健壯、濃密。5號(木糖醇)、6號(甘露醇)培養(yǎng)基菌絲平均生長速度相當為1.70 cm/d，5d菌絲長滿平皿，菌絲稀疏、細弱、透明。7號(D-果糖)培養(yǎng)基菌絲平均生長速度為1.54 cm/d，5.5 d長滿平皿，菌絲稀疏、細弱、透明。綜合菌絲生長速度、長勢分析，淀粉為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基碳源。

表5 不同碳源培養(yǎng)基各菌絲生長特性

2.5 不同氮源對菌絲生長特性影響試驗

由表6可得，不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生長隨時間變化一致(4號培養(yǎng)基除外)，菌絲在固體培養(yǎng)基上的變化符合生長曲線，但不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生長速度、菌絲濃密程度、菌絲顏色等都存在差異，1號(玉米粉)菌絲平均生長速度最快，為3.4 cm/d，2.5 d長滿平皿，菌絲灰白、較濃密；7號(麩皮)菌絲平均生長速度為2.83 cm/d，3 d長滿平皿，菌絲灰白、一般濃密，中心菌絲稀疏，邊緣菌絲旺盛；2號(蛋白胨)、3號(酵母膏)菌絲平均生長速度相同，均為2.43 cm/d，3.5 d長滿平皿，菌絲灰白、邊緣整齊、健壯且濃密、氣生菌絲旺盛；5號(硝酸鉀)菌絲平均生長速度為2.13 cm/d，4 d長滿平皿，中心菌絲旺盛、較濃密，邊緣菌絲較稀疏；6號(硝酸銨)菌絲平均生長速度為1.78 cm/d，4.5 d長滿平皿，中心菌絲濃密，灰白，氣生菌絲旺盛，邊緣菌絲稀疏；4號(尿素)培養(yǎng)7 d，菌種塊一直未萌發(fā)。綜合菌絲生長速度、長勢分析，酵母膏為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基氮源。

表6 不同氮源培養(yǎng)基各菌絲生長特性

2.6 不同淀粉濃度對菌絲生長特性影響試驗

由表7可得，不同淀粉含量培養(yǎng)基上菌絲生長特性存在差異。淀粉濃度為6%時，菌絲平均生長速度最快，為2.83 cm/d，3.0 d長滿平皿，菌絲灰白、濃密、氣生菌絲旺盛。淀粉濃度為2%、3%、4%、5%、6%，菌絲平均生長速度相當，均為2.83 cm/d，3 d長滿平皿。淀粉濃度為1%時，菌絲平均生長速度最慢，為2.43 cm/d，3.5 d長滿平皿。綜合菌絲生長速度、每12 h觀察菌落分析長勢可得，在生長過程中菌落直徑、菌絲濃密度和氣生菌絲旺盛度與淀粉濃度均成正比，6%淀粉為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基碳源濃度。

表7 不同淀粉濃度培養(yǎng)基上菌絲生理特性

2.7 不同酵母膏濃度對菌絲生長特性影響試驗

由表8可得,不同酵母膏純氮含量培養(yǎng)基上菌絲生長特性存在差異。培養(yǎng)基中純氮濃度為0.1%時，菌絲平均生長速度最快，為2.83 cm/d，3.5 d長滿平皿，菌絲濃密、氣生菌絲旺盛，菌落邊緣長勢一致，菌絲灰白；純氮濃度為0.2%、0.3%時，菌絲平均生長速度為2.13 cm/d，4 d長滿平皿，且純氮濃度0.2%培養(yǎng)基上的菌落直徑更大、菌絲更濃密。純氮濃度為0.4%、0.5%時，菌絲平均生長速度均為1.89 cm/d，4.5 d長滿平皿，生長過程中，且純氮濃度0.4%培養(yǎng)基菌落直徑更大、菌絲更濃密。純氮濃度0.6%時，接種塊32 h后萌發(fā)，晚于其他組，菌絲平均生長速度最慢，為1.70 cm/d，5.0 d長滿平皿，生長過程中菌落直徑均處于最低，菌絲稀疏、氣生菌絲少。綜合菌絲生長速度、每12 h觀察菌落分析長勢可得，在生長過程中菌落直徑、菌絲濃密度和氣生菌絲旺盛度與酵母膏純氮含量濃度均成反比，0.1%酵母膏純氮含量為最適宜羊肚菌菌絲生長的培養(yǎng)基氮源濃度。

表8 不同濃度培養(yǎng)基上菌絲生理特性

2.8 母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

由表9、表10采用正交試驗直觀分析法，結(jié)合不同培養(yǎng)基上菌絲生理特性表可知，羊肚菌母種培養(yǎng)基最佳配方為：淀粉6%，酵母膏純氮含量0.1%，磷酸二氫鉀0.03%，硫酸鎂0.02%，其菌絲生長速度最快，為3.40cm/d，2.5d長滿平皿，菌絲濃密，氣生菌絲旺盛。羊肚菌母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗各因素對菌絲生長速度影響的大小為：酵母膏>硫酸鎂>淀粉>磷酸二氫鉀。

表9 不同處理培養(yǎng)基上菌絲生理特性

表10 母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗正交

3 結(jié)論與討論

羊肚菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上的生長曲線符合微生物生長曲線規(guī)律，有著生長遲緩期、快速生長期、遲滯期3個階段。接種后12h內(nèi)接種塊恢復適應新環(huán)境后萌發(fā)，蔓延至培養(yǎng)基上，12～48h菌絲進入快速生長期，菌絲快速增加，48h后菌絲長速逐漸變慢，最后至菌絲長滿平皿。

在PDA培養(yǎng)基上添加硫酸鎂、磷酸二氫鉀，菌絲平均生長速度、菌絲濃密度、氣生菌絲旺盛和菌落顏色與對照組差異不大。

不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生理特性存在統(tǒng)一性和差異性。一致性為：生長過程中，菌落邊緣整齊，菌絲長勢一致，呈灰白色。差異性為：每種碳源的菌絲生理特性不一，其中淀粉為碳源時菌絲生理特性表現(xiàn)最好，菌絲生長速度明顯加快，菌絲濃密健壯，氣生菌絲旺盛，中心菌絲和邊緣菌絲一致，淀粉含量與菌落直徑、菌絲濃密度和氣生菌絲旺盛均呈正比，培養(yǎng)基中最佳淀粉含量為6%。其次為葡萄糖、蔗糖，菌絲生長速度居中，菌絲濃密健壯，但培養(yǎng)時間越長，中心菌絲老化，蔗糖更明顯；以乳糖為碳源，菌絲生長速度僅次于以淀粉為碳源，但菌絲長勢一般；以木糖醇、甘露醇、果糖為碳源，菌絲生長速度慢，果糖最慢，菌絲細弱、稀疏，氣生菌絲少。因此羊肚菌母種培養(yǎng)基碳源可以選擇淀粉、葡萄糖、蔗糖。

不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生理特性存在統(tǒng)一性和差異性。一致性為：生長過程中，菌落邊緣整齊，菌絲長勢一致，呈灰白色。差異性為：每種氮源的菌絲生理特性不一，以酵母膏為氮源時菌絲生理特性表現(xiàn)最好，菌絲生長速度快，菌絲長勢整齊，菌絲中心和邊緣長勢一致，菌絲濃密，氣生菌絲旺盛，酵母膏含量與菌落直徑、菌絲濃密度和氣生菌絲旺盛均呈反比，培養(yǎng)基中最佳純氮含量為0.1%。以玉米粉為氮源時，菌絲生長速度最快，菌絲較濃密，氣生菌絲較旺盛；以蛋白胨為氮源時，菌絲生長速度快，菌絲濃密，氣生菌絲旺盛，這是由于玉米粉、蛋白胨、酵母膏為混合物，營養(yǎng)成分復雜，除含有氮源，也高含淀粉、單糖、多糖、維生素、無機鹽等物質(zhì)，富含菌絲生長所需營養(yǎng)。以單一無機鹽硝酸鉀或硝酸銨為氮源菌絲生長速度比以有機物為氮源慢，兩種無機鹽各有優(yōu)點，硝酸鉀為氮源菌絲生長速度更快，硝酸銨為氮源中心菌絲更加濃密，氣生菌絲更加旺盛。麩皮為氮源菌絲生長速度僅次于玉米粉為氮源，但菌絲較弱，且隨著時間延長中心菌絲變細弱，菌絲老化。尿素作為氮源菌絲不萌發(fā)，可能因為尿素對熱不穩(wěn)定，加熱至150～160℃將脫氨成縮二脲，在高壓滅菌條件下，尿素脫氨形成縮二脲，使培養(yǎng)基中縮二脲濃度過高，對菌絲產(chǎn)生抑制作用，導致菌絲不萌發(fā)。因此羊肚菌母種培養(yǎng)基氮源優(yōu)選酵母膏，也可以選擇玉米粉、蛋白胨。

通過正交試驗直觀分析法得出，各因素對菌絲生長速度影響的大小為：酵母膏>硫酸鎂>淀粉>磷酸二氫鉀。羊肚菌母種培養(yǎng)基最佳配方為：淀粉6%，酵母膏純氮含量0.1%，磷酸二氫鉀0.03%，硫酸鎂0.02%。