單克隆抗體ND－1－量子點(diǎn)熒光探針對大腸癌細(xì)胞的特異成像研究

王 蒴 方 瑾

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110001）

大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。早診斷、早治療是提高大腸癌治愈率的關(guān)鍵。通過從分子水平對腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的高靈敏度檢測，有助于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷［1－2］。LEA（large external antigen，LEA）是在大腸癌細(xì)胞表面表達(dá)的一種腫瘤相關(guān)抗原。相關(guān)研究表明，LEA的表達(dá)具有一定的組織特異性，即在正常組織、非大腸癌及低分化大腸癌組織中，幾乎不表達(dá)或表達(dá)率很低，在中高分化大腸癌組織中高度表達(dá)，對其檢測有助于實(shí)現(xiàn)大腸癌的早期診斷［3］。ND－1是利用雜交瘤技術(shù)制備的抗LEA的單克隆抗體，研究顯示，該抗體可與表達(dá)有LEA的大腸癌細(xì)胞特異性結(jié)合［4］，有可能發(fā)展為有效的分子探針，實(shí)現(xiàn)大腸癌的特異性成像和檢測。

量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）是一種新型的熒光染料，一般是由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素組成的納米級半導(dǎo)體顆粒。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有的特點(diǎn)是激發(fā)光譜寬且連續(xù)，發(fā)射光譜窄且對稱；熒光強(qiáng)度高，是普通熒光染料的10－20倍，檢測的靈敏度高；抗光漂白能力強(qiáng)，適合長時(shí)、動(dòng)態(tài)的生命過程的研究；利用發(fā)射波長位于紅外區(qū)的量子點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)在活體動(dòng)物體內(nèi)深層組織的成像研究［5－8］。

研究采用共價(jià)偶聯(lián)方式制備ND－1與量子點(diǎn)QD605的熒光探針，并通過條件優(yōu)化獲得最佳的偶聯(lián)效率，采用該探針成功實(shí)現(xiàn)對大腸癌細(xì)胞的靶向識別和特異性成像。

材料和方法

1．材料

人大腸癌細(xì)胞系CCL187、人宮頸癌細(xì)胞系He－La、雜交瘤細(xì)胞株IC2為本室保存。BALB／c小鼠購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。量子點(diǎn)（QD605）購于武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)公司。1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1－Ethyl－3－（3－dimethyllaminopropyl）－carbodiie－h(huán)ydrochlide，EDC）、N－羥 基 硫 代琥珀 酰 亞 胺 （N－Hydroxysulfosuccinimide sodium salt，NHS）、DAPI、降植烷購于 Sigma－Aldrich公司。

2．方法

2．1單克隆抗體ND－1的制備、純化及鑒定

取6－8周齡純系雌性BALB／c小鼠，腹腔內(nèi)注射降植烷0．5ml／只進(jìn)行體內(nèi)免疫抑制反應(yīng)，7日后等量注射第二次。一周后，腹腔注射對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞IC2，細(xì)胞密度為1－2×106／ml，注射劑量為0．5ml／只，10－20日后陸續(xù)抽取腹水。收集的腹水經(jīng)離心、透析后，HiTrap protein G柱親和層析純化，SDS－PAGE電泳測定抗體純度，Bradford法測定抗體濃度，并將抗體濃度調(diào)整至1mg／ml，4℃保存、備用。以純化后ND－1為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗孵育人大腸癌細(xì)胞CCL187，熒光顯微鏡下檢測單克隆抗體ND－1的免疫活性。

2．2量子點(diǎn)熒光探針ND－1－QD605的制備及條件優(yōu)化

取一定量的 QD605，分別加入0．1mol／L EDC和0．01mol／L NHS，搖動(dòng)反應(yīng)15min，超濾后即為量子點(diǎn)活化液。取100μl量子點(diǎn)活化液，分別加入不同量ND－1，搖動(dòng)反應(yīng)90min后，10000rpm離心2min，上清液即為偶聯(lián)產(chǎn)物ND－1－QD605。本研究分別在量子點(diǎn)：抗體蛋白摩爾比為1∶20，1∶40，1∶80條件下進(jìn)行偶聯(lián)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過電泳條帶分析，確定偶聯(lián)的最佳條件。

2．3ND－1－QD605熒光特性檢測

2．3．1ND－1－QD605激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

分別取400μl ND－1－QD605溶液和游離量子點(diǎn)QD605，利用熒光分光光度計(jì)掃描各自的激發(fā)光譜，掃描范圍200nm－800nm；再以掃描得到的最大激發(fā)波長為激發(fā)光，掃描偶聯(lián)產(chǎn)物與游離量子點(diǎn)發(fā)射光譜，掃描范圍400nm－800nm。

2．3．2ND－1－QD605抗光漂白能力檢測

取400μl ND－1－QD605溶液置于熒光分光光度計(jì)樣品室內(nèi)，用488nm的激發(fā)光持續(xù)照射1h，實(shí)時(shí)測定其熒光強(qiáng)度，得到時(shí)間―熒光強(qiáng)度曲線，通過分析熒光強(qiáng)度的變化，考察ND－1－QD605的抗光漂白能力。

2．4ND－1－QD605對靶細(xì)胞 CCL187的特異性免疫熒光成像

取蓋片培養(yǎng)的人大腸癌CCL187細(xì)胞，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS漂洗3次；滴加 ND－1－QD605，37℃濕盒孵育1h，PBS漂洗3次；DAPI避光染色5min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光信號。以PBS和游離量子點(diǎn)QD605替代ND－1－QD605孵育CCL187細(xì)胞為空白對照組，用ND－1－Q D605孵育LEA陰性表達(dá)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞為陰性對照組。

結(jié) 果

1．單克隆抗體ND－1的制備、純化及檢測

純化后的單克隆抗體ND－1經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測，在55kD及25kD附近呈現(xiàn)清晰的兩條帶（圖1），與IgG抗體的重鏈和輕鏈的理論分子量一致，經(jīng)凝膠成像掃描顯示，抗體純度達(dá)到95%。免疫熒光檢測結(jié)果顯示（圖2），ND－1能夠與表達(dá)有LEA的CCL187細(xì)胞特異性結(jié)合，細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的綠色熒光。

2．ND－1－QD605制備及電泳檢測

以不同摩爾比的游離量子點(diǎn)QD605和ND－1抗體混合制備ND－1－QD605。瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示，二者比例為1：20時(shí)，電泳圖中可見ND－1－QD605和游離量子點(diǎn)QD605兩條帶，提示反應(yīng)體系中量子點(diǎn)過量；隨著抗體蛋白比例的增加，QD605條帶消失，同時(shí)ND－1－QD605條帶遷移速率減慢，可能的原因是伴隨抗體比例的增加，量子點(diǎn)偶聯(lián)的蛋白分子數(shù)量增加，使偶聯(lián)產(chǎn)物分子量增大［9］?？紤]到偶聯(lián)產(chǎn)物分子空間粒徑過大不利于細(xì)胞表面抗原的標(biāo)記，優(yōu)化選取的偶聯(lián)比例為1∶40。

3．ND－1－QD605熒光特性檢測

對ND－1－QD605和游離量子點(diǎn)QD605分別進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖4所示，偶聯(lián)后的 ND－1－QD605的熒光激發(fā)光譜的范圍較寬泛，在200nm－600nm范圍內(nèi)為能量吸收區(qū)域，與QD605相比，激發(fā)波長范圍沒有明顯的改變（圖4A）；發(fā)射光譜檢測顯示偶聯(lián)產(chǎn)物保留了游離量子點(diǎn)在605nm處的特征發(fā)射峰，峰型對稱（圖4B）；同時(shí)，在被檢測的量子點(diǎn)濃度相同的條件下，偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度明顯高于游離量子點(diǎn)。

將ND－1－QD605溶液置于熒光分光光度計(jì)樣品室內(nèi)，用488nm激發(fā)光持續(xù)照射樣品溶液進(jìn)行抗光漂白實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示，在持續(xù)激發(fā)照射1h內(nèi)，ND－1－QD605溶液的熒光信號強(qiáng)度未發(fā)生明顯改變。

4．ND－1－QD605對靶細(xì)胞CCL187的特異性免疫熒光成像

以ND－1－QD605孵育表達(dá)有LEA的CCL187細(xì)胞，DAPI對核復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察可見，CCL187細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的紅色熒光，核復(fù)染顯示紅色熒光信號定位于細(xì)胞膜上（圖6A、6B、6C）。在以PBS和游離量子點(diǎn)QD605代替ND－1－QD605的空白對照組，未見量子點(diǎn)熒光顯像（圖6D、6E、6F）；以 ND－1－QD605孵育LEA表達(dá)陰性的 HeLa細(xì)胞，也未見特異性成像（圖6G、6H、6I）。

圖6 ND－1－QD605標(biāo)記CCL187細(xì)胞和 HeLa細(xì)胞的熒光圖像（×100）A：ND－1－QD605標(biāo)記CCL187細(xì)胞；B：DAPI染色示CCL187細(xì)胞核；C：A和B的合并圖像；D：PBS和游離量子點(diǎn)QD605標(biāo)記CCL187細(xì)胞；E：DAPI染色示CCL187細(xì)胞核；F：D和E的合并圖像；G：ND－1－QD605標(biāo)記HeLa細(xì)胞；H：DAPI染色示Hela細(xì)胞核；I：G和H的合并圖像Fig．6Fluorescence images of CCL187cells and HeLa cells labeled with ND－1－QD605（×100）A：CCL187cells labeled by ND－1－QD605；B：CCL187cell nuclei stained with DAPI；C：Overlap images in A and B；D：CCL187cells labeled by PBS and free QD605；E：CCL187cell nuclei stained with DAPI；F：Overlap images in D and E；G：He－La cells labeled by ND－1－QD605；H：Hela cell Nuclei stained with DAPI；I：Overlap images in G and H

討 論

研究將抗人大腸癌單克隆抗體ND－1與量子點(diǎn)共價(jià)偶聯(lián)，成功制備可以特異性識別大腸癌細(xì)胞表面表達(dá)的LEA的熒光探針ND－1－QD605，并實(shí)現(xiàn)對大腸癌細(xì)胞的靶向熒光成像。熒光特性檢測表明，與抗體蛋白共價(jià)偶聯(lián)后，該熒光探針仍保留量子點(diǎn)優(yōu)良的熒光特性，即較寬泛的激發(fā)譜線，較窄的發(fā)射譜線，非常強(qiáng)的抗光漂白能力。同時(shí)，免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，與量子點(diǎn)共價(jià)偶聯(lián)后，該抗體蛋白仍具有與細(xì)胞表達(dá)的抗原的特異結(jié)合活性。這些結(jié)果表明，將量子點(diǎn)和單克隆抗體ND－1偶聯(lián)后制備的熒光探針，能夠很好地應(yīng)用于大腸癌細(xì)胞特異的免疫熒光成像。

在對ND－1－QD605進(jìn)行熒光光譜掃描時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，與游離量子點(diǎn)相比，偶聯(lián)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度有所增加。量子點(diǎn)能夠產(chǎn)生熒光的原因是當(dāng)受到激發(fā)光照射時(shí)，其表面的電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，同時(shí)釋放多余的能量，即產(chǎn)生熒光。在量子點(diǎn)制備過程中，會(huì)在量子點(diǎn)表面產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)－－量子阱，它會(huì)吸收電子躍遷時(shí)產(chǎn)生的能量，降低量子點(diǎn)的熒光效率。當(dāng)?shù)鞍追肿油ㄟ^共價(jià)鍵連接在量子點(diǎn)表面后，可以對其表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，減少量子阱結(jié)構(gòu)的存在，從而提高量子點(diǎn)的熒光效率［10］。因此，量子點(diǎn)與抗體的偶聯(lián)不僅可以實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)的靶向成像功能，還有可能在一定程度上提高基于量子點(diǎn)分析方法的檢測靈敏度。

目前有關(guān)量子點(diǎn)免疫探針的制備主要基于兩種策略，（1）非共價(jià)偶聯(lián)方式。其中應(yīng)用最多的是鏈霉親和素－－生物素系統(tǒng)，即將生物素化抗體與鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)非共價(jià)偶聯(lián)。其特點(diǎn)是操作簡單易行，偶聯(lián)反應(yīng)的特異性強(qiáng)，偶聯(lián)效率高，產(chǎn)物的穩(wěn)定性好，可實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測。但在活體標(biāo)記研究中，要先在體外實(shí)現(xiàn)生物素化抗體與鏈霉親和素標(biāo)記分子的非共價(jià)連接，然后將偶聯(lián)產(chǎn)物送入體內(nèi)。通常，一分子鏈霉親和素可以結(jié)合四分子的生物素，結(jié)果產(chǎn)生分子量很大的偶聯(lián)產(chǎn)物，導(dǎo)致在體內(nèi)組織間的滲透力較差，直接降低了標(biāo)記效果［11］。所以，鏈霉親和素－－生物素系統(tǒng)在體內(nèi)應(yīng)用尚存在一定的局限性。（2）共價(jià)偶聯(lián)方式：即通過共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，使量子點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子間通過酰胺鍵形成復(fù)合物。雖然其偶聯(lián)效率稍低于生物素反應(yīng)系統(tǒng)，但由于抗體與量子點(diǎn)間結(jié)合牢固，因而在體內(nèi)示蹤、動(dòng)態(tài)監(jiān)測研究中更為有效。本研究為使偶聯(lián)產(chǎn)物具有更為廣泛的應(yīng)用可能性，采用了EDC和NHS介導(dǎo)的共價(jià)偶聯(lián)方式，實(shí)現(xiàn)了單克隆抗體ND－1與量子點(diǎn)的有效偶聯(lián)，體外實(shí)驗(yàn)表明偶聯(lián)產(chǎn)物具有特異性靶向結(jié)合能力和優(yōu)良的熒光特性。

在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，我們對量子點(diǎn)和抗體蛋白的摩爾比例進(jìn)行了優(yōu)化。有研究表明［9］，用量子點(diǎn)進(jìn)行熒光標(biāo)記時(shí)，量子點(diǎn)與蛋白分子間形成單價(jià)結(jié)合的偶聯(lián)產(chǎn)物利于成像及信號檢測。但在偶聯(lián)反應(yīng)中，一個(gè)量子點(diǎn)表面可以共價(jià)結(jié)合多個(gè)蛋白分子，其結(jié)果是結(jié)合在一個(gè)量子點(diǎn)上的蛋白分子越多，形成的量子點(diǎn)探針的空間粒徑越大，由于空間位阻的存在，能夠真正結(jié)合在抗原或者說細(xì)胞表面的探針數(shù)量反而在減少，從量子點(diǎn)熒光信號的角度來看，可以檢測到的熒光信號在下降。因此，調(diào)整量子點(diǎn)與蛋白抗體的摩爾比例，實(shí)際上是調(diào)控一個(gè)量子點(diǎn)可以結(jié)合的蛋白分子數(shù)量，從而獲得更好的特異性熒光成像?；谶@一考慮，本研究在保證一定抗體－量子點(diǎn)偶聯(lián)率的前提下，選取了抗體比例相對較低的偶聯(lián)條件，獲得了特異性強(qiáng)、靈敏度高的的靶向熒光圖像，這為該量子點(diǎn)探針的實(shí)際應(yīng)用及進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)靶向成像研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］Bystrom P，Berglund A，Nygren P，et al．Evaluation of predictive markers for patients with advanced colorectal cancer．Acta Oncol，2012，51（7）：849－859

［2］Imianitov EN．Molecular diagnostics in oncology．Vopor Onkol，2012，58（2）：153－163

［3］莫志成，宋今丹．腫瘤相關(guān)抗原LEA與CEA在大腸癌表達(dá)的對比研究．中國腫瘤臨床，1999，26（7）：511－513

［4］Ronald B，Song JD，Elizabeth S，et al．Characterization of a new monoclonal antibody to a cell surface antigen on colorectal cancer and fetal gut tissues．Cancer，1986，57（3）：433－440

［5］Bruchez JM．Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels．Science，1998，281（5385）：2013－2016

［6］Jaiswal JK，Goldmen ER，Mattoussi H，et al．Use of quantum dots for live cell imaging．Nat Methods，2004，1（1）：73－78

［7］Valizadeh A，Mikaeili H，Zarghami N，et al．Quantum dots：synthesis，bioapplications，and toxicity．Nanoscales Res Lett，2012 ，7（1）：480－494

［8］呂蔡，張杰，龐代文等．量子點(diǎn)熒光技術(shù)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中HSP的應(yīng)用研究．中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2006，15（5）：513－516

［9］Mark H ，Hao LW ，Sujiet P，et al．Monovalent，reduced－size quantum dots for imaging receptors on living cells．Nat Methods，2008，5（5）：397－399

［10］曾慶輝，張友林，杜創(chuàng)等．CdTe／CdS核殼量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記．高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（6）：1158－1161

［11］Tracy RD，Ezequiel B，JoséA．R，et al．The transferrin receptor and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer．Biochim et Biophys Acta，2012，1820（3）：291－317