2014年北京地區(qū)嚙齒類實驗動物質量的病理學評價

李　超，董浩迪，徐琳凱，王春雨，宋志琦，劉春法，李超斯，岳瑞超，程廣宇，

趙化佳，趙德明，尹曉敏，周向梅，楊利峰

( 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院/國家動物海綿狀腦病實驗室，北京　100193)

?

2014年北京地區(qū)嚙齒類實驗動物質量的病理學評價

李超，董浩迪，徐琳凱，王春雨，宋志琦，劉春法，李超斯，岳瑞超，程廣宇，

趙化佳，趙德明，尹曉敏，周向梅，楊利峰

( 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院/國家動物海綿狀腦病實驗室，北京100193)

【摘要】目的從病理學角度評價嚙齒類實驗動物的健康情況，為實驗動物標準化飼養(yǎng)提供建議，確保相關科研結果的準確性。 方法 本文主要對2014年10月北京市15家實驗動物單位的嚙齒類實驗動物病理學抽檢情況進行統(tǒng)計分析。采集嚙齒類實驗動物的心、肝、脾、肺、腎、大腸和小腸后經(jīng)甲醛鈣液固定，通過石蠟切片HE染色、PAS 染色、冰凍切片油紅O染色后于顯微鏡下觀察。 結果 實驗動物總體合格，但個別單位仍然存在問題。檢出病變器官主要是肝臟和肺臟，肝臟病變檢出率小鼠為6%，大鼠為2.5%，豚鼠為8.2%，地鼠未檢出，肝臟病變表現(xiàn)為細胞腫脹，且經(jīng)特殊染色確證部分為脂肪變性；肺臟病變檢出率豚鼠為15.5%，其余未檢出，肺臟病變表現(xiàn)為淤血、滲出及間質性肺炎。 結論 實驗動物病理學檢測基本健康，肝臟出現(xiàn)損傷可能與飼料有關；而肺臟病變可能與墊料及空氣有關，而秋冬季霧霾及低溫可能對實驗動物健康有所影響。

【關鍵詞】嚙齒類實驗動物；病理學診斷；器官病變；油紅-O染色；PAS 染色

實驗動物的標準化對動物實驗研究結果的敏感性、準確性及可重復性具有重要影響。北京市實驗動物管理條例規(guī)定從事實驗動物繁育工作的單位，應當根據(jù)相關標準，定期進行質量檢測。

本實驗室歷年承擔北京市實驗動物質量抽查中的病理學檢查任務，本文就2014年10月北京市15家實驗動物單位的嚙齒類實驗動物健康狀況進行統(tǒng)計分析。結果顯示嚙齒類實驗動物質量總體合格，但個別單位仍然存在問題，主要病變器官是肝臟和肺臟。分析肝臟出現(xiàn)損傷可能與飼料和墊料有關，而肺臟病變反映飼養(yǎng)環(huán)境有待改善。環(huán)境條件可影響實驗動物的質量，環(huán)境控制程度越高，在該環(huán)境中的實驗動物標準化越高，實驗結果就更趨于穩(wěn)定一致[4]。

1材料和方法

1.1實驗動物

由中國食品藥品檢定研究院從北京市15家實驗動物單位包括北京沙河通利實驗動物養(yǎng)殖場【SCXK(京)2013-0007】、斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司【SCXK(京)2014-0006】、北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0008】、北京天壇生物制品股份有限公司【SCXK(京)2014-0005】、中國食品藥品檢定研究院【SCXK(京)2014-0013】、北京昌揚西山動物養(yǎng)殖場【SCXK(京)2011-0010】、北大醫(yī)學部實驗動物部【SCXK(京)2011-0001】、北京科宇動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2012-0004】、北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司【SCXK(京)2010-0001】、北京市海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠【SCXK(京)2011-0006】、維通利華實驗動物有限公司【SCXK(京)2012-0001】、北京芳元緣養(yǎng)殖場【SCXK(京)2014-0012】、北京海科祥瑞實驗動物養(yǎng)殖場【SCXK(京)2011-0009】、北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2014-0003】及北京富龍騰飛養(yǎng)殖中心【SCXK(京)2013-0004】抽取不同品系的小鼠(BALB/c、KM、C57、裸鼠、NIH、ICR)、大鼠(Wistar、SD、Lewis)和豚鼠三種嚙齒類實驗動物進行檢測，實驗動物均為 4 ～ 6 周齡(表1)。采樣工作在中國食品藥品檢定研究院【SYXK(京)2011-0037】動物實驗設施內進行，制片及診斷在中國農業(yè)大學【SYXK(京)2013-0013】國家動物性海綿狀腦病實驗室進行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

表1　2014年10月嚙齒類實驗動物采樣情況

1. 2實驗方法

1. 2. 1組織切片的制備和觀察

CO2窒息處死動物，采集動物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸，用甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定。按照常規(guī)方法制作石蠟切片，HE染色，OLYMPAS U-SRG數(shù)碼顯微鏡采圖并觀察。

1.2. 2肝臟油紅 O 染色

對于在 HE 染色下觀察疑似為脂肪變性的樣品肝臟，抽取部分進行脂肪的油紅O 染色。具體步驟為：

1)組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛+1%氯化鈣)固定一周，并于采樣后第二天換液;

2)制作肝組織冰凍切片，厚約10 μm;

3)用油紅O(5%)乙醇溶液染色約8 min;

4)用50%乙醇分化約30 s，自來水終止分化;

5)蘇木素復染核約1 min，自來水輕柔沖洗返藍約10 min;

6)甘油明膠封片，最后顯微鏡觀察。

1.2.3肝臟 PAS 染色

同時取做油紅 O 染色相同病例的肝組織做糖原的 PAS 染色。具體步驟為：

1)甲醛鈣液固定組織塊一周，并于采樣后第2天換液;

2)制作組織石蠟切片;

3)切片于梯度酒精中下行脫臘至水;

4)高碘酸液氧化5 min，蒸餾水洗2次;

5)切片置于密封Schiff 氏試劑中于37℃溫箱里染色30 min;

6)蒸餾水洗2次后，蘇木素復染10 min;

7)0.5%鹽酸酒精分化約10 s，自來水沖洗;

8)經(jīng)95%酒精及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察。

2結果(彩圖見封3)

2.1實驗鼠的肝臟病理學變化及統(tǒng)計

2.1.1鏡下病變

本次調查表明，肝臟以細胞腫脹變性為主，與正常對照(圖1A)比較，病變樣本鏡下可見肝索結構紊亂，肝細胞體積變大，內有大小不等、數(shù)量不等的空泡，肝細胞核深藍染，大小不一，可清楚地觀察到枯否氏細胞和少量的新生細胞，肝血竇內有大量紅細胞(圖1B)。對肝細胞腫脹樣本進行油紅O染色，陽性可見藍染肝細胞輪廓及細胞核，胞質中可見大量大小不一的圓形紅色脂滴(圖1C)。病變肝臟同時進行PAS染色可見陽性樣本肝細胞胞漿部分呈紫紅色即是糖原物質沉著的區(qū)域，與未著色部分的淡粉色形成明顯對比，胞核呈深紅著色(圖1D)。

2.1.2病變樣本統(tǒng)計

結果顯示100例小鼠樣本中，HE染色肝細胞腫脹有11例，其中輕度變性5例，中度6例，病變率為6%。油紅O染色未檢出脂肪變性，PAS染色確證其中4例為糖元沉積，特殊染色均呈陰性的細胞腫脹病例，可能是動物死后血管滲透性增大，血管中血漿成分滲入細胞中所造成；大鼠肝細胞腫脹變性程度總體輕微，40例大鼠樣本中，HE染色肝細胞腫脹有1例，病變率2.5%。并由PAS染色確證為糖原沉積；豚鼠肝細胞腫脹變性病例相對較多，程度較嚴重，110例豚鼠樣本中，HE染色細胞腫脹有21例，輕度12例，中度9例，病變率為8.2%。其中確證7例為脂肪變性，8例為糖元沉積，剩余6例可能由于死后血管通透性增大，血液成分滲出所致；10例地鼠樣本肝臟均未見明顯病變。

2.2實驗鼠的肺臟病理學變化及統(tǒng)計

2.2.1鏡下變化

肺臟病變主要以淤血、滲出及間質性肺炎為主，與正常對照(圖1E)比較，病變樣本低倍鏡下可見肺組織密度增大，不見特征性肺泡結構，肺靜脈、肺間隔以及肺泡腔內可見大量紅細胞，有的靜脈內有大量蛋白樣液體，細支氣管上皮脫落，細支氣管周圍間質有深染細胞聚集，肺泡隔增厚(圖1F)；高倍鏡下，細支氣管周深染細胞為淋巴樣細胞，肺間隔內有增生的肺泡上皮細胞、淋巴樣細胞，紅細胞位于毛細血管內，肺泡中有少量紅細胞、淋巴樣細胞、塵細胞及脫落上皮細胞，有的紅細胞崩解成均質紅染團塊。

2.2.2病變樣本統(tǒng)計

統(tǒng)計結果顯示，小鼠、地鼠肺臟未見明顯異常；大鼠肺臟以淤血、間質增厚、肺泡腔漿液滲出為主，但無炎性細胞浸潤，判斷為由于處死窒息造成的肺組織結構異常。其中肺臟充血、淤血、肺泡腔漿液滲出可能為窒息處死造成的組織學反應，而血管淤血可導致輕度的間質增厚；110例豚鼠肺臟樣本中，出現(xiàn)31例異常病例，其中17例為嚴重的淤血、間質增厚、肺泡腔漿液滲出，病變率為15.5%。

2.3實驗鼠其他器官的病理學變化及統(tǒng)計

2.3.1心臟病變

豚鼠心臟檢出1例出血性心肌炎，表現(xiàn)為急性心外膜出血、心肌出血，低倍鏡下，心外膜充血、出血，心外膜增厚，心肌纖維之間血管破裂出血(圖1G)；高倍鏡下，心肌纖維之間充滿紅細胞，同時有少量炎性細胞浸潤。可能與死前掙扎有關，由于窒息缺氧使血管通透性增加；腎上腺素分泌增多，使小血管、毛細血管內壓升高發(fā)生破裂。

2.3.2脾病變

此外大鼠新發(fā)現(xiàn)1例脾組織含鐵血黃素沉著，鏡下可見脾臟紅髓內少量出血和含鐵血黃素沉著(圖1H)，說明可能存在陳舊性出血，可能是窒息死亡較慢，缺氧導致血管通透性增大、脾臟紅細胞增多，血管中紅細胞進入組織后被吞噬細胞分解導致。

2.3.3腎臟病變

大鼠腎臟以腎小管，集合管官腔中出現(xiàn)均質粉染滲出為主要病變，但未見炎性細胞浸潤，很可能是由于死后血管通透性升高，血漿成分滲出而形成(圖1I)。豚鼠腎臟檢出3例腎淤血、出血及蛋白管型，可能是由于處死應激造成。

3討論

3.1結論

肝臟病變主要出現(xiàn)于小鼠和豚鼠，小鼠肝細胞腫脹主要由于糖元沉積造成，而豚鼠肝細胞脂肪變性和糖元沉積參半。

肺臟病變主要發(fā)生于豚鼠，表現(xiàn)為肺臟淤血、滲出及間質性肺炎。

全部鼠的小腸、大腸等臟器在鏡下無明顯病理變化。

綜上所述，絕大多數(shù)實驗用嚙齒動物為健康狀態(tài)，排除由于處死過程造成的組織學病理變化，非健康動物主要以肝臟，肺臟病變?yōu)橹鳌５w上看，各送檢單位的實驗用鼠各器官病變發(fā)生率均在合格范圍內，病理學檢測基本健康。

3.2分析

此次檢測發(fā)現(xiàn)主要病變發(fā)生于肝臟和肺臟。

3.2.1肝臟病變反映的問題

結合實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境級別來看，肝臟病變在所有100例普通級實驗動物中有7例，占7%，所有110清潔級實驗動物中有6例，占5.5%，全部50例SPF級實驗動物中有3例，占6%，肝臟病變在三個級別均有發(fā)生，且發(fā)生率差別極小(均值6.2%，極差1%，標準差0.6)。

通常肝臟病變反映進食情況，而數(shù)據(jù)顯示不論動物級別如何，肝臟均有一定程度病變，說明肝臟損傷可能與飼料有關，而各受檢單位均使用目前市場上的成品飼料商品，可見其原料質量及配方有待規(guī)范。而飲水來源則根據(jù)級別要求使用自來水或高壓滅菌自來水，故不排除自來水水質如微生物含量，重金屬、消毒劑及農藥殘留和硬度等對實驗動物健康的影響。秋冬季低溫同樣不容忽視，在低溫環(huán)境下動物能量代謝加強，需要通過增加采食量來維持熱平衡，如果飼料供應不足，同樣會引起營養(yǎng)不良和抗病力下降，飼料充足又易造成脂肪沉積，動物患肥胖病，故應注意固定飼喂次數(shù)及進食量。

3.2.2肺臟病變反映的問題

結合實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境級別分析，肺臟病變在全部100例普通級有15例，占比例較高(15%)，在全部110例清潔級有2例，所占比例較低(1.8%)，全部50例SPF級中無檢出病例(0%)，可見各級別肺臟病變發(fā)生率差異顯著(極差15%，標準差6)，且動物級別越低，肺臟病變越明顯。

肺臟病變主要反映飼養(yǎng)環(huán)境空氣情況?？梢娖胀墑游锏目諝饧皦|料有待改善，原因可能有墊料不合格、飼養(yǎng)密度過大、秋冬季霧霾天氣及低溫影響等。劣質的墊料碎屑及塵埃較多，極易造成異物刺激引發(fā)肺部炎癥。秋飼養(yǎng)間密度過大、通風不和飼養(yǎng)員清理不及時，室內的氣味(臭味、氨味)濃度就大，空氣不潔可誘發(fā)氣管炎、肺炎等。開放系統(tǒng)很大程度依賴于自然環(huán)境空氣質量，而北京地區(qū)秋季的霧霾嚴重，空氣欠佳，對實驗動物肺臟也有所影響。而秋冬季的低溫也是動物凍傷、感冒、支氣管炎和肺炎等疾病的直接誘因。

對比歷年肺臟病變檢出率可見(圖2)，歷年發(fā)生率呈波動趨勢，且秋季較為高發(fā)，幾次肺臟病變檢出率高峰(2011年、2013年)均發(fā)生于秋季，更加說明秋冬季霧霾天，空氣中可吸入顆粒物密度大，對實驗動物肺部病變有不可忽視的影響[1-2]。

圖2　2010年春至2014年秋北京市嚙齒類實驗動物肺臟病變檢出率Fig.2　The detectable rate of pulmonarydiseasesof rodent laboratory animal from 2010 to 2014

參考文獻：

[1]付永瑤,呂悅,王繼宏,等. 北京市大鼠、小鼠、豚鼠的病理學調查[J]. 中國比較醫(yī)學雜志,2014,24(7):54-56.

[2]呂悅,付永瑤,王繼宏,等. 2014年春季北京地區(qū)嚙齒類實驗動物健康狀況的病理學調查和分析[J]. 實驗動物科學,2014,4:6-10.

[3]趙德明,獸醫(yī)病理學[M].第 3 版. 北京:中國農業(yè)大學出版社,2013．

[4]劉艷,王瓏. 淺述實驗動物質量控制[J]. 中國公共衛(wèi)生管理,2011,01:25-27.

[5]McGavin, M. Donald/Zachary, JamesF.,Ph.D., Pathologic Basis of Veterinary Disease. fourth edition, Elsevier Science Health Science div, 2006-2008.

〔修回日期〕2015-04-07

調查報告

Assessing the quality of rodent laboratory animals in

Beijing area by pathological diagnosis in October 2014

LI Chao，DONG Hao-di，XU Lin-kai，WANG Chun-yu，SONG Zhi-qi，LIU Chun-fa，LI Chao-si，YUE Rui-chao，

CHENG Guang-yu，ZHAO Hua-jia，ZAO De-ming，YIN Xiao-min，ZHOU Xiang-mei，YANG Li-feng

( Veterinary Medicine，China Agricultural University / National Animal TSE Laboratory，Beijing 100193，China)

【Abstract】ObjectiveTo assess the health status of rodent laboratory animals by pathological diagnosis, our lab has being take apart in investigating the quality of laboratory animals in Beijing area for years and offer some advices for standardized breeding to ensure accurate results of scientific research. This paper focuses on the analysis of laboratory rodent samples that collected in October 2014. Methods We collected the heart, liver, spleen, lung, kidney, large intestine and small intestine, and put these organs into 10%Calcium formaldehyde solution for fixation, and then prepared into two different sections for optical microscopy observation including all paraffin specimens stained with H&E and the frozen sections stained with Oil Red-O and PAS． ResultsThe vast majority of laboratory rodents were up to standard, but there still a problem in individual units. The main problem is liver and lung disease. The rate of Hepatocyte swellingis 6% (mouse), 2.5% (rat), 8.2% (guinea pig), moreover part of them were lipidosis, according to Oil Red-O stain. the mainly problem of lung is congestion ,edema and Interstitial pneumonia ,the detectable rate of pulmonarydiseases is 15.5%(guinea pig). ConclusionsThe vast majority of laboratory rodents were pathologically diagnosed as healthy animals．The liver disease may be caused by improper feeding.And disease of lung may led by haze, unqualified bedding and low temperature.

【Key words】Laboratory rodents；Pathological diagnosis；Organ diseases；Oil red-ostain；PAS stain

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.016

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0067-04

[通訊作者]楊利峰，副教授，研究方向：動物病理學及Prion疾病致病機制研究，Email:yanglf@ cau.edu.cn。

[作者簡介]李超(1990-)，女，碩士生，研究方向：動物醫(yī)學病理診斷方面研究，Email:924313054@qq.com。

[基金項目]國家科技支撐計劃(2011BAI15B01)。