油紅O染色原代未活化胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴的實(shí)驗(yàn)觀察

唐元瑜 水楠楠

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，中醫(yī)基礎(chǔ)理論內(nèi)經(jīng)教研室，福州350108）

油紅O為活性很強(qiáng)的脂溶性染料，在組織或細(xì)胞的脂質(zhì)中高度溶解，與類脂有較強(qiáng)的親和力，具有使脂肪組織或細(xì)胞內(nèi)脂滴特異性著色的特性，常被廣泛用于體內(nèi)儲脂細(xì)胞如原代未活化的肝、胰星狀細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞的染色鑒定。

研究表明：胰腺纖維化是和慢性胰腺炎、胰腺癌密切相關(guān)的一種病理變化，而胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）則是胰腺纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞［1］。在生理情況下，胰腺星狀細(xì)胞處于靜止未活化狀態(tài)（quiescence），胞質(zhì)內(nèi)含有較豐富的維生素A和脂滴；病理狀況下，多種刺激因子如炎性因子、酒精及其代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等則可刺激其活化增殖，使細(xì)胞表型發(fā)生改變，轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，同時胞質(zhì)內(nèi)的脂肪滴逐漸減少，甚者消失［2，3］。本實(shí)驗(yàn)利用該細(xì)胞這一生物學(xué)特性，對原代培養(yǎng)的未活化胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴進(jìn)行了染色鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

材料和方法

1．材料

油紅O（AR，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：WSIG201008032），異丙醇（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：WSIG20101106），pH7．4磷酸鹽緩沖液（由 NaCl 8．00g KCl 0．20g Na2HPO4·12H2O2．82g KH2PO40．20g組成），400g／L甲醛液（AR，西隴化工股份有限公司，批號：1103032）。電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DK－S24），倒置生物顯微鏡（日本尼康公司，型號：Ti－S系列 ）。

2．方法

2．1原代小鼠胰腺星狀細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參考國外學(xué)者Kruse［4］及本文作者建立的方法［5］，主要包括取胰、消化、植塊培養(yǎng)等步驟。受試細(xì)胞選用原代培養(yǎng)4天的未活化胰腺星狀細(xì)胞。

2．2油紅O染液的配制

電子天平稱取油紅O粉末0．25g，放入50mL康寧螺口帶蓋的塑料錐形離心管中，添加異丙醇有機(jī)溶劑，定容至50mL，加蓋，封口膜密封，置離心管于60℃電熱恒溫水浴箱中，加熱溶解30min，中途顛倒搖晃2－3次以助溶，定性濾紙過濾，即得濃度為5g／L的飽和油紅O母液。

臨用時，取上述5g／L油紅O母液，與蒸餾水按體積比6∶4在50mL康寧螺口帶蓋的塑料錐型離心管中混勻后，加蓋靜置30min，小心吸取上清，定性濾紙再次過濾，即得油紅O工作染液。

2．3油紅O染色原代小鼠胰星狀細(xì)胞脂肪滴

主要包括漂洗、固定、浸染、脫色以及復(fù)染等步驟，即：用巴氏滴管吸取2mL37℃預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液于接種有原代胰腺星狀細(xì)胞的6孔板中，作十字形晃動，輕輕漂洗貼壁細(xì)胞2遍后，用濾紙吸盡孔中殘存的磷酸鹽緩沖液，加入1mL 100g／L甲醛液常溫下固定15min，棄之，再次予磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗固定的細(xì)胞2遍，然后沿孔壁緩慢加入3mL新鮮配制的油紅O工作液，加蓋，封口膜密封，在倒置生物顯微鏡下開始作動態(tài)觀察。

若鏡下觀察到脂肪滴顏色逐漸加深，呈鮮紅的、大小不一的串珠樣時，即可吸盡油紅O染液終止染色，并用磷酸鹽緩沖液小心漂洗2－3遍后，加入蘇木素液淡染胞核30S，再次予磷酸鹽緩沖液漂洗分化脫色，即可鏡下顯微成像。

結(jié) 果

1．胰腺星狀細(xì)胞活化前后的形態(tài)學(xué)比較

在倒置生物顯微鏡×200倍視野下，未活化的胰腺星狀細(xì)胞形態(tài)主要表現(xiàn)為胞核較大，呈卵圓形，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)粗糙，顆粒樣物質(zhì)充滿其中，將細(xì)胞核圍繞成“空泡樣”的戒環(huán)狀。活化的胰腺星狀細(xì)胞則體積較大，扁平，偽足發(fā)達(dá)，成“星芒狀”或“烏賊樣”。（圖1A，1B）

2．油紅O染色未活化胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴的觀察

未活化的胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴被油紅O染成鮮艷的紅色，大小不一的串珠樣“油珠子”分散于胞質(zhì)中，簇集成“環(huán)狀”，呈戒環(huán)樣包繞在細(xì)胞核周圍。（圖1C，1D）

討 論

原代未活化的胰腺星狀細(xì)胞是一類胞漿內(nèi)含有天然熒光素維生素A和脂肪滴的特殊類型的儲脂細(xì)胞，而油紅O能高度溶解于脂肪中，與其有較好的親和力。利用該細(xì)胞這一生物學(xué)特性，我們予5g／L油紅O飽和液對其進(jìn)行了染色和鑒定，觀察到未活化的胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴被油紅O染成鮮艷的紅色，大小不一的串珠樣“油珠子”分散于胞質(zhì)中，簇集成“環(huán)狀”，呈戒環(huán)樣包繞在細(xì)胞核周圍，從而證實(shí)了培養(yǎng)的原代胰腺星狀細(xì)胞含有脂肪滴這一重要生物學(xué)特征。

在本次試驗(yàn)中，我們體會到：選擇合適的受試細(xì)胞，把握好染色時間是進(jìn)行油紅染色原代未活化胰腺星狀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。對于該細(xì)胞脂滴染色的時間，我們一般選擇在置塊培養(yǎng)的4－5天時間進(jìn)行，因?yàn)樵摃r間點(diǎn)上細(xì)胞剛從組織塊爬出，脂肪滴含量較多，容易著色，背景干凈。此外，油紅O的正確配制和洗脫也是降低背景，提高信噪比的關(guān)鍵。由于油紅O難溶于水，易溶于異丙醇、乙醇等有機(jī)溶劑，0．5g油紅O在100mL異丙醇溶液中即可達(dá)到飽和，所以臨用前需采用過濾的方法除去不溶性的油紅顆粒及雜質(zhì)。為此，我們采用定性濾紙兩次過濾結(jié)合自然沉降法，避免了染色時不溶性油紅顆粒及雜質(zhì)在背景的沉積。對于油紅的漂洗，文獻(xiàn)報道常常使用600g／L的異丙醇或乙醇進(jìn)行分化脫色［6，7］，而我們則直接使用磷酸鹽緩沖液輕輕漂洗3遍，也同樣達(dá)到了消除背景油紅顏色的目的。此外，在染色過程中，加蓋密封以避免異丙醇揮發(fā)；添加油紅染液的量宜寧多勿少；蘇木素復(fù)染前應(yīng)小心吸取上清液以減少顆粒沉積，也都是降低背景，增加信噪比的重要措施。

由于油紅O在胞漿中是以脂滴的三維立體形式存在，且大小不一，顯微鏡聚焦時，細(xì)胞的焦點(diǎn)與油紅焦點(diǎn)可能不在一個層面上，所以細(xì)胞的顯微成像攝影技術(shù)也是油紅染色觀察成功與否的重要措施之一。我們體會到脂滴的觀察視野以×200放大倍數(shù)為最佳，同時配合顯微鏡的相差功能以及白平衡功能，即可獲得理想的成像效果。

總之，采用油紅O染色原代未活化的胰腺星狀細(xì)胞脂肪滴，是鑒定該細(xì)胞的重要方法之一，其步驟簡單，結(jié)果直觀，重復(fù)性高，值得學(xué)習(xí)和借薦。

圖 版 說 明

圖1 胰腺星狀細(xì)胞活化前后的形態(tài)學(xué)比較及油紅O染色脂肪滴的觀察．A：未活化的胰星狀細(xì)胞（×200）；B：活化的胰星狀細(xì)胞（×200）；C：油紅染色未活化胰星狀細(xì)胞（×100）；D：油紅染色未活化胰星狀細(xì)胞（×200）；E：蘇木素襯染未過濾造成的蘭黑色顆粒沉積；F：異丙醇揮發(fā)造成的紅褐色顆粒沉積

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The comparison of morphology of pancreatic stellate cells which is activated and quiescent and Experimental observation of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O

A：pancreatic stellate cells unctivated（×200）；B：pancreatic stellate cells activated （× 200）； C：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×100）；D：morphology of the primary pancreatic stellate cells stained by Oil red O（×200）；E：Dark blue particle deposition which is brought about by unfiltered Hematoxylin；F：Reddishbrown particle deposition which is brought about by Isopropanol volatile

［1］王興鵬．胰腺星狀細(xì)胞與胰腺纖維化．胰腺病學(xué)，2004，4（2）：72－75

［2］張汝玲，王興鵬．慢性胰腺炎胰腺纖維化發(fā)生機(jī)制及抗纖維化治療進(jìn)展．胰腺病學(xué)，2001，1（1）：56－58

［3］余曉云，陳婕，侯曉華．胰腺星狀細(xì)胞活化相關(guān)因子研究進(jìn)展．世界華人消化雜志，2006，14（20）：2009－2013

［4］Kruse，Marie－Luise．Isolation，Long－term Culture and Characterization of Rat Pancreatic Fibroblastoid／Stellate Cells．Pancreas，2001，23（1）：49－54

［5］唐元瑜，蘇式兵．小鼠胰星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定．世界華人消化雜志，2010，18（1）：28

［6］崔葉青，李嘉，劉爽等．油紅O染色鑒定胰腺星狀細(xì)胞．中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（5）：522－523

［7］田玉旺，李琳，李麗等．介紹一種改良的油紅O脂肪染色法．中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16（6）：736