基于金納米簇構(gòu)建熒光傳感方法在生化分析中的應(yīng)用研究

范曉玉,張 聰,張 帥,胡瑩瑩,管仁田,岳巧麗

(聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 山東聊城252059)

0 引言

在生物化學(xué)的分析中，物質(zhì)的檢測(cè)方法有很多。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有氣相色譜、電化學(xué)分析、質(zhì)譜檢測(cè)、毛細(xì)管電泳等，但是這些方法有一定的局限性，如檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁瑣或儀器復(fù)雜等。而熒光探針的制備便可以克服這些問題，具有靈敏度高、選擇性好、測(cè)量方便等優(yōu)點(diǎn)。其中，熒光金屬納米簇便是一種性質(zhì)優(yōu)秀的用于物質(zhì)檢測(cè)的熒光探針。它是一種新型的具有獨(dú)特光學(xué)、電學(xué)和化學(xué)性質(zhì)的超微納米材料，它具有亞納米尺寸(小于2 nm)，通常由幾個(gè)到幾十個(gè)金屬原子構(gòu)成，處于單個(gè)金屬原子和較大的金屬納米顆粒之間的過渡狀態(tài)[1]。由于納米團(tuán)簇的尺寸接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，因此它們呈現(xiàn)出離散的、尺寸可調(diào)的電子躍遷和較強(qiáng)熒光發(fā)射性[2]。具有如熒光發(fā)射可調(diào)、斯托克斯位移大、熒光穩(wěn)定性高、量子產(chǎn)率較高等優(yōu)點(diǎn)。由于熒光金屬納米簇通常是通過生物礦化方式制備的，一些生物分子(如小硫醇分子、聚合物、蛋白質(zhì)和核酸)常被作為模板劑來進(jìn)行熒光金屬納米簇的合成制備[3-9]。所以與傳統(tǒng)的量子點(diǎn)(QD)和有機(jī)染料相比，熒光金屬納米簇的毒性大大降低,生物相容性顯著提高[10]。因此，它們作為一種新型的納米熒光探針，在生化分析、環(huán)境檢測(cè)、醫(yī)學(xué)成像和腫瘤治療等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

近年來，DNA以其優(yōu)異的分子識(shí)別性能、成本效益和對(duì)某些金屬離子的親和力，被認(rèn)為是合成熒光金屬簇的良好模板[11-14]。而銀離子能高選擇地結(jié)合胞嘧啶并形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而合成熒光性優(yōu)異的銀納米簇[15-20]。銅離子在具有和金、銀離子相似性能的同時(shí)，具有更高的金屬簇合成效率和更為低廉的價(jià)格，這為銅納米簇在傳感領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用提供了便利[21-27]。然而，這些納米團(tuán)簇都面臨著低穩(wěn)定性的缺點(diǎn)，這限制了它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中的實(shí)際應(yīng)用[28]。同時(shí)，金納米團(tuán)簇(AuNCs)作為熒光金屬納米團(tuán)簇的另一個(gè)分支，由于其生物相容性和光穩(wěn)定性能優(yōu)異，在生物化學(xué)分析領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。由于可通過Au-S鍵形成AuNCs的組裝，AuNCs合成配體的選擇上更為廣泛。這使得大量高靈敏度和選擇性的金納米簇傳感器被人們所制備和開發(fā)，拓寬了金納米簇的應(yīng)用傳感領(lǐng)域。

在過去的幾十年中，報(bào)道了很多用于制備性質(zhì)穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、水分散性和生物相容性好的AuNCs的方法?，F(xiàn)階段主要有兩種方法來制備AuNCs，一是通過配體或模板來還原三價(jià)金離子制備[29]，另一種是通過蝕刻更大的非熒光性金納米顆粒來制備[30]，AuNCs的光學(xué)性質(zhì)和生物兼容性依賴于他們的尺寸，表面配體和模板以及周圍的介質(zhì)。當(dāng)加入分析物后，可通過改變配體的性質(zhì)或環(huán)境來阻礙熒光配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移，從而淬滅AuNCs熒光[31]。因此，AuNCs可以被用于研究開發(fā)靈敏和選擇性的傳感與成像系統(tǒng)，用于檢測(cè)各種分析物。

本文中，我們將介紹近年來AuNCs檢測(cè)生物化學(xué)物質(zhì)的各種設(shè)計(jì)方法。并且以檢測(cè)的目標(biāo)物進(jìn)行分類，綜述了2016-2020年來AuNCs在光學(xué)傳感方面的研究進(jìn)展。

1 檢測(cè)無機(jī)離子

金屬離子廣泛存在于生物體中，參與生物體內(nèi)各種復(fù)雜的生化過程，以維持生命體系的一切正?；顒?dòng)，但許多金屬離子(如Cu2+、Fe3+等)超過一定濃度時(shí)均具有毒性作用?；诮鸺{米簇較高的物化活性，目前已構(gòu)建了多種簡(jiǎn)便的傳感平臺(tái)用于金屬離子的高靈敏檢測(cè)[28,32-64]。而當(dāng)前對(duì)于陰離子的檢測(cè)種類并不多，主要是S2-、CN-和NO2-以及鹵素離子[65-70]。在本節(jié)中，我們將重點(diǎn)討論用于檢測(cè)無機(jī)離子的金納米簇的相關(guān)研究，并舉例介紹其檢測(cè)機(jī)理。所列舉的檢測(cè)物質(zhì)如表1所示。

1.1 檢測(cè)金屬離子

重金屬離子如Hg2+、Pb2+和Cu2+可與多種細(xì)胞成分結(jié)合，如蛋白質(zhì)、酶和核酸，使得它們的生物學(xué)功能改變，這可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病甚至死亡。由于Hg2+與Au+之間存在親金屬相互作用，這種Au+(4f145d10)與Hg2+(4f145d10)之間存在的d10-d10親金屬相互作用會(huì)引起金簇?zé)晒獯銣?，因此許多敏感的選擇性傳感系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出來用于檢測(cè)Hg2+[28，32-45]。 Yang等通過微波輔助，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為模板合成了牛血清白蛋白保護(hù)的金納米簇(BSA-AuNCs)[32]。不同于以往需要加熱幾十個(gè)小時(shí)來制備BSA-AuNCs的方法，微波(microwave，MW)合成法因?yàn)榭梢蕴峁┚鶆虻募訜岫蟠罂s短加熱時(shí)間。由于溶劑的介電常數(shù)與反應(yīng)物的介電常數(shù)不同，選擇性的介電加熱可以顯著提高直接傳遞給反應(yīng)物的能量，這通常會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部溫度的瞬時(shí)升高，因此只需要普通的微波烤箱并在短短幾分鐘內(nèi)就可以成功制備金簇。所制備的AuNCs顯示出強(qiáng)烈的紅色發(fā)射，較大的斯托克斯位移和較高的量子產(chǎn)率，其尺寸和組成上也更為均勻。在最佳的檢測(cè)條件下，對(duì)Hg2+的檢出限為2.98 nM[32]。Shuang等同樣通過微波合成法，以廉價(jià)的雞蛋清蛋白(egg white protein，ew)作為還原劑和封蓋劑，制備了具有遠(yuǎn)-紅/近-紅外發(fā)射的蛋清保護(hù)的金納米團(tuán)簇(ew@AuNCs)[33]。得到的AuNCs在667 nm處有較強(qiáng)的發(fā)射，量子產(chǎn)率7.23 %，較好的光穩(wěn)定性和較大的斯托克斯位移(>350 nm)。Hg2+和Cu2+可以使得ew@AuNCs的光致發(fā)光淬滅，當(dāng)加入乙二胺作為掩蔽劑后，該探針對(duì)Hg2+的檢測(cè)顯示出了極高的靈敏度，其檢出限為20 pM，比美國環(huán)境保護(hù)局在飲用水中限定的數(shù)值(10 nM)低500倍。因此，該方案在臨床、食品衛(wèi)生、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

表1 金納米簇對(duì)無機(jī)離子的檢測(cè)

出于應(yīng)用考慮。Su等利用金納米團(tuán)簇包埋牛血清白蛋白(AuNCs@BSA)納米纖維和氧化石墨烯(GO)，制備了一種新型的可檢測(cè)和分離汞離子(Hg2+)的雜化膜[34]。在EDC/NHS的幫助下，使得BSA納米纖維和氧化石墨烯共價(jià)結(jié)合，并且沿GO表面的皺紋和缺陷部位生長(zhǎng)。并通過簡(jiǎn)單的過濾過程制備了混合復(fù)合膜。該復(fù)合膜可高效的去除水中重金屬離子污染物[34]，其對(duì)Hg2+的吸附效率在第一周期可達(dá)到90.45%，并且可以多次重復(fù)分離過程而不會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)[34]。

溶菌酶(lysozyme，Lys)是一種由129個(gè)氨基酸殘基組成的低分子量球狀蛋白。由于含有自由羧基、氨基和四個(gè)二硫鍵，因此溶菌酶可以作為合成金簇的穩(wěn)定劑。Ilanchelian等合成了溶菌酶穩(wěn)定的金納米簇(Lys-AuNCs)，用于檢測(cè)水溶液中的Cu2+[46]。所合成的Lys-AuNCs平均粒徑2.5±0.3 nm，在紫外燈照射下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光和紅色光致發(fā)光。對(duì)Cu2+檢出限為9 nM并且具有良好的選擇性。Cu2+導(dǎo)致Lys-AuNCs淬滅機(jī)理是由于與Lys-AuNCs結(jié)合的Cu2+的順磁行為而導(dǎo)致Lys-AuNCs的激發(fā)電子在系統(tǒng)間交叉時(shí)失去能量，從而生成了基態(tài)絡(luò)合物所引起的靜態(tài)淬滅[71]。這種基于Lys-AuNCs的熒光納米傳感器制備簡(jiǎn)單快速，成本低，選擇性和靈敏度高，在檢測(cè)環(huán)境樣品和生物系統(tǒng)中的Cu2+方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

已有研究表明，Ag+對(duì)常規(guī)金簇的光致發(fā)光有一定的影響。然而，由于配體和核心構(gòu)象的差異，人們對(duì)Ag+誘導(dǎo)金簇?zé)晒庠鰪?qiáng)的機(jī)理有著不同的見解。在這些機(jī)制中，有些人認(rèn)為價(jià)態(tài)的變化是導(dǎo)致AuNCs光致發(fā)光增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。而在Zhou等的研究中，他們通過四氯金酸和谷胱甘肽(glutathione，GSH)溶液在不外加還原劑的條件下制備了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射性質(zhì)的金納米簇(aggregation-induced emission gold nanoclusters，AIE-AuNCs)。并且首次發(fā)現(xiàn)了Ag+可以顯著增加AIE-AuNCs的發(fā)光，而自身不發(fā)生氧化還原反應(yīng)[50]。這種熒光增強(qiáng)機(jī)制并不符合以往的規(guī)則，因此他們?cè)敿?xì)討論了可能的機(jī)理。根據(jù)先前文獻(xiàn)所報(bào)道，AIE-AuNCs的聚集可以引起發(fā)光增強(qiáng)[72]。但通過TEM圖像表征發(fā)現(xiàn)，Ag+引入后并沒有改變AIE-AuNCs粒徑，因此排除了Ag+誘導(dǎo)AIE-AuNCs的聚集引起的發(fā)光增強(qiáng)的可能。同時(shí)通過XPS確定了納米簇(NCs)的價(jià)態(tài)。證實(shí)了Ag+與AIE-AuNCs相連形成Ag@AIE-AuNCs的同時(shí)，其價(jià)態(tài)不發(fā)生變化。此外，當(dāng)向Ag@AIE-AuNCs中加入KBr時(shí)，它的發(fā)光特性可以完全恢復(fù)到AIE-AuNCs，這表明其發(fā)光的變化是可逆的，Ag可以從NCs中移除。同時(shí)其發(fā)光增強(qiáng)的快速響應(yīng)特性也表明了Ag+有可能錨定在AIE-AuNCs的殼層上，而非與金核相結(jié)合。因此，如圖1所示。Ag+通過與AIE-AuNCs表面富電子基團(tuán)相結(jié)合使得殼層電荷發(fā)生了轉(zhuǎn)移，從而影響其配體-金屬電荷轉(zhuǎn)移(ligand-to metal charge transfer，LMCT)或配體-金屬-金屬電荷轉(zhuǎn)移(ligand-to metal-metal charge transfer，LMMCT)來改變AIE-AuNCs的發(fā)光特性。這種AIE-AuNCs納米傳感器對(duì)Ag+的檢測(cè)靈敏、高效且選擇性好。其線性范圍為0.5 nM-20 μM，檢出限低至0.2 nM。該研究不僅首次將AIE-AuNCs用作銀離子納米傳感器，而且為提高AIE-AuNCs在無氧化還原反應(yīng)下的發(fā)光能力找到了一條新的途徑。

圖1 Ag+增強(qiáng)AIE-AuNCs發(fā)光原理示意圖[50]

Liu等，通過耦合碳點(diǎn)-硅球復(fù)合材料(carbon dots-silicon spheres composites，CSs)和金納米團(tuán)簇(AuNCs)，構(gòu)建了用于檢測(cè)Ag+的“開啟式”比例熒光探針[63]。為探索實(shí)驗(yàn)機(jī)理，Liu等研究了在添加Ag+之前和之后雙發(fā)射熒光探針(dual-emission fluorescent probes，CSA)CSA復(fù)合探針的zeta電位，發(fā)現(xiàn)在有和沒有Ag+的情況下zeta電位分別為-29.49 mV和-10.30 mV，Ag+在AuNCs上的熒光增強(qiáng)機(jī)理主要是由于Ag+固定在表面富電子基團(tuán)上引起的殼中電荷轉(zhuǎn)移的變化，從而影響了熒光的變化[50]。這與從以前的相關(guān)論文解釋是一致的。在380 nm的單次激發(fā)下，CSA分別在448和610 nm處表現(xiàn)出兩個(gè)熒光發(fā)射。加入Ag+時(shí)AuNCs的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而CSs的熒光保持不變[63]。隨著Ag+濃度的增加，CSA比例熒光探針的熒光顏色由藍(lán)色變?yōu)樽仙?，再變?yōu)榉奂t色。當(dāng)Ag+濃度在0-0.1 μM和0.1-10 μM的范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)L與Ag+濃度之比顯示出良好的線性關(guān)系，并且檢測(cè)限低至1.6 nM。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSA比例熒光探針在檢測(cè)Ag+時(shí)具有很高的選擇性和出色的靈敏度。與單熒光探針相比，CSA比例熒光探針提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可以有效消除背景信號(hào)和環(huán)境的干擾[63]，并且在這里第一次使用比率探針傳感器用于視覺檢測(cè)。利用CSA復(fù)合材料制備了便攜式瓊脂糖水凝膠，實(shí)現(xiàn)肉眼檢測(cè)Ag+的能力。這種雙發(fā)射比熒光探針有潛力應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和食品安全評(píng)估中的Ag+檢測(cè)，并且對(duì)重金屬離子的檢測(cè)具有重要的示范意義。

1.2 檢測(cè)陰離子

多年以來，氰化物陰離子(CN-)污染因其對(duì)環(huán)境特別是對(duì)生物的不利影響受到世界各國的廣泛關(guān)注。CN-可與細(xì)胞色素C氧化酶內(nèi)的血紅素輔因子中的Fe3+發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)合作用。使其氧傳輸功能迅速失效而導(dǎo)致人體死亡。因此，如圖2所示，Li等以雞蛋清蛋白(egg white protein，ew)為模板，在微波輔助的條件下合成了金銀納米團(tuán)簇(AuAgNCs@ew,GSNCs)，用于檢測(cè)CN-[65]。 在適當(dāng)?shù)臈l件下，HAuCl4和AgNO3先發(fā)生絡(luò)合，之后AuCl4-被蛋白質(zhì)中的酪氨酸所還原[73]，導(dǎo)致金、銀原子共同形成合金體系的核。由于金種的成核速率快于銀種，因此會(huì)首先生成AuNCs[74,75]。隨后，Ag+會(huì)與金種晶體表面形成金屬鍵[76]，并在金晶種的催化下還原沉積為AgNCs。最終在蛋白質(zhì)基體中共沉積，生成了金銀合金。所合成的金銀納米團(tuán)簇生物毒性低、穩(wěn)定性好、熒光性能好，可成功地應(yīng)用于細(xì)胞成像和溫度檢測(cè)。此外，相比于單金屬納米團(tuán)簇(AuNCs@ew)，銀離子的存在可以增強(qiáng)AuNCs的熒光強(qiáng)度，同時(shí)提高了對(duì)CN-檢測(cè)的靈敏度，這可能是由于“金銀協(xié)同作用”原理所導(dǎo)致的[65]。實(shí)驗(yàn)表明，CN-對(duì)GSNCs的熒光淬滅機(jī)理是因?yàn)镃N-會(huì)在氧氣(空氣)存在下將金和銀氧化為Au+和Ag+，并且通過σ-π配位鍵形成Au(CN)2-和Ag(CN)2-。這種現(xiàn)象類似于金/銀的蝕刻反應(yīng)，即金/銀核心的蝕刻而導(dǎo)致納米團(tuán)簇的尺寸減小，從而表現(xiàn)出熒光淬滅現(xiàn)象[65]。

圖2 AuAgNCs@ew的合成與CN-的檢測(cè)原理示意圖[65]

最近的研究表明，H2S水平的失調(diào)和多種疾病密切相關(guān)，例如阿茲海默癥、唐氏綜合征和癌癥等[67]。故對(duì)H2S在生理?xiàng)l件下的靈敏檢測(cè)變得尤為重要。由于S2-易于與Cu2+生成難溶CuS，因此可以通過Cu2+間接檢測(cè)出S2-濃度[66，67]。 Wu等通過谷胱甘肽保護(hù)的金納米團(tuán)簇(GSH-AuNCs)和Cu2+，建立了一種高選擇性、高靈敏度的S2-熒光檢測(cè)方法[66]。 Cu2+可以與金簇表面的羧基和氨基配位形成Cu-GSH絡(luò)合物，使得NCs到Cu2+之間發(fā)生有效的電荷轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致熒光淬滅。當(dāng)加入S2-后，S2-可以與Cu2+發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合作用，因而從Cu-GSH復(fù)合物中捕獲Cu2+并生成穩(wěn)定的CuS沉淀。最終使得金簇?zé)晒饣謴?fù)。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)Au2S具有較低的溶度積常數(shù)，因此理論上S2-也可能通過與金簇中的金原子結(jié)合而降低熒光。然而實(shí)驗(yàn)表明，只有在S2-濃度較高的情況下，才會(huì)發(fā)生一定程度的熒光減弱現(xiàn)象。其原因可能是S2-和帶負(fù)電荷的GSH之間的靜電斥力作用，以及由GSH組成的有機(jī)配體殼可以阻止S2-持續(xù)擴(kuò)散到金原子所導(dǎo)致的[66]。當(dāng)然，基于S2-結(jié)合金簇中的Au(I)降低熒光來建立對(duì)S2-傳感方法也是可行的。Shuang等就成功的合成了乙酰半胱氨酸穩(wěn)定的金簇(acetylcysteine stabilized gold nanoclusters，ACC@AuNCs)用于H2S的傳感[68]。其機(jī)理正是歸因于AuNCs中Au(I)與H2S反應(yīng)生成Au2S，并最終導(dǎo)致金簇顆粒尺寸的增大和熒光淬滅的發(fā)生。與其他陰離子、氨基酸和硫醇相比，該傳感器對(duì)H2S具有較高選擇性，其檢測(cè)限為1.8 nM，并在0.002至120 μM范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的響應(yīng)[68]。此外，還通過水樣和血清樣品對(duì)該熒光傳感器進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用考察，均取得了較為滿意的精確度和回收率結(jié)果。

碘離子的測(cè)定由于其重要性和緊迫性引起了人們的極大興趣。體內(nèi)缺碘可導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，如克汀病和地方性甲狀腺腫?；贒NA模板金/銀納米團(tuán)簇(DNA-Au/AgNCs)，Liu等開發(fā)了一種新型的熒光比色檢測(cè)平臺(tái)，用于碘離子的簡(jiǎn)單選擇性檢測(cè)[69]。 該工作以DNA為模板制備了熒光雙金屬Au/AgNCs (DNA-Au/AgNCs)，并將其作為碘離子檢測(cè)的選擇性探針。該檢測(cè)系統(tǒng)基于碘離子與DNA-Au/Ag NCs之間獨(dú)特的相互作用，碘離子的加入具有明顯的熒光淬滅作用，碘離子的線性范圍在0-10 μmol/L之間。DNA-Au/Ag的NCs溶液在加入I-后表現(xiàn)出明顯的熒光淬滅，并伴有明顯的顏色變化，從無色透明到紫紅色[69]。 因此，基于DNA-Au/AgNCs探針，開發(fā)了碘離子特異性檢測(cè)的雙信號(hào)平臺(tái)。檢測(cè)過程可以在室溫下快速進(jìn)行，不需要任何催化劑或氧化劑。該體系對(duì)離子的選擇性優(yōu)于大多數(shù)陰離子和金屬陽離子并且已成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中碘離子的測(cè)定。

2 檢測(cè)生物活性分子

近幾年來，各種各樣的蛋白質(zhì)(如胃蛋白酶、溶菌酶、雞蛋清蛋白、辣根過氧化物酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等)都已被成功的用于金簇的合成中。并且一些硫醇分子、樹狀大分子、氨基酸、肽、DNA等也均可作為配體參與金簇的合成。不同的配體具有不同的性質(zhì)，對(duì)金前體的氧化還原、電化學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性具有重要的作用[78]。因此金簇的識(shí)別和檢測(cè)范圍并不僅僅局限于無機(jī)離子。在本節(jié)中，將重點(diǎn)討論一些具有代表性的檢測(cè)酶、生物大分子和小分子的金納米簇[79-113]，所列舉的檢測(cè)物質(zhì)如表2所示。

表2 金納米簇對(duì)生物活性分子的檢測(cè)

2.1 檢測(cè)酶

哆醛水解的原理建立了一種可以靈敏檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)的回收型檢測(cè)方法[79]。Xu等認(rèn)為，對(duì)酶作為一種特殊的生物大分子，是由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其底物具有高度特異性和催化效能的蛋白質(zhì)或RNA。而通過底物與金納米簇傳感器之間存在的熒光響應(yīng)以及酶與底物之間的定量關(guān)系，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的間接檢測(cè)[79-92]。Xu等通過磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)和BSA-AuNCs之間的淬滅現(xiàn)象，以及堿性磷酸酶催化磷酸吡于AuNCs的熒光淬滅機(jī)理可大致分為三種：金簇聚集過程產(chǎn)生的熒光變化、熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)(FRET)和金簇自身配體環(huán)境的變化所導(dǎo)致的淬滅[79]。通過TEM或DLS表明，PLP添加前后的金簇并沒有發(fā)生明顯的形貌變化，因此排除了PLP誘導(dǎo)金簇發(fā)生聚集淬滅的可能性。此外，由于BSA-AuNCs的熒光發(fā)射光譜與PLP的吸收光譜沒有重疊，因此也排除了從BSA-AuNC到PLP之間的FRET現(xiàn)象的發(fā)生。所以Xu等推測(cè)其淬滅機(jī)理有可能是環(huán)境和BSA模板的構(gòu)象變化所導(dǎo)致的[79]。而通過之前的報(bào)道可知，PLP與BSA有兩個(gè)主要的高親和力結(jié)合位點(diǎn)(Ⅰ和Ⅱ)，PLP可與這兩個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)形成高度穩(wěn)定的配合物[114，115]。因此PLP的淬滅效應(yīng)可以歸因于PLP與配體之間的特異性相互作用[79]。與此同時(shí)，堿性磷酸酶可以催化磷酸吡哆醛水解生成吡哆醛(pyridoxal，PL)，而PL無法與BSA配體形成穩(wěn)定配合物。因此被PLP淬滅的熒光被堿性磷酸酶所恢復(fù)，從而間接檢測(cè)出堿性磷酸酶。該方法在1.0-200.0 U/L范圍內(nèi)具有良好的靈敏度，其檢出限為0.05 U/L。并且在多種生物酶中具有優(yōu)秀的選擇性。同時(shí)該傳感器可成功的應(yīng)用于人血清樣品中堿性磷酸酶的檢測(cè)，回收率在100.60-104.46 %之間。除此之外，還可基于PLP對(duì)BSA-AuNCs熒光的淬滅作用實(shí)現(xiàn)對(duì)PLP濃度的檢測(cè)。

同樣是基于配體環(huán)境變化導(dǎo)致金簇淬滅的機(jī)理，Chen等以3-巰基丙酸(3-mercaptopropionic acid，MPA)為模型配體，牛血清白蛋白作為模型蛋白，制備了強(qiáng)橙色熒光發(fā)射的水溶性金納米簇(BSA/MPA-AuNCs)。并通過Fe3+和焦磷酸鹽(pyrophosphate，PPi)構(gòu)建了對(duì)焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase)的高選擇性靈敏檢測(cè)[80]。如圖3所示，F(xiàn)e3+可以與BSA/MPA-AuNCs發(fā)生選擇性配位，造成從BSA/MPA-AuNCs到Fe3+D軌道的激發(fā)態(tài)非輻射電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致AuNCs的淬滅[116,117]。而PPi與Fe3+之間存在很高的親和力，它可以從BSA/MPA-AuNCs-Fe3+配合物中提取出Fe3+，從而很大程度上恢復(fù)溶液熒光。最后，在溶液中引入的焦磷酸酶能特異性地催化無機(jī)焦磷酸鹽水解成正磷酸鹽(orthophosphate，Pi)，而與PPi相比，Pi對(duì)Fe3+的親和力較低。因此BSA/MPA-AuNCs的熒光又再次被淬滅。這種通過熒光“關(guān)-開-關(guān)”過程所設(shè)計(jì)出的實(shí)時(shí)檢測(cè)焦磷酸酶活性的方法，具有實(shí)時(shí)性好、毒性低、選擇性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[80]。其金簇的熒光強(qiáng)度與焦磷酸酶的活性在0.1-3 U/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.07 U/L。并且可應(yīng)用于測(cè)定實(shí)際生物樣品中的焦磷酸酶的活性以及對(duì)焦磷酸酶抑制劑的效用做出評(píng)估。

圖3 基于BSA/MSA-AuNCs的PPase活性測(cè)定方法的原理圖[80]

胰蛋白酶是一種在胰腺腺泡細(xì)胞中形成的蛋白酶。主要參與催化賴氨酸和精氨酸殘基C末端的肽的水解。它的活性異常與胰腺癌和囊性纖維化有關(guān)[83]。另一方面，魚精蛋白富含賴氨酸和精氨酸殘基，是胰蛋白酶的理想底物。目前，魚精蛋白被廣泛用作肝素的解毒劑，以降低抗凝活性，還可用于延長(zhǎng)糖尿病治療中胰島素的釋放。但是過量使用魚精蛋白可能會(huì)導(dǎo)致血壓驟降、心率過緩、肺動(dòng)脈高壓或呼吸困難等不良影響。You等基于谷胱甘肽保護(hù)的金屬納米簇存在獨(dú)特的聚集誘導(dǎo)發(fā)射特性，利用氨基修飾的硅納米粒子(SiNPs)和GSH金簇(GSH-AuNCs)制備出了一種具有雙發(fā)射特性的新型納米雜化探針(SiNPs@GSH-AuNCs)，用于檢測(cè)魚精蛋白和胰蛋白酶[81]。如圖4所示，氨基改性的硅納米粒子和GSH金簇可以通過靜電作用自組裝形成球形粒子。從而使得GSH-AuNCs發(fā)生聚集誘導(dǎo)發(fā)射增強(qiáng)效應(yīng)(AIEE)，并在570 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光。而SiNPs在450 nm處保持自身藍(lán)色熒光，兩者構(gòu)成雙發(fā)射體系。當(dāng)加入魚精蛋白后，呈正電性的魚精蛋白會(huì)與SiNPs競(jìng)爭(zhēng)，并吸附到呈負(fù)電性的GSH-AuNCs表面，從而抑制其自組裝過程，發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象。而胰蛋白酶可以催化魚精蛋白的水解，使得自組裝過程重新開始，AIEE過程恢復(fù)[81]。在檢測(cè)過程中，SiNPs可作為內(nèi)標(biāo)物，其發(fā)射保持恒定；GSH-AuNCs為信號(hào)峰，對(duì)魚精蛋白和胰蛋白酶濃度做出響應(yīng)。通過兩個(gè)熒光峰的強(qiáng)度比，實(shí)現(xiàn)對(duì)魚精蛋白和胰蛋白酶的靈敏檢測(cè)。這種基于金簇聚集誘導(dǎo)發(fā)射增強(qiáng)效應(yīng)的新型納米雜化探針對(duì)魚精蛋白的檢測(cè)線性范圍為0.15-3.00 μg/mL，檢出限為0.07 μg/mL，對(duì)胰蛋白酶的檢測(cè)線性范圍為10-100 ng/mL，檢出限為4.50 ng/mL。表現(xiàn)出了良好的靈敏度和選擇性的同時(shí)可進(jìn)一步應(yīng)用于血清樣品中魚精蛋白和胰蛋白酶濃度的測(cè)定。

圖4 基于納米雜化探針的魚精蛋白和胰蛋白酶比率檢測(cè)機(jī)理的原理圖[81]

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是指在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)(供體 Donor)的發(fā)射光譜與另一個(gè)基團(tuán)(受體 Acceptor)的吸收光譜有一定的重疊，那么當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般小于100 ?)，就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[118]。Su等通過金納米簇和金納米粒子(AuNPs)構(gòu)建了基于拆分適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)平臺(tái)，以用于測(cè)定腺苷脫氨酶活性(adenosine deaminase，ADA)[82]。 他們先分別制備了11-巰基十一烷酸(11-mercaptoundecanoic acid，11-MUA)官能化的AuNCs和檸檬酸鈉還原HAuCl4得到的AuNPs，并將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的核酸適配體分裂為P1和P2兩個(gè)片段。由于11-MUA@AuNCs表面存在大量羧基，因此可以和P1堿基末端的氨基通過縮合反應(yīng)相結(jié)合，而P2可以通過Au-S鍵與AuNPs相結(jié)合，從而分別生成P1-AuNCs和P2-AuNPs。最終，在ATP的存在下，P1和P2可以與ATP結(jié)合，使得作為能量供體的P1-AuNCs和作為能量受體的P2-AuNPs相接近，以此發(fā)生FRET效應(yīng)淬滅P1-AuNCs熒光。當(dāng)加入腺苷脫氨酶后，ATP會(huì)被轉(zhuǎn)化為對(duì)適體不具有親和力的三磷酸肌苷(inosine triphosphate，ITP)，P1和P2鏈以此被釋放，P1-AuNCs和P2-AuNPs相遠(yuǎn)離并導(dǎo)致其系統(tǒng)的熒光恢復(fù)[82]。該平臺(tái)的熒光強(qiáng)度與ADA濃度在2-120 U/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其檢出限低至0.72 U/L。這種ATP特異性結(jié)合其分裂適配體，連接P1-AuNCs和P2-AuNPs同時(shí)觸發(fā)有效的FRET過程，與ADA高效的催化性能共同保證對(duì)ADA檢測(cè)的靈敏度和選擇性。

2.2 檢測(cè)其他生物大分子

除了酶以外，生物體細(xì)胞內(nèi)還存在核酸、多糖、蛋白質(zhì)等大分子。每個(gè)生物大分子內(nèi)有幾千到幾十萬個(gè)原子，分子量從幾萬到幾百萬以上。其中，核酸作為生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的組成物質(zhì)。不光局限于核酸的檢測(cè)，以DNA或寡核苷酸為模板所合成的金屬納米團(tuán)簇作為一種新型的發(fā)光納米材料，由于其合成簡(jiǎn)單、性能和生物相容性好，近年來受到廣泛的關(guān)注。例如以富含胞嘧啶的DNA為模板合成的銀簇(AgNCs)和以隨機(jī)DNA雙鏈為模板所制備的銅納米粒子(CuNPs)等，都憑借著自身的優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。但是它們也分別存在著合成時(shí)間長(zhǎng)和膠體分散不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。Tseng等曾以30個(gè)腺苷核苷酸為模板序列，開發(fā)出了一種在紫外光輔助的條件下合成DNA-AuNCs的方法[120]。然而該合成工藝需要305 nm紫外光輻射24 h，其合成過程較為漫長(zhǎng)和繁瑣。鑒于此，Liu和他的同事以富含腺嘌呤的DNA為模板，通過加熱輔助還原法在較短的孵育時(shí)間(30 min)內(nèi)成功合成了DNA金簇(DNA-AuNCs)。并通過DNA-AuNCs和MnO2納米片成功的構(gòu)建了可識(shí)別生物分子的新型熒光生物傳感平臺(tái)，以用于檢測(cè)靶DNA和凝血酶[92]。如圖5所示，DNA-AuNCs的單鏈DNA模板鏈設(shè)計(jì)為兩個(gè)部分：前半部分為富含腺嘌呤的DNA序列(A15)，以用于形成AuNCs；后半部分則為識(shí)別序列。在DNA-AuNCs與MnO2納米片共存時(shí)，DNA-AuNCs可通過自身DNA單鏈的堿基與MnO2片基面之間的物理吸附作用而吸附在MnO2納米片表面。使得自身熒光被MnO2納米片所淬滅。當(dāng)加入靶DNA序列后，DNA-AuNCs中的識(shí)別序列可與靶DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交，形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。核酸堿基因此被埋在帶負(fù)電的螺旋狀磷酸骨架之間，使得DNA-AuNCs與MnO2之間的物理吸附作用受到干擾，最終導(dǎo)致MnO2片上的DNA-AuNCs的釋放和熒光強(qiáng)度的恢復(fù)。同理，將靶DNA識(shí)別序列更換為凝血酶適配體堿基序列后，在凝血酶存在的條件下，適配體堿基序列可與凝血酶形成適配體-凝血酶復(fù)合物結(jié)構(gòu)并從MnO2片上解吸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的靈敏檢測(cè)。

圖5 基于DNA-AuNCs和MnO2片的無標(biāo)記通用熒光生物傳感平臺(tái)示意圖[92]

多糖(polysaccharide)是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。它們廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。肝素(heparin)作為多糖的一種，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、炎癥、免疫防御、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝等各種生物過程中起著至關(guān)重要的作用，且在臨床中常被用作抗凝血藥物。然而，肝素的高劑量和長(zhǎng)時(shí)間使用往往會(huì)導(dǎo)致高鉀血癥、出血、骨質(zhì)疏松和血小板減少等不良反應(yīng)。因此，Wu等開發(fā)了一種簡(jiǎn)單有效的肝素?zé)晒夥治龇椒?，即通過十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)和肝素對(duì)谷胱甘肽保護(hù)的金納米簇競(jìng)爭(zhēng)組裝和拆卸調(diào)控來實(shí)現(xiàn)[94]。CTAB作為一種陽離子表面活性劑，可以很容易的通過靜電相互作用和疏水相互作用與金屬氧化物、二氧化硅和量子點(diǎn)等帶負(fù)電荷的納米粒子結(jié)合。因此CTAB可以與GSH-AuNCs自組裝形成納米復(fù)合材料，同時(shí)增強(qiáng)金簇?zé)晒狻Ｈ欢?，由于肝素具有更多的?fù)電荷(ζ=24.3 mV)和三硫二糖重復(fù)單元所組成的更長(zhǎng)的烴鏈，因此CTAB與肝素的結(jié)合能力比與GSH-AuNCs更強(qiáng)。最終可導(dǎo)致CTAB離開金簇表面，形成一個(gè)由CTAB和肝素組成的更為牢固的整體。而這種拆卸過程會(huì)使得先前被增強(qiáng)的熒光逐漸恢復(fù)，即在不外加熒光劑或淬滅劑的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝素的靈敏檢測(cè)。該方法對(duì)肝素的線性反應(yīng)范圍為0.1-1.6 mg/mL，最低檢出限為0.075 mg/mL。選擇性和靈敏度較好的同時(shí)避免了復(fù)雜的合成過程和危險(xiǎn)試劑的使用。有望成為臨床樣本中肝素檢測(cè)的有力工具。

蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞、組織的重要成分。機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與。因此對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)也尤為重要。Chen等通過雞蛋清蛋白為原料合成了具有明亮光致發(fā)光的雞蛋清蛋白包覆的金納米簇(chicken egg white protein-encapsulated gold nanoclusters，AuNCs@ew)以用于檢測(cè)蓖麻蛋白(ricin)[95]。蓖麻毒素是由全毒素、毒類素、凝集素三種物質(zhì)組成的蛋白質(zhì)。對(duì)所有哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞都有毒害作用，且對(duì)某些惡性腫瘤細(xì)胞的毒性效果表現(xiàn)的更強(qiáng)。這使它在醫(yī)學(xué)上成為用于殺傷腫瘤細(xì)胞的首選毒素之一。該納米團(tuán)簇可以與蓖麻毒素相結(jié)合，生成共軛物。并且紫外燈下，可以觀察到明亮的沉淀物。以熒光光譜為檢測(cè)工具，其檢出限可低至400 nM。Chen等還對(duì)結(jié)合機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的探討，認(rèn)為其相互作用可能來源于AuNCs@ew上雞蛋清蛋白所含的Galβ(1→4)GlcNAc末端多糖分子與蓖麻毒素B的分子識(shí)別作用。因此，他們利用PNGase F酶來處理AuNCs@ew，在去除AuNCs@ew中的多聚糖同時(shí)仍然保持其熒光性。而處理后的金簇并沒有對(duì)蓖麻毒素B表現(xiàn)出親和性。最終證明了蓖麻毒素B與AuNCs@ew的結(jié)合作用主要來源于AuNCs@ew中雞蛋清蛋白配體所含的半乳糖基結(jié)構(gòu)。推翻了先前Olsnes等所提出的靜電相互作用主導(dǎo)蓖麻毒素B和AuNC@ew的結(jié)合機(jī)理[119]。該方法為快速確認(rèn)可疑樣品中是否存在蓖麻毒素提供了可行。同時(shí)也表明了天然可用的糖蛋白是開發(fā)功能性納米探針的優(yōu)秀候選者。

黑色素是一種天然的多功能色素，普遍存在于所有生物物種中，調(diào)節(jié)著與表皮穩(wěn)態(tài)、色素沉著和黑色素瘤相關(guān)的多個(gè)生物學(xué)過程[98,99]。因此，探索對(duì)黑色素敏感、有選擇性并且能直接的檢測(cè)方法，對(duì)于深入了解、診斷和正確處理色素不足和色素過多的疾病至關(guān)重要。當(dāng)前用于黑色素估計(jì)的方法復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)，因此需要替代技術(shù)。Moon-Moo Kim等，首次報(bào)道了的直接檢測(cè)黑色素的方法，在該方法中使用到的GSH-AuNCs更能夠與黑色素相互作用從而引起熒光淬滅而實(shí)現(xiàn)黑色素快速檢測(cè)[99]。通常，黑色素具有光活性，因此，它可能通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象。其中黑色素充當(dāng)能量供體，AuNCs充當(dāng)受體，這將有效淬滅AuNCs的熒光。制備的谷胱甘肽AuNCs在350 nm激發(fā)時(shí)在600 nm處顯示發(fā)射峰。AuNC發(fā)出的熒光可以被黑色素以濃度依賴的方式淬滅。因此，熒光強(qiáng)度隨著黑色素濃度的變化而逐漸變化，這可以通過肉眼在紫外線燈下容易地觀察到，從而進(jìn)行視覺檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，所建立的淬滅法對(duì)黑色素具有較高的選擇性和敏感性，檢測(cè)限為0.060 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.993。整個(gè)過程在30 min內(nèi)完成，因此克服了目前可用的黑色素檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)的問題。該方法避免了使用濃NaOH，并具備了對(duì)共存干擾物的高選擇性，因此可以幫助方便地檢測(cè)實(shí)際樣品中的黑色素。而且，為了驗(yàn)證該方法對(duì)真實(shí)樣本的性能，該團(tuán)隊(duì)對(duì)B16F1細(xì)胞裂解和頭發(fā)樣本進(jìn)行了測(cè)試，得到了滿意的結(jié)果。因此，開發(fā)的測(cè)定法對(duì)黑色素檢測(cè)測(cè)定簡(jiǎn)單，響應(yīng)快速，靈敏度高，使其在頭發(fā)樣品或其他含有黑色素的生物樣品中檢測(cè)黑色素有很大的實(shí)用價(jià)值，并且與多種疾病有關(guān)的黑色素的分析至關(guān)重要。

2.3 檢測(cè)生物小分子

典型的細(xì)胞含有一萬到十萬種生物分子，而其中近半數(shù)都是小分子，其分子量一般在500以下，這些小分子包括一些無機(jī)/有機(jī)小分子、氨基酸、核苷酸、單糖、脂類和維生素等。他們通過有序的組合構(gòu)成了生物大分子?？箟难?ascorbic acid，AA)作為維生素的一種，在多種代謝途徑中起到輔酶的作用。同時(shí)抗壞血酸的缺乏也被證實(shí)與抑郁癥、壞血病、癌癥和帕金森綜合癥等疾病的發(fā)病有關(guān)。因此目前已有多篇基于金簇檢測(cè)抗壞血酸的文獻(xiàn)被報(bào)道[100-104]。Qu等通過從MnO2納米片中控制釋放聚烯丙胺穩(wěn)定的金納米簇開發(fā)出了一種檢測(cè)抗壞血酸的熒光“打開”分析法[100]。他們首先合成了GSH-AuNCs，并以GSH-AuNCs和聚烯丙胺為原料制得了聚烯丙胺-AuNCs(polyallylamine-AuNCs)。最后向聚烯丙胺-AuNCs中加入單層MnO2納米片以制備聚烯丙胺-AuNCs-MnO2納米復(fù)合材料。由于聚烯丙胺攜帶正電荷，因此聚烯丙胺-AuNCs通過靜電相互作用吸附在MnO2納米片表面，金簇?zé)晒庖灿捎贔RET過程而被納米片所淬滅。當(dāng)加入AA后，AA可以將MnO2納米片還原成Mn2+，導(dǎo)致MnO2納米片的分解，使得聚烯丙胺-AuNCs熒光恢復(fù)。從而可通過其熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)AA濃度的檢測(cè)。與AuNCs相比，聚烯丙胺-AuNCs的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，對(duì)提高檢測(cè)靈敏度和擴(kuò)大檢測(cè)范圍具有著重要意義。該納米傳感器對(duì)AA的檢測(cè)范圍為0.01-200 μM，其檢出限為3.2 nM。靈敏度高的同時(shí)具有良好的選擇性和生物相容性。且其方法快速、經(jīng)濟(jì)、易于操作，有望推廣到與抗壞血酸相關(guān)的生物和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用之中。

同樣是基于MnO2納米片被還原為Mn2+檢測(cè)目標(biāo)物，Liu等以牛血清白蛋白為模板，在不使用任何強(qiáng)氧化劑和有毒有機(jī)溶劑的生理?xiàng)l件下通過一鍋法引導(dǎo)AuNCs-MnO2形成和組裝。通過這種一鍋型生物礦化過程(one-pot biomimetic mineralization process)所制備的金納米簇-錨定(2D)MnO2納米片可作為一種新型熒光/磁性雙峰傳感器，以用于檢測(cè)H2O2[105]。在他們先前的工作中，發(fā)現(xiàn)可通過簡(jiǎn)單的混合金屬離子和蛋白質(zhì)來控制和合成具有良好生物相容性的金屬硫化物納米顆粒[121]。同時(shí)，Liu等還報(bào)道了在堿性條件下，通過BSA孵育Mn2+可以制備MnO2納米粒子[122,123]。因此，Liu等將兩者結(jié)合，首次提出了基于BSA的仿生礦化以獲得2D MnO2納米片[105]。在合成過程中，Mn2+和[AuCl4]-通過強(qiáng)渦作用與BSA水溶液混合，BSA可通過羧基和硫醇基團(tuán)捕獲Mn2+和[AuCl4]-，從而形成BSA-Mn和BSA-Au配合物。隨后，在NaOH的作用下，BSA固載的Mn離子可經(jīng)水解反應(yīng)初步轉(zhuǎn)化為Mn(OH)2，并在溶解氧的幫助下氧化生成MnO2。NaOH引發(fā)了2D MnO2生長(zhǎng)的同時(shí)，還參與了AuNCs的成核。最后，在BSA的幫助下，BSA-AuNCs與2D MnO2組裝生成了AuNCs-MnO2。在沒有H2O2存在時(shí)，2D MnO2納米片上的AuNCs基于FRET效應(yīng)，其熒光被納米片所淬滅；而當(dāng)加入H2O2后，MnO2納米片會(huì)被分解成為Mn2+，從而釋放出AuNCs，快速的恢復(fù)其熒光。同時(shí)由于Mn2+的不斷生成，還會(huì)產(chǎn)生磁共振(MR)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2濃度的熒光和磁共振的雙信號(hào)檢測(cè)。其熒光模式對(duì)H2O2的線性檢測(cè)范圍為0.06-2 μM，而MR模式也允許在0.01-0.2 mM的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)H2O2。并且由于BSA分子在產(chǎn)物表面的殘留，所制備的AuNCs-MnO2具有較低的細(xì)胞毒性和良好的生物相容性。這種金簇?zé)晒馀cMn2+磁共振信號(hào)相結(jié)合的生物傳感器為H2O2的細(xì)胞內(nèi)外監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)高效的雙模傳感平臺(tái)。

不僅僅局限于MnO2納米片，2D 納米片獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，以及良好的電子、光子和生物相容性使它們得到了廣泛的關(guān)注。例如，類石墨氮化碳(g-C3N4)具有類石墨結(jié)構(gòu)，是一種在C-N層之間具有弱范德華力的無金屬聚合物半導(dǎo)體。由于其出色的性質(zhì)被普遍應(yīng)用于光合作用、電催化光降解環(huán)境有機(jī)污染物以及生物成像與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[124]。有研究表明，在g-C3N4納米片的表面接枝金屬或者半導(dǎo)體納米粒子可以改善其光學(xué)性質(zhì)，提高熒光強(qiáng)度[125]。因此，Kokot等合成了一種由石墨樣氮化碳納米片(g-C3N4NSs)和牛血清白蛋白包覆的金納米簇(BSA-AuNCs)組成的強(qiáng)紅色熒光納米復(fù)合材料(g-C3N4NSs-AuNCs)，以用于檢測(cè)多巴胺(DA)[111]。所合成的納米復(fù)合材料較單一的g-C3N4NSs相比，其發(fā)射峰產(chǎn)生了輕微藍(lán)移。并在紫外燈下發(fā)射出橘紅色熒光，而非之前的藍(lán)色熒光。當(dāng)加入DA后，DA會(huì)被環(huán)境氧氧化生成多巴胺醌(DA quinone)，并通過強(qiáng)共價(jià)相互作用(包括靜電相互作用和氫鍵生成)吸附于g-C3N4NSs-AuNCs表面。由于多巴胺醌在400-500 nm范圍內(nèi)存在吸收峰，與g-C3N4NSs-AuNCs的發(fā)射光譜發(fā)生了重疊。因而隨著兩者距離的縮短產(chǎn)生了供體(g-C3N4NSs-AuNCs)向受體(DA quinone)的FRET效應(yīng)，從而使得g-C3N4NSs-AuNCs熒光不斷被淬滅，最終得到其熒光信號(hào)與DA濃度之間的線性關(guān)系。而與多巴胺類似，血清素(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在生物學(xué)過程中也扮演著重要角色。Liu等利用轉(zhuǎn)鐵蛋白包覆的金納米團(tuán)簇(Tf-AuNCs)制備了5-HT熒光“打開”生物傳感器[122]。據(jù)報(bào)道，5-HT與唾液酸(sialic acid，SA)具有很高的親和力[126]。且由于轉(zhuǎn)鐵蛋白含有四末端SA殘基的二元復(fù)合型聚糖，使得其對(duì)5-HT具有良好的識(shí)別能力[127]。因此，通過微波合成法所制得Tf-AuNCs會(huì)在5-HT的存在下與之結(jié)合并聚集，通過聚集誘導(dǎo)發(fā)射效應(yīng)(AIE)增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，并最終定量的檢測(cè)出5-HT濃度。

D青霉胺(D-penicillamine，D-pen)是一種從青霉素中分離出來的氨基酸，對(duì)威爾遜病、原發(fā)性膽汁性肝硬化和進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化均有一定的治療效果[128]。并且由于D-pen是目前應(yīng)用最為廣泛的重金屬解毒治療藥物，其自身易于與重金屬離子發(fā)生螫合反應(yīng)。因此對(duì)D-pen的檢測(cè)也相對(duì)較為方便、簡(jiǎn)單。Li等在水溶液中成功的合成了具有紅色熒光發(fā)射的木瓜蛋白酶(papain)穩(wěn)定的金納米團(tuán)簇(papain@AuNCs)，并在Cu2+的參與下實(shí)現(xiàn)了對(duì)D-pen的間接檢測(cè)[113]。由于木瓜蛋白酶是一種從木瓜乳膠中分離而來的可溶性半胱氨酸蛋白酶，存在有一條含有212個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，包括半胱氨酸、天冬酰胺和組氨酸殘基[129]。因此該蛋白酶可以作為一種良好的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑以用于金簇的合成。而Cu2+可以與木瓜蛋白酶的氨基酸殘基配位結(jié)合，并且降低蛋白質(zhì)金簇表面電子密度，從而淬滅其熒光[70]。當(dāng)加入D-pen后，D-pen能從papain@AuNCs表面捕獲Cu2+，形成更加穩(wěn)定的Cu2+-D-pen螫合物，從而恢復(fù)金簇?zé)晒?。這種快速、選擇性檢測(cè)D-pen的熒光“開啟”法其檢測(cè)范圍為30.0 μM-2.0 mM，檢出限為5.0 μM。并且在體內(nèi)外大鼠血清樣品中D-pen的代謝過程分析中獲得了良好的回收率。在建立新的熒光“開啟”檢測(cè)和實(shí)際生物樣品中的藥物高選擇性檢測(cè)中顯示出極大的應(yīng)用潛力。

組氨酸(L-Histidine，His)是一種天然氨基酸，通常存在于酶的催化位點(diǎn)。他在生物系統(tǒng)中起著非常重要的作用[130，131]。由于His含有一個(gè)芳香氮雜環(huán)咪唑側(cè)鏈，因此可以與某些過渡金屬離子(Cu2+)強(qiáng)結(jié)合，控制金屬的輸運(yùn)[132]。然而，由于其含量低，且與其他氨基酸和物種具有相似的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，使其在生物樣品中進(jìn)行靈敏、選擇性的檢測(cè)具有一定的挑戰(zhàn)性。Liu等，以牛血清白蛋白(BSA)為模板，簡(jiǎn)便地合成了金/銅雙金屬納米簇(Au/Cu NCs)[133]。合成的Au/Cu NCs在水溶液中顯示出可忽略的熒光， His也不能顯示任何熒光。令人驚訝的是，隨著His的出現(xiàn)，出現(xiàn)了非常強(qiáng)烈的紅色熒光，被認(rèn)為是His觸發(fā)的紅色熒光啟動(dòng)。我們推測(cè)是His誘導(dǎo)的Au/CuNCs的熒光打開可能是由于Cu和His的配位引起的配位發(fā)射，從而限制了配體的旋轉(zhuǎn)。金屬有機(jī)骨架(MOFs)以四吡嗪(4-羧基苯基)配位Ln3+離子，也有類似的聚合誘導(dǎo)發(fā)射的報(bào)道。因此，一種新型的His傳感器可能會(huì)基于這種紅色熒光變亮的有趣現(xiàn)象被開發(fā)出來。通過實(shí)驗(yàn)探究證實(shí)Au/Cu NCs能夠在3.0-10000 nM的寬動(dòng)態(tài)范圍和0.9 nM的LOD范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)His的快速檢測(cè)，這優(yōu)于其他經(jīng)典方法或迄今為止報(bào)道的最新熒光傳感方法。同時(shí)，該方法也適用于真實(shí)樣本的檢測(cè)。因此，提出的His觸發(fā)熒光性光敏開關(guān)應(yīng)該為在活細(xì)胞中探測(cè)His或His的各種熒光傳感器提供指導(dǎo)。

3 檢測(cè)小分子有機(jī)物

除了生物分子外，金納米簇還可用于檢測(cè)小分子有機(jī)物。這些小分子有機(jī)物通常不會(huì)在生物體內(nèi)合成和出現(xiàn)，但可能會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。因此在本節(jié)中，我們將列舉幾種常見的對(duì)人體有害的小分子有機(jī)物，并介紹其金簇對(duì)它們的檢測(cè)機(jī)理[134-143]。所列舉的檢測(cè)物質(zhì)如表3所示。

表3 金納米簇對(duì)小分子有機(jī)物的檢測(cè)

3.1 檢測(cè)有機(jī)磷

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPs)因其對(duì)農(nóng)作物的高效保護(hù)作用，在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。然而，有機(jī)磷的廣泛使用和不當(dāng)處理，可能會(huì)對(duì)食品、環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重污染。有機(jī)磷可以與體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(Acetyl cholinesterase，AchE)結(jié)合形成磷?；阴Ｄ憠A酯酶，使酶失去活性，從而使得神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿大量積蓄，造成神經(jīng)功能嚴(yán)重?fù)p傷，甚至死亡。并且由于部分有機(jī)磷可以經(jīng)皮膚吸收或者吸入中毒，在低劑量的條件下都會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的，甚至是不可逆的后果。因此對(duì)有機(jī)磷的靈敏檢測(cè)一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，有機(jī)磷化合物通常分為兩類：具有P=O鍵的有機(jī)磷酯和具有P=S鍵的有機(jī)代磷酸酯[144]。Su等設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)便、快速的熒光檢測(cè)平臺(tái)，基于金簇-酪氨酸酶熒光探針體系來檢測(cè)有機(jī)磷(對(duì)氧磷)[134]。他們通過雞蛋清蛋白作為穩(wěn)定劑和模板，合成了在630 nm具有最大發(fā)射波長(zhǎng)的雞蛋清蛋白金簇。并同時(shí)向金簇中加入酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)和多巴胺以構(gòu)成檢測(cè)體系。TRY可以催化多巴胺，將其氧化為Dopaminechrome。而Dopaminechrome能夠有效的接受AuNCs中的電子，將電子從最高占據(jù)分子軌道(highest occupied molecule orbital，HOMO)傳遞到最低占據(jù)分子軌道(lowest unoccupied molecule orbital，LUMO)，從而造成動(dòng)態(tài)熒光淬滅[145-147]。當(dāng)有對(duì)氧磷存在時(shí)，對(duì)氧磷可以有效抑制酪氨酸酶活性，阻斷其酶促過程，導(dǎo)致AuNCs熒光恢復(fù)。該傳感平臺(tái)將TYR的氧化能力與OPs引起的活性抑制相結(jié)合，所開發(fā)出的基于AuNCs的傳感系統(tǒng)對(duì)對(duì)氧磷的檢出限可降至0.1 ng/mL。并且其金簇可以滴加在濾紙上，以作為快速視覺檢測(cè)有機(jī)磷的測(cè)試紙來使用。在改進(jìn)了視覺傳感探針的設(shè)計(jì)的同時(shí)拓展并促進(jìn)了金簇的實(shí)際應(yīng)用[134]。

正如上文提到的，一些非硫醇試劑，例如聚合物、樹枝狀大分子和DNA等都可以用于制備發(fā)光AuNCs。這些非硫醇試劑可通過Au-N鍵或Au-O鍵的弱配位作用作為模板劑，在形成金簇的同時(shí)會(huì)使金簇處于不穩(wěn)定狀態(tài)[136]。因此，Liu等基于這一特點(diǎn)，提出了一種新的化學(xué)傳感器的構(gòu)建策略，即用非硫代的DNA包覆的AuNCs作為光學(xué)探針來檢測(cè)毒死蜱(chlorpyrifos，CP)[136]。如圖6所示，在堿性條件下，CP可以水解生成DEP和TCP，而DEP中含有P-O鍵和P-S鍵。因此，通過Au-S和Au-O的協(xié)同配位作用，DNA-AuNCs中的非硫醇的DNA配體會(huì)被DEP所取代。同時(shí)，Au(Ⅰ)會(huì)被S原子還原為Au(0)。從而最終導(dǎo)致DNA-AuNCs的聚集和微小AuNCs到等離子體AuNPs的轉(zhuǎn)變，并伴隨著明顯的溶液顏色變化。基于這種聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)，該策略對(duì)CP表現(xiàn)出了良好的敏感性響應(yīng)，檢測(cè)限為0.50 μM。同時(shí)，常見的金屬離子和糖類不會(huì)影響DNA-AuNCs的發(fā)光強(qiáng)度，并且[(RO3P)=O]結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷酸酯由于不存在游離的硫醇片段也不會(huì)對(duì)DNA-AuNCs產(chǎn)生響應(yīng)。含有P=S鍵的有機(jī)磷對(duì)該DNA-AuNCs的淬滅效率可達(dá)80 %以上，表現(xiàn)出了優(yōu)異的選擇性。

圖6 (A)CP在堿性溶液中的水解過程.(B)DNA-AuNCs檢測(cè)CP原理示意圖[136]

炸藥的精確分析對(duì)于評(píng)估環(huán)境污染和預(yù)防恐怖主義至關(guān)重要。然而，以高選擇性和靈敏度對(duì)爆炸物進(jìn)行快速分析仍然很困難。Liu等，報(bào)道了MOF復(fù)合AuNCs爆炸物檢測(cè)的熒光探針[139]。金納米團(tuán)簇修飾的金屬有機(jī)骨架是用于爆炸物檢測(cè)的出色光學(xué)探針，結(jié)合AuNCs的ZIF-8是一步合成的。由于鋅離子介導(dǎo)的ZIF-8聚集作用，與原始AuNCs相比，封裝的AuNCs顯示出更強(qiáng)的發(fā)射。使用三指數(shù)衰減函數(shù)擬合熒光衰減，得到AuNCs，AuNCs/ZIF-8和混合有TNT的AuNCs/ZIF-8的壽命分別為2.1、6.2和5.7 μs。在摻入ZIF-8后AuNCs的壽命變長(zhǎng)，這與鋅離子介導(dǎo)的AuNCs的聚集有關(guān)[139]。TNT的引入導(dǎo)致納米探針的壽命相對(duì)較短。這些結(jié)果表明該反應(yīng)涉及動(dòng)態(tài)淬火過程。另外，TNT的吸收光譜與AuNCs/ZIF-8的發(fā)射光譜不重疊，表明該系統(tǒng)中沒有熒光共振能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)以上分析，認(rèn)為從激發(fā)的AuNCs/ZIF-8到缺乏電子的TNT的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移是熒光淬滅的主要原因，并且與其他炸藥相比對(duì)2,4,6-三硝基甲苯具有選擇性響應(yīng)，檢測(cè)限為5 nM，在1 min內(nèi)即可快速響應(yīng)。有效的測(cè)定是由框架介導(dǎo)的簇聚集和TNT結(jié)合產(chǎn)生的。功能性MOF已成功應(yīng)用于通過電子轉(zhuǎn)移快速檢測(cè)TNT[139]。由于框架介導(dǎo)的AuNCs聚集和TNT結(jié)合，設(shè)計(jì)的納米探針對(duì)TNT的反應(yīng)在1 min內(nèi)具有出色的選擇性和敏感性。該方法表明了放大光學(xué)測(cè)定的潛力?？偠灾?，使用AuNCs功能化的MOF實(shí)現(xiàn)了炸藥的高效熒光感測(cè),可以高靈敏度和快速響應(yīng)性地選擇性檢測(cè)其他硝基炸藥中的TNT。

3.2 檢測(cè)三聚氰胺

三聚氰胺是一種富氮(按重量計(jì)占66.7%)的工業(yè)化合物，廣泛用于阻燃劑、殺蟲劑、塑料和化肥的制造中。然而，三聚氰胺曾被發(fā)現(xiàn)非法添加在乳制品中，以增加氮含量。雖然三聚氰胺本身低毒，但是高濃度的三聚氰胺易形成水溶性差的高分子量配合物，并在腎小管中沉淀。最終導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)損傷和腎結(jié)石，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)致人死亡[140,141]。Joseph等報(bào)道了一種新型的比率型納米傳感器，即利用谷胱甘肽穩(wěn)定的金簇(GSH-AuNCs)高選擇性和靈敏地檢測(cè)三聚氰胺[142]。通過實(shí)驗(yàn)表明，三聚氰胺可以使得GSH-AuNCs聚集，使其平均粒徑增大。這種聚集可能是由于三聚氰胺和AuNCs表面的谷胱甘肽之間形成氫鍵所導(dǎo)致的。隨著三聚氰胺濃度的增加，金簇的不斷聚集，會(huì)使得AuNCs在600 nm處的熒光發(fā)生淬滅。但同時(shí)，三聚氰胺又是一種富氮分子，具有很強(qiáng)的給電子能力，因此會(huì)增強(qiáng)AuNCs在430 nm處的熒光。從而可通過兩個(gè)波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的比值與三聚氰胺的濃度繪制得出線性關(guān)系。其檢出限可達(dá)到28.2 μM。同時(shí)，該納米傳感器不受其他生物分子所干擾，例如牛奶中常見蛋白質(zhì)(丙氨酸、甘氨酸、胱氨酸等)和碳水化合物(葡萄糖)等，可成功應(yīng)用于奶制品中三聚氰胺含量的測(cè)定。

圖7 CNDs/GSH@Au NCs作為比率度量熒光探針檢測(cè)三聚氰胺示意圖[143]

為了進(jìn)一步提高對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)靈敏度，You等利用碳納米點(diǎn)和谷胱甘肽穩(wěn)定的金納米簇(CNDS/GSH@AuNCS)的自組裝技術(shù)，開發(fā)了一種新型比率型熒光探針來檢測(cè)三聚氰胺[143]。如圖7所示，他們首先合成了可發(fā)射紅光的GSH-AuNCs和可發(fā)射藍(lán)光的抗壞血酸碳點(diǎn)，并通過超聲將其均勻混合以制備CNDs/GSH@AuNCs。之后再向其加入Hg2+以構(gòu)成傳感平臺(tái)。當(dāng)加入Hg2+后，由于d10-d10效應(yīng)，汞離子可淬滅金簇?zé)晒?，但是不?huì)影響CNDs的熒光發(fā)射。而當(dāng)有三聚氰胺存在時(shí)，由于其特殊的多氮結(jié)構(gòu)，三聚氰胺對(duì)Hg2+具有更高的配位親和性，從而形成三聚氰胺-汞配合物，使得金簇?zé)晒饣謴?fù)。最終以碳點(diǎn)的熒光峰作為參比峰，金簇的熒光峰作為信號(hào)峰，通過熒光強(qiáng)度比率的方式靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)出三聚氰胺濃度。該CNDs/GSH@AuNCs-Hg2+傳感系統(tǒng)在0.1-30 μM范圍內(nèi)具有較好的靈敏度響應(yīng)，且檢出限可低至29.3 nM。同時(shí)在實(shí)際加標(biāo)樣品(牛奶，貓糧)檢測(cè)三聚氰胺實(shí)驗(yàn)中獲得了令人滿意的回收率數(shù)據(jù)，證明了其可靠性和準(zhǔn)確性。有望成為檢測(cè)食品中三聚氰胺的潛在候選物[143]。

4 總結(jié)與展望

金納米簇作為一種新型的熒光納米材料，擁有良好的熒光性質(zhì)和生物相容性。并且相較于其他金屬納米材料，金簇具有易制備、易修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)異的特點(diǎn)。通過不同的配體合成和功能化修飾金簇，可以提高金簇對(duì)待測(cè)物質(zhì)的靶向識(shí)別能力。同時(shí)也可以導(dǎo)致材料本身的熒光性質(zhì)發(fā)生變化。這些優(yōu)良的特性，使得金納米簇在化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了更多的應(yīng)用潛能。盡管金納米簇在化學(xué)生物檢測(cè)領(lǐng)域已取得一定的成果,但進(jìn)一步的發(fā)展還面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。制備純度和量子產(chǎn)率偏低一直是金簇合成的首要問題。其次,金納米簇在細(xì)胞或活體等復(fù)雜生物環(huán)境中的抗干擾檢測(cè)能力還有待提高。但隨著金簇的理論基礎(chǔ)和合成技術(shù)的不斷突破，有望為化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的契機(jī),為生物體內(nèi)傳感、成像以及治療開拓新的途徑?？梢韵嘈?，在不久的將來，以熒光金納米簇為基礎(chǔ)構(gòu)建的生物標(biāo)記、生物傳感、生物成像以及靶向的腫瘤治療平臺(tái)將展示出更為廣闊的前景。