骨肉瘤中血管生成擬態(tài)與HIF－1α蛋白的關(guān)系及臨床意義

鮑正齊 柴大敏 肖玉周 張長(zhǎng)春 吳 敏 周建生＊

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，安徽233003）

骨肉瘤（osteosarcoma）是骨組織最常見(jiàn)的惡性腫瘤，易早期發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，在臨床診斷的病例中，約80%的病例在確診時(shí)已存在由血道轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處部的微小瘤灶［1］。最近的研究發(fā)現(xiàn)一些高度惡性腫瘤除了血管生成（angiogenesis）外，還存在一種不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血液供應(yīng)模式—血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM），即腫瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和基質(zhì)重塑產(chǎn)生血管樣通道，從而滿足自身血液供應(yīng)的方式，使腫瘤更易侵襲和轉(zhuǎn)移。

缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）基因位于14號(hào)染色體，編碼826個(gè)氨基酸，當(dāng)細(xì)胞缺氧時(shí)，HIF－lα在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)。當(dāng)惡性腫瘤快速生長(zhǎng)，發(fā)生缺氧時(shí)，HIF－lα?xí)险{(diào)VEGF等多種靶基因表達(dá)以逃避或適應(yīng)相對(duì)缺氧環(huán)境，參與腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［2－3］。本研究采用免疫組織化學(xué)和組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)108例骨肉瘤和對(duì)照組28例骨軟骨瘤組織中VM、HIF－1α和微血管密度（microvessel density，MVD）表達(dá)情況，分析其與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，旨在探尋影響骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間的指標(biāo)。

材料和方法

1．一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科2003年1月至2008年12月存檔石蠟包埋骨肉瘤標(biāo)本108例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療及免疫治療，具有完整的臨床、病理及隨訪資料且經(jīng)過(guò)患者及人體試驗(yàn)倫理道德委員會(huì)（蚌埠醫(yī)學(xué)院）同意。病程1－4個(gè)月，平均2．42±0．45個(gè)月，男性67例，女性41例；年齡6－75歲，平均22．23±13．09歲，其中＜22歲55例，≥22歲53例；軟組織浸潤(rùn)52例、無(wú)浸潤(rùn)56例；遠(yuǎn)處（包括遠(yuǎn)處）轉(zhuǎn)移59例、無(wú)轉(zhuǎn)移49例；腫瘤部位：膝關(guān)節(jié)附近58例（股骨下端31例、脛骨上端27例），頜骨31例（上頜骨21例、下頜骨10例），其他部位19例（肱骨上端9例，腓骨3例，鎖骨3例，胸骨4例）；組織分型：骨母細(xì)胞型55例，纖維母細(xì)胞型35例，軟骨母細(xì)胞型18例；病理分級(jí)低危險(xiǎn)度（G1級(jí)）23例，中、高危險(xiǎn)度（G2級(jí)）85例；按Enneking分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期40例，Ⅲ期45例，以同時(shí)期28例骨軟骨瘤作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)兩位以上資深病理醫(yī)師確診。

2．實(shí)驗(yàn)試劑和方法

2．1實(shí)驗(yàn)試劑

鼠抗人單克隆 HIF－lα抗體（SC－53546）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，稀釋濃度為 1：200；CD34（MAB－0034）單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；ElivisionTMplus試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

2．2免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus法，每張切片連續(xù)切數(shù)張，每張約4－5μm厚，烤干，置于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，以PBS緩沖液代替一抗作空白對(duì)照。

2．3CD34和PAS套染及MVD計(jì)數(shù)

免疫組織化學(xué)CD34染色，DAB顯色后蒸餾水沖洗1min左右終止顯色反應(yīng)，置于0．5%過(guò)碘酸中還原5－8min，蒸餾水沖洗2min，置于Schiff液中染色10min，0．5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次，蒸餾水沖洗2min，此后依次蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水后中性樹膠封片。CD34主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)／胞膜，因而可以通過(guò)CD34的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行MVD的計(jì)數(shù)，參照修改過(guò)的Weidner［4］法計(jì)數(shù)。

3．結(jié)果判定

HIF－lα蛋白主要位于腫瘤細(xì)胞及對(duì)照組織細(xì)胞的胞核，呈棕褐色細(xì)顆粒狀，胞漿僅有少量表達(dá)。免疫組化結(jié)果采用半定量雙評(píng)分法評(píng)價(jià)：每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞記為：＜10%為0分；10－50為1分；51－75為2分；﹥75為3分；細(xì)胞著色強(qiáng)度記為：不著色為0分；淺黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。兩者分?jǐn)?shù)相乘0－1分為（－）；2－3分為（＋）；4－6分為（＋＋）；＞6分為（＋＋＋）。根據(jù)免疫組化結(jié)果和患者術(shù)后存活時(shí)間的不同，截定點(diǎn)為3，即≤3分為低表達(dá)，≥4分為過(guò)表達(dá)；免疫組化結(jié)果由資深病理醫(yī)師讀片評(píng)定。

4．隨訪

隨訪定義為自首發(fā)癥狀至死亡之間的時(shí)間為總體存活時(shí)間（Overall survival time，OS），自手術(shù)之日起至腫瘤復(fù)發(fā)或再次轉(zhuǎn)移所經(jīng)歷時(shí)間稱為無(wú)瘤存活時(shí)間（Disease free survival time，DFS），所選病例隨訪至患者死亡或截止2012年12月，隨訪時(shí)間為3－110個(gè)月。

5．統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Kaplan－Meier法比較 VM、HIF－lα過(guò)表達(dá)及 MVD陽(yáng)性組與陰性組之間的生存差異；Log－rank檢驗(yàn)比較組間差異；Cox多因素分析骨肉瘤患者臨床病理因素及VM、HIF－lα和 MVD與預(yù)后之間的關(guān)系；VM、HIF－lα和 MVD在骨肉瘤組織及骨軟骨瘤中的表達(dá)及與臨床病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．骨肉瘤組織中VM與臨床病理因素之間的關(guān)系

通過(guò)蘇木素－伊紅（HE）染色觀察到在異型的細(xì)胞間有腳手架結(jié)構(gòu)樣骨樣組織（圖1A）結(jié)合影像學(xué)和臨床病史確診為骨肉瘤，且在骨肉瘤組織中存在VM結(jié)構(gòu)（圖1B），即腫瘤細(xì)胞圍繞成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)可有可無(wú)紅細(xì)胞，具有VM的腫瘤細(xì)胞附近不見(jiàn)壞死的腫瘤細(xì)胞及炎癥細(xì)胞；通過(guò)CD34和PAS套染VM顯示為管壁沒(méi)有CD34陽(yáng)性的梭形內(nèi)皮細(xì)胞環(huán)繞而有PAS陽(yáng)性的基底膜樣結(jié)構(gòu)。管壁有CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，無(wú)論管腔內(nèi)有無(wú)紅細(xì)胞，均判定為內(nèi)皮依賴性血管（圖1C，D）。

在108例骨肉瘤組織中查見(jiàn)68例存在VM樣通道，其陽(yáng)性率為62．96%（68／108）；骨軟骨瘤中不存在VM樣通道，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。VM與患者的性別、年齡、部位、組織學(xué)分型及直徑之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），與病理分級(jí)、軟組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)表1。

2．骨肉瘤組織中HIF－lα過(guò)表達(dá)及其與臨床病理因素之間的關(guān)系

HIF－lα主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕褐色（圖1E，F(xiàn)）。HIF－lα在骨肉瘤及骨軟骨瘤組織中過(guò)表達(dá)率分別57．41%（62／108）和32．14%（9／28），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；HIF－lα表達(dá)水平與患者的性別、年齡、部位、組織學(xué)分型及直徑之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與病理分級(jí)、軟組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)表1。

3．骨肉瘤組織中 MVD與臨床病理因素、VM及HIF－lα蛋白過(guò)表達(dá)之間的關(guān)系

MVD的均值為22．47±8．38，故以 MVD＜22為陰性組，MVD≥22為陽(yáng)性組。MVD在骨肉瘤組織中陽(yáng)性率為58．33%（63／108），在骨軟骨瘤組織中陽(yáng)性率為28．57%（8／28），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。MVD與患者的性別、年齡、部位、組織學(xué)分型及直徑之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與病理分級(jí)、軟組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見(jiàn)表1。

Spearman相關(guān)分析顯示，在骨肉瘤組織中VM，HIF－lα蛋白過(guò)表達(dá)及 MVD兩兩之間均呈正相關(guān)（P＜0．01，表2）。

表1 骨肉瘤患者中VM、HIF－1α過(guò)表達(dá)及MVD與臨床病理因素之間的關(guān)系（n＝108）Table 1 Correlation of VM，over－expression of HIF－1αand MVD to clinicopathologic characateristics in osteosarcoma（n＝108）．

表2 骨肉瘤組織中VM、HIF－lα表達(dá)水平及MVD之間的相互關(guān)系（n＝108）Table 2 The association of VM，HIF－lαand MVD in osteosarcoma（n＝108）

4．多因素預(yù)后分析

將性別（男與女）、年齡（＜22歲與≥22歲）、腫瘤部位（膝關(guān)節(jié)附近、頜骨與其他部位）、病理分級(jí)（G1組與G2組）、組織類型（骨母細(xì)胞型、纖維母細(xì)胞型與軟骨母細(xì)胞型）、腫瘤直徑（≥5．0cm組與＜5．0cm組）、軟組織浸潤(rùn)（浸潤(rùn)組與無(wú)浸潤(rùn)組）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移組與無(wú)轉(zhuǎn)移組）、Enneking分期（Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ期）、VM（陰性組與陽(yáng)性組）、MVD（≥22組與＜22組）和HIF－lα蛋白（過(guò)表達(dá)組與低表達(dá)組）等因素引入Cox模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析，結(jié)果顯示VM、HIF－lα蛋白表達(dá)的水平和MVD、軟組織浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Enneking分期是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0．05，表3）。

5．生存分析

Kaplan－Meier生存分析顯示108例骨肉瘤患者，至隨訪結(jié)束之日起，存活時(shí)間超過(guò)60個(gè)月（5年）者共41例，即總體5年存活率為37．97%（41／108）。VM陽(yáng)性與陰性組、HIF－1α過(guò)表達(dá)與低表達(dá)組及MVD≥22與＜22組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見(jiàn)表4，生存曲線見(jiàn)圖2。

表3 108例骨肉瘤患者COX多因素生存分析Table 3 Multivariate survival analysis of 108patients with osteosarcoma

表4 不同VM、HIF－1α和MVD組骨肉瘤患者5年存活率、總體和無(wú)瘤存活時(shí)間Table 4 The 5－year－survival rate，overall and disease free survival time of patients with osteosarcoma in different VM，HIF－1αand MVD groups

討 論

血管生成擬態(tài)是1999年由 Maniotis［5］等首次提出，即后來(lái)被Folberg等［6］描述的PAS陽(yáng)性圖案：直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹樣的（沒(méi)有完全封閉）、有分支的彩虹樣的、封閉的環(huán)狀的和網(wǎng)絡(luò)狀的通道（即最少有3個(gè)背靠背的PAS陽(yáng)性環(huán)）。該通道的特點(diǎn)是無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，內(nèi)皮細(xì)胞特異標(biāo)記物（CD31，CD34，F(xiàn)Ⅷ）染色均為陰性，腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管形成而形成瘤細(xì)胞條索并圍成通道，而血液可在這無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞的通道中流動(dòng)，通道外周是一層厚薄不一的PAS陽(yáng)性物質(zhì)構(gòu)成的基底膜。研究發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤、炎性乳腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、胃惡性間質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌［7－10］等高度侵襲性腫瘤中存在VM。本研究108例骨肉瘤組織中68例存在符合VM結(jié)構(gòu)的管道，而正常骨軟骨瘤組織中不存在VM結(jié)構(gòu)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。存在VM的骨肉瘤患者病理分級(jí)較差、軟組織浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高且Enneking分期更晚（Ⅱ和Ⅲ期），組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。VM陽(yáng)性組患者的5年存活率（8．82%）顯著低于VM陰性組患者（87．5%），且患者總體生存時(shí)間（28．5±1．39）及無(wú)瘤生存時(shí)間（12．250±0．736）均顯著低于VM 陰性組（68．5±1．15和38．725±2．207）。我們觀察到在VM區(qū)域腫瘤細(xì)胞壞死現(xiàn)象不明顯，說(shuō)明在VM存在的情況下確實(shí)形成了有效的血液供應(yīng)模式。正如Zhang et al［11］提出的腫瘤血供的“三階段現(xiàn)象”，即在腫瘤小于2．0mm時(shí)，主要是通過(guò)VM形成的功能性微循環(huán)供血；之后內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)入腫瘤細(xì)胞之間形成馬賽克血管，管腔由腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成；然后進(jìn)一步成熟為內(nèi)皮依賴性微血管。我們的研究中，根據(jù) Weidner［2］計(jì)數(shù)法 MVD≥22組患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及軟組織浸潤(rùn)率顯著高于MVD＜22組患者；MVD≥22組患者具有更晚的Enneking分期（Ⅱ和Ⅲ期）和更高的病理分級(jí)（G2）。MVD≥22組患者5年存活率（3．17%）明顯低于MVD＜22組5年存活率（86．67%）；且MVD≥22組患者平均OS和平均DFS（分別為27．33±1．21和11．762±0．757）顯著低于MVD＜22組患者（65．69±1．87和36．467±2．186）。

本研究結(jié)果顯示，在108例骨肉瘤患者中有62例HIF－1α過(guò)表達(dá)，其過(guò)表達(dá)率57．41%高于骨軟骨瘤32．14%（P＜0．05）。HIF－1α過(guò)表達(dá)組骨肉瘤患者較HIF－1α低表達(dá)組患者具有更差的病理分級(jí)、更晚的臨床分期且更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和軟組織浸潤(rùn)；HIF－1α過(guò)表達(dá)組患者5年存活率（8．06%）顯著低于 HIF－1α低表達(dá)組（78．26%）；HIF－1α過(guò)表達(dá)組患者平均 OS（27．16±1．31）和平均 DFS（11．903±0．766）也顯著低于 HIF－1α蛋白低表達(dá)組平均OS（65．09±1．80）和平均 DFS（35．739±2．252）。Spearman相關(guān)性分析顯示HIF－lα過(guò)表達(dá)與 MVD及VM之間呈正相關(guān)性（P＜0．01），提示在腫瘤快速生長(zhǎng)發(fā)生缺氧時(shí)，引起 HIF－1α的積聚和活性增高，調(diào)節(jié)其下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，刺激腫瘤微血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境并且不斷增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移［12－13］。有研究顯示HIF－lα通過(guò)上調(diào)或下調(diào)肝素酶和曲古抑菌素使骨肉瘤細(xì)胞和組織中 MVD 增大［14－15］，我們推測(cè)HIF－lα過(guò)表達(dá)在參與腫瘤MVD形成同時(shí)，某些具有可塑性的腫瘤細(xì)胞就會(huì)變形，形成VM通道使腫瘤細(xì)胞獲得足夠氧供，這也可以解釋為什么具有VM結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞周圍壞死較少。我們的結(jié)果和國(guó)內(nèi)外很多文獻(xiàn)報(bào)道抑制HIF－1α的表達(dá)可以阻斷 VM 的形成一致［16－18］，這些提示我們，缺氧很可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成VM的一個(gè)重要始動(dòng)因素。多因素分析顯示MVD、VM及HIF－1α蛋白過(guò)表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤(rùn)和Enneking分期是影響患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，HIF－1α過(guò)表達(dá)可能是骨肉瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，血管新生和VM可能是骨肉瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程。而HIF－1α、VM和MVD可能成為患者預(yù)后判斷的病理學(xué)指標(biāo)，為骨肉瘤患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

圖 版 說(shuō) 明

圖1 VM及HIF－lα蛋白在骨肉瘤及骨軟骨瘤組織陽(yáng)性染色（×400）A骨肉瘤組織中骨樣組織及異型細(xì)胞（HE×400）；B骨肉瘤組織中VM結(jié)構(gòu)（箭頭所示，HE×400）；C，D骨肉組織中VM及微血管（黑箭頭示VM，紅箭頭示微血管，CD34＋PAS×400）；E骨肉瘤組織中 HIF－lα過(guò)表達(dá)（ElivisionTM×400）；F 骨軟骨瘤組織中 HIF－lα弱表達(dá)（ElivisionTM×400）。

圖2 108位骨肉瘤患者VM陰性及陽(yáng)性、HIF－1α蛋白過(guò)表達(dá)及低表達(dá)和MVD≥22和＜22總體及無(wú)瘤生存曲線。A VM陽(yáng)性及陰性組患者總體生存曲線；B VM陽(yáng)性及陰性組患者無(wú)瘤生存曲線；C HIF－1α蛋白過(guò)表達(dá)陽(yáng)性及陰性組患者總體生存曲線；D HIF－1α蛋白過(guò)表達(dá)陽(yáng)性及陰性組患者無(wú)瘤生存曲線；E MVD≥22和＜22組患者總體生存曲線；F MVD≥22和＜22組患者無(wú)瘤生存曲線。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Positive staining of VM and HIF－lαprotein in osteosarcoma and osteochondroma （×400）A There were osteoid tissue and atypia tumor cells in osteosarcoma（HE×400）；B There were VM in osteosarcoma（black arrow，HE ×400）；C，D Positive staining of VM and micro－vessel（black arrow is VM，red arrow is micro－vessel，CD34＋PAS double staining×400）；E Over－expression of HIF－lαin osteosarcoma （ElivisionTM ×400）；F Low－expression of HIF－lαin osteochondroma（ElivisionTM×400）．

Fig．2The overall and disease－free survival curve of 108patients in VM positive or negative groups，over－or low－expression of HIF－1αprotein groups and MVD≥22or＜22groups with osteosarcoma．A Overall survival curve of osteosarcoma patients with VM positive or negative group；B Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with VM positive or negative group；C Overall survival curve of osteosarcoma patients with HIF－1αprotein over－or low－expression groups；D Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with HIF－1αprotein over－or low－expression group；E Overall survival curve of osteosarcoma patients with MVD ≥22or＜22groups；F Disease－free survival curve of osteosarcoma patients with MVD ≥22or＜22groups．

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