PPP1R3C基因在3T3-L1前脂肪細胞分化過程中的功能研究

崔 瀟，李成萍，張海燕，劉雪燕，周國利

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252059)

0 引言

糖原和脂質(zhì)是能量的主要儲存形式，受到激素和代謝信號的嚴格調(diào)控。糖原是能量儲存和利用的首選，它的代謝嚴格地被激素和營養(yǎng)狀況調(diào)控，從而進一步通過多種途徑調(diào)控糖原磷酸化酶(glycogene phosphorylase，GP)和糖原合成酶(glycogen synthase，GS)的活性[1]。蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基(protein phosphatase 1 regulatory subunit)，也稱糖原靶向調(diào)控亞基(G亞基)，通過將蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)的催化亞基靶向糖原顆粒來協(xié)調(diào)糖原合成[2,3]。它們調(diào)節(jié)糖原代謝酶的活動，通過PP1介導的去磷酸化，主要是對糖原合成酶磷酸酶(glycogen synthase phosphatase，GSP)去磷酸化和激活GS，進而刺激糖原生成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，已知有7個基因編碼G亞基(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3a-3g，PPP1R3A-PPP1R3G)[2]。

蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C，PPP1R3C)，也稱為糖原靶向蛋白(protein targeting to glycogen，PTG)，在許多組織中均有表達，小鼠的PPP1R3C雜合缺失可導致許多組織糖原水平降低，并伴有進行性葡萄糖耐受不良、高胰島素血癥和隨著年齡增長的胰島素抵抗[4]。在肝臟中，PTG和GS幾乎以同等的水平表達[5]，它們共同作用加速肝糖原的代謝和儲存。PTG過表達顯著增加糖原含量，因為PP1和GS重新分配到糖原中，同時GS活性和糖原合成顯著增加[6-10]。盡管PTG具有對糖原的代謝有很大的影響，但它是如何調(diào)控糖原代謝仍不清楚，一種可能的調(diào)節(jié)方式是在轉(zhuǎn)錄水平的。去甲腎上腺素和腺苷酸均可上調(diào)星形膠質(zhì)細胞和肝細胞中PTG基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時伴有糖原合成增加[11]。轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A2(forkhead box A2，F(xiàn)oxA2)在體外直接與PTG基因的啟動子區(qū)域結(jié)合并激活它的轉(zhuǎn)錄，而且PTG啟動子中的兩個SREBP/上游刺激因子結(jié)合元件也提示了SREBP潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[12]。

在小鼠的脂肪組織中，使用脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)啟動子超表達PPP1R3C，結(jié)果表明，脂肪組織中糖原水平比野生型小鼠高出200-400倍，顯示脂肪細胞具有容納高水平糖原的空間能力，糖原在脂肪沉積中的重要性被證實[13]。目前的數(shù)據(jù)顯示，在營養(yǎng)過剩期間，當糖原達到閾值水平時，能量儲存會從糖原轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)。這種能量存儲模式的轉(zhuǎn)變可能是由于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和其轉(zhuǎn)錄靶標SREBP1之間的正反饋回路造成的[14]。但是PPP1R3C在3T3-L1前脂肪細胞分化中的功能尚不清楚，并且，它是否與SREBP1在脂肪細胞分化中具有協(xié)調(diào)作用還需進一步的分析。因此，本研究以3T3-L1前脂肪細胞為實驗材料，通過對目的基因PPP1R3C的功能獲得與缺失實驗及相應的分子生物學技術(shù)，研究小鼠PPP1R3C基因在3T3-L1前脂肪細胞分化中的功能，并初步探討SREBP1與PPP1R3C基因在脂肪細分化中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株。小鼠3T3-L1 前脂肪細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 藥品與試劑。地塞米松、 3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)和胰島素購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RNAeasyTMPlus動物RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMcDNA第一鏈合成試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EcoRI和NotI限制酶、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自NEB(北京)有限公司；siRNA和陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；油紅O試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及誘導分化。3T3-L1前脂肪細胞接種在含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞匯合率達85%后，加胰蛋白酶消化，按1:3的比例傳代培養(yǎng)。接觸抑制2天(D0)后，向DMEM培養(yǎng)基中添加終濃度分別為10 μg/mL 胰島素、100 μM地塞米松和0.5 mM IBMX，誘導分化2天(D2)后，培養(yǎng)基中只添加終濃度為10 μg/mL胰島素繼續(xù)維持分化，培養(yǎng)2 d。然后改換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，隔天更換一次培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.2 油紅O染色。吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3次；在37 ℃下，細胞用油紅O染液著色1 h，期間注意觀察染色情況；雙蒸水(ddH2O)清洗殘留油紅O染液；染色完成后，通過倒置顯微鏡(ZEISS Axio Vert.A1)觀察并拍照記錄；記錄完成后，染色的細胞用ddH2O清洗，加入100-200 μL的異丙醇抽提，510 nm波長測定OD值，對油紅O染色進行定量分析。

1.2.3 引物設(shè)計。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的小鼠PPP1R3C、SREBP1以及成脂標志基因(PPARγ、C/EBPβ、C/EBPα、FABP4)和β-actin的mRNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列信息詳見表1。

表1 本研究中所用的引物序列

1.2.4 基因表達載體的構(gòu)建。利用RNAeasyTMPlus動物RNA抽提試劑盒從3T3-L1中提取總RNA，然后用BeyoRTTMcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，利用cDNA為模板，擴增PPP1R3C基因的CDS序列片段，然后將其克隆到帶有flag標簽的pCMV載體上的EcoRI和NotI之間，挑取陽性克隆進行測序驗證，所用的引物見表1。

1.2.5 實時定量PCR。利用RNAeasyTMPlus動物RNA抽提試劑盒從3T3-L1不同分化時間點的細胞中提取總RNA，再用BeyoRTTMcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。然后利用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在CFX96定量PCR儀(伯樂，美國)上進行實時定量PCR，采用2-ΔΔCt法分析各基因的相對表達量，β-actin作為內(nèi)參，所用的引物見表1。

1.2.6 siRNA合成、過表達載體及細胞轉(zhuǎn)染。SREBP1、PPP1R3C基因的干擾小RNA(siRNA)和它們的陰性對照(scramble)序列信息見表2。合成的siRNA 在3000 r/min離心1分鐘，再加入125 μL DEPC水配成濃度為20 μM 溶液備用。

表2 siRNAs 序列信息

將3T3-L1前脂肪細胞與過表達載體或siRNA混勻于500 μL無血清培養(yǎng)基中，用Gene Pulser Xcell 電穿孔儀(伯樂，美國)進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染條件為：方波、電壓 220 V、電容 960 μF。12孔板中每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒6 μg，siRNA終濃度為50 nM。

1.2.7 統(tǒng)計分析。通過GraphPad Prism 7軟件作圖并進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差(Mean ±SD)，顯著水平以p<0.05(*)和p<0.01(**)為標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達PPP1R3C基因促進3T3-L1前脂肪細胞分化

為分析PPP1R3C基因?qū)?T3-L1前脂肪細胞分化的影響，進行了PPP1R3C基因的過表達實驗。首先，轉(zhuǎn)染24 h后通過實時定量PCR檢測PPP1R3C的表達量，以測定其轉(zhuǎn)染效率，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組PPP1R3C的表達量顯著高于對照組，說明轉(zhuǎn)染效率良好(圖1(a))。檢測了脂肪細胞分化標志基因PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ的表達譜。結(jié)果顯示，與對照組(pCMV-Flag)相比，PPP1R3C基因過表達導致PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ成脂分化標志基因的表達升高，PPARγ基因表達量在3T3-L1前脂肪細胞誘導分化的第4 d、第6 d和第8 d差異顯著(p<0.05，圖1(b))；C/EBPα基因表達量在誘導分化的第2 d、第4 d和第8 d差異極顯著(p<0.01)，誘導分化第6 d差異顯著(p<0.05，圖1(c))；C/EBPβ基因表達量在誘導分化的第2 d和第4 d差異顯著(p<0.05)，第6 d和第8 d差異極顯著(p<0.01，圖1(d))。誘導分化8 d后，通過油紅O染色和定量分析表明，過表達PPP1R3C基因?qū)е轮魏匡@著增加(圖2)。

注：(a) 轉(zhuǎn)染24 h后PPP1R3C的過表達效率；(b) 誘導分化各時期PPARγ基因的表達量；(c) 誘導分化各時期C/EBPα基因的表達量；(d)誘導分化各時期C/EBPβ基因的表達量；β-actin為內(nèi)參，*表示p<0.05，**表示p<0.01,***表示p<0.001。

注：(a) 經(jīng)過8 d的分化后，脂滴積累的定量結(jié)果，**表示p<0.01；(b) 脂滴的油紅O染色結(jié)果，比例尺表示100 μm。

2.2 敲低PPP1R3C基因的表達抑制3T3-L1前脂肪細胞分化

在3T3-L1前脂肪細胞中轉(zhuǎn)染siPPP1R3C，檢測對前脂肪細胞分化的影響。轉(zhuǎn)染24 h后，實時定量PCR分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PPP1R3C特異性siRNA(siPPP1R3C)可以顯著降低PPP1R3C的mRNA表達水平(p<0.05；圖3(a))。利用油紅O染色檢測3T3-L1細胞脂肪生成過程中的脂滴積累。如圖所示，油紅O染色結(jié)果清晰地表明在誘導分化后第8 d，干擾PPP1R3C的3T3-L1細胞中的脂滴累積明顯減少(圖3(b)，(c))。此外，干擾PPP1R3C顯著降低了成脂分化標志基因的表達水平(圖4)。上述結(jié)果表明干擾PPP1R3C基因的表達會抑制3T3-L1細胞的成脂分化。

注：(a) 轉(zhuǎn)染24h后PPP1R3C的過表達效率，β-actin為內(nèi)參，**表示p<0.01；(b) 經(jīng)過8 d的分化后，脂滴積累的定量結(jié)果。*表示p<0.05；(c) 脂滴的油紅O染色結(jié)果，比例尺表示100 μm。

注：誘導分化后8 d的干擾組與對照組細胞的PPARγ(a);C/EBPα(b)和FABP4(c)基因表達的實時定量PCR分析，β-actin為內(nèi)參，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

注：(a) 轉(zhuǎn)染24 h后SREBP1的干擾效率，β-actin為內(nèi)參，**表示p < 0.01；(b) 誘導分化8 d后，脂滴的油紅O染色結(jié)果，比例尺表示100 μm；(c) 誘導分化期間各時間段干擾組與對照組的C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ基因表達的實時定量PCR分析，β-actin為內(nèi)參，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

2.3 敲低SREBP1基因的表達可抑制3T3-L1前脂肪細胞分化

首先檢測了在siSREBP1轉(zhuǎn)染24 h后SREBP1的表達，實驗組顯著低于對照組(圖5(a))。通過油紅O染色(圖5(b))可以看到干擾SREBP1后，實驗組脂滴積累明顯少于對照組的脂滴積累。在轉(zhuǎn)染的3T3-L1細胞脂肪生成過程中，分別檢測了前期脂肪分化標志基因(C/EBPβ)和后期標志基因(PPARγ和C/EBPα)在分化各時期的表達譜(圖5(c))，結(jié)果表明，與對照組(Scramble)相比，干擾組(siSREBP1)中的C/EBPβ基因表達量在誘導分化的第2 d差異極顯著(p<0.01)、第4 d差異顯著(p<0.05)；C/EBPα基因表達量在誘導分化的第2 d、第6 d和第8 d差異顯著(p<0.05)；PPARγ基因表達量在誘導分化的第4 d、第6 d差異顯著(p<0.05)、第8 d差異顯著(p<0.01)。

2.4 敲低SREBP1抑制PPP1R3C基因的表達

為了探究SREBP1基因?qū)PP1R3C基因的調(diào)控作用，干擾SREBP1基因后，利用實時定量PCR分別檢測了SREBP1基因和PPP1R3C基因在3T3-L1前脂肪細胞分化過程中各時期的相對表達量(圖6)。

注：誘導分化時各時間點干擾組與對照組的SREBP1和PPP1R3C基因的實時定量PCR分析，β-actin為內(nèi)參，*表示p < 0.05，**表示p< 0.01。

結(jié)果顯示，利用siRNA干擾SREBP1基因的表達，可導致PPP1R3C的表達受到抑制，說明PPP1R3C和SREBP1之間存在一定的關(guān)聯(lián)。在3T3-L1前脂肪細胞分化過程中，可能SREBP1基因參與調(diào)控PPP1R3C 基因的表達，準確的調(diào)控機制還需要進一步分析。

3 討論

脂肪細胞的成脂分化是由正、負調(diào)控因子嚴密調(diào)控的過程。但至今還沒有發(fā)現(xiàn)在缺失PPARγ的情況下，可發(fā)動脂肪細胞的成脂分化[15]。除此以外，SREBP1、糖皮質(zhì)激素、cAMP 應答元件結(jié)合蛋白和C/EBPδ對脂肪細胞的成脂分化都有促進作用；Wnts通路、 Krüppel樣因子家族部分成員、轉(zhuǎn)錄因子E2F家族、叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族的成員、C/EBP 同源蛋白等對成脂分化有負調(diào)控作用[16]。我們前期對3T3-L1脂肪細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄組的變化進行了研究，分析了D0和D13 的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)PPP1R3C基因在脂肪細胞分化過程中是上調(diào)的(log2FoldChange=3.97)[17]，暗示PPP1R3C基因在脂肪細胞分化中可能存在一定的功能。本研究結(jié)果顯示，過表達PPP1R3C基因促進了3T3-L1分化的脂肪細胞中脂肪特異性基因的表達和脂滴的形成。

本研究也發(fā)現(xiàn)，在3T3-L1前脂肪細胞中敲低PPP1R3C基因的表達，導致脂肪生成和脂肪基因表達受到抑制，提示PPP1R3C可能在3T3-L1脂肪形成過程中起正向調(diào)控作用。糖原和甘油三酯是人體能量儲存的兩種主要形式，在食物缺乏的不同階段提供能量。然而，糖原代謝是如何與脂肪組織中的脂肪沉積相聯(lián)系的還沒有明確的定論。在從禁食到進食狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中，脂肪組織中形成了大量的糖原，人們推測：(1) 脂肪組織可以合成糖原；(2) 脂肪組織的糖原代謝是特異性調(diào)控的；(3) 脂肪組織可能影響碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪；(4) 脂肪組織在糖脂代謝中似乎發(fā)揮更積極的作用。人們還假設(shè)糖原沉積是碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂肪組織中的脂肪的先決條件，因為脂肪沉積發(fā)生在糖原沉積之后[18]。通過缺失PPP1R3G的小鼠模型，與野生型相比，高脂肪飲食喂養(yǎng)后，PPP1R3G缺失小鼠的體重和脂肪組成顯著降低。高脂肪飲食引起的肝臟脂肪變性也因PPP1R3G的缺失而略有緩解。PPP1R3G的缺失降低了脂肪組織中的糖原水平。PPP1R3G的過表達會導致糖原和甘油三酯水平的升高。研究表明，糖原積極參與脂肪組織的脂肪積累和高脂肪飲食的肥胖發(fā)展，PPP1R3G是體內(nèi)糖原代謝與脂質(zhì)代謝相聯(lián)系的重要分子[19]。后來發(fā)現(xiàn)脂肪組織確實具有合成糖原的巨大能力。除了PPP1R3G外，PPP1R3B是脂肪組織中表達的另一個G亞基基因[6]。而本研究中的PPP1R3C基因與PPP1R3G、PPP1R3B基因同屬一個家族，在脂肪細胞分化過程中也是上調(diào)的，而且過表達PPP1R3C基因促進成脂分化，敲低其表達抑制成脂分化，說明PPP1R3C基因與PPP1R3G、PPP1R3B基因在糖原和脂肪代謝中可能有相似的功能。

另外，PPP1R3C基因受SREBP1基因的調(diào)控，PPP1R3C基因和SREBP1基因同時作為膽固醇合成途徑的重要組分，它們很有可能在調(diào)控脂肪生成的過程中存在協(xié)同作用[14]。有趣的是，我們的研究結(jié)果顯示，在3T3-L1前脂肪細胞中敲低SREBP1基因的表達，檢測到PPP1R3C基因的表達也是下調(diào)的，提示PPP1R3C對脂肪生成的影響可能是通過3T3-L1中的SREBP1調(diào)控來實現(xiàn)的，進一步證實SREBP1是否通過結(jié)合到PPP1R3C基因的啟動子上來調(diào)控其表達是必要的。

SREBPs自發(fā)現(xiàn)及命名以來，就被作為固醇類和脂肪酸合成中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子來研究[20-23]。SREBP1在甘油三酯和脂肪酸合成方面的調(diào)控作用顯著，由于SREBP1基因過度表達會導致非脂肪組織脂質(zhì)沉積聚合，從而造成組織病變[24]。雖然有明確的證據(jù)表明SREBP1并非肥胖發(fā)育所必需的[25]。然而，顯性抑制SREBP1的異位表達可減弱脂肪細胞的分化。此外，SREBP1過表達增強了PPARγ的活性[26]，其他研究表明，SREBP1參與了PPARγ配體的產(chǎn)生[15,27]?？傊?，在體外的研究支持SREBP1在成脂中的作用，而體內(nèi)研究表明SREBPs并非脂肪組織產(chǎn)生或擴展所必需，因此進一步的研究是必要的。

PTG基因敲除的小鼠肝糖原水平降低，肝脂質(zhì)減少，mTORC1/SREBP1減少，而且通過RNA-seq對轉(zhuǎn)錄組進行分析，發(fā)現(xiàn)SREBP1和許多參與脂肪生成的靶基因顯著下調(diào)。這些現(xiàn)象也許反映了PTG對 mTORC1/SREBP1和脂肪生成的反饋調(diào)節(jié)，從而介導糖原和脂質(zhì)代謝之間的串話[14]。此外，在膀胱癌細胞中也發(fā)現(xiàn)了PPP1R3C與SREBP1的調(diào)控關(guān)系[28]。本研究初步證實在3T3-L1前脂肪細胞分化中SREBP1可能對PPP1R3C起到一定的調(diào)控作用?？傊狙芯拷沂玖薖PP1R3C對3T3-L1前脂肪細胞脂肪分化具有促進作用，而且發(fā)現(xiàn)敲低SREBP1基因的表達導致PPP1R3C基因下調(diào)表達，推測PPP1R3C可能受到SREBP1的調(diào)控，為進一步研究PPP1R3C在脂肪細胞分化及脂肪沉積中的分子機制提供了一定的基礎(chǔ)。但在3T3-L1前脂肪細胞分化中， SREBP1對PPP1R3C的具體調(diào)控機制還需進一步的分析。