三種不同嚴重程度大鼠重癥胰腺炎模型比較研究

袁　琳，周秉舵，王曉素，吳中華，孔　婧，徐亭亭，

王宏偉2，朱生樑2，方盛泉2，周　莉2，劉春芳2，張秀蓮2，王　軼2

(1.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上?！?01203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院消化科，上?！?00437)

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三種不同嚴重程度大鼠重癥胰腺炎模型比較研究

袁琳1，周秉舵2，王曉素2，吳中華1，孔婧2，徐亭亭2，

王宏偉2，朱生樑2，方盛泉2，周莉2，劉春芳2，張秀蓮2，王軼2

(1.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院消化科，上海200437)

【摘要】目的為研究者選擇合適的?；悄懰徕c濃度來制備大鼠重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)SAP模型提供依據。方法將60只SD大鼠隨機分為假手術組、1.5%濃度組、3.5%濃度組和5%濃度組，造模各組分別用1.5%、3.5%和5%?；悄懰徕c按逆行膽胰管注射法制備SAP模型。術后統(tǒng)計各組大鼠的死亡率；檢測血清淀粉酶、腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、白介素-6( IL-6)水平；觀測各組大鼠胰腺組織HE染色病理評分。 結果 5%濃度組死亡率較1.5%濃度組顯著升高，血淀粉酶、腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、白介素-6( IL-6)水平、出血和腺泡組織壞死的病理評分較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高。 結論 5%的牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射法能更好的制備SAP模型，且更符合SAP的生理、病理表現。

【關鍵詞】重癥胰腺炎；逆行膽胰管注射法；牛磺膽酸鈉；模型，動物

重癥胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 動物模型的制備對于SAP的研究至關重要，目前最常用的制備方法為逆行膽胰管注射法。其制備試劑?；悄懰徕c最常用的濃度為1.5%、3.5%和5%，制備模型時不同濃度的選擇常常給研究者帶來疑問，基于此，試通過本研究比較了三個不同濃度下逆行膽胰管注射法制備大鼠SAP，以期為研究者選擇合適的牛磺膽酸鈉濃度來制備SAP大鼠模型提供依據。

1材料和方法

1.1動物

60只清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體重260～280 g。由中國科學院上海斯萊克實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2010-0017】。實驗大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心【SYXK (滬)2009-0069】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2藥品和試劑

?；悄懰徕c(美國Sigma公司，批號 CAS145-42-6)；戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號 WS20051129)；TNF-α(上海森雄科技實業(yè)有限公司，批號SXB004)；IL-6 ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司，批號SX01165)

1.3主要儀器

酶標儀(BioRAD，model 680)；自動生化檢測儀 ( Olympus，Au560)；自動脫水機(Leica，TP1020)；自動包埋機(Leica，EG1160)；顯微鏡(OLYMPUS， BX50)；全自動顯微鏡照相裝置( Olympus，PM30-35DX2)；微量注射泵(浙江醫(yī)藥公司，WZ-50C2)。

1.4實驗方法

1.4.1造模方法 將60只大鼠隨機分為假手術組(n=15)，1.5%濃度組(n=15)，3.5%濃度組(n=15)，5%濃度組(n=15)。參照逆行膽胰管注射法制備重癥胰腺炎模型。2%戊巴比妥0.2 mL/100g腹腔麻醉，固定、備皮，消毒。沿腹白線正中切口約1.5 cm，暴露腹腔，持彎鑷子尋找十二指腸(位于右側腹腔深部，被肝葉覆蓋)。雙手持鑷輕拉腸段，充分暴露胰腺，見胰腺被小腸呈C型包繞，膽胰管為乳白色，開口于十二指腸，呈一白色光點。用動脈夾阻斷膽胰管入肝門處，左手中指墊紗布，拇指與食指夾持胰頭部，用5.5號頭皮針沿白色光點處緩慢穿刺膽胰管。用微量泵以12 mL/h的速度，1 mL/kg的劑量，各組分別持續(xù)勻速輸入1.5%、3.5%和5%的?；悄懰徕c，注完后繼續(xù)維持壓力3 min。去動脈夾，觀察胰體和胰尾部情況，可見胰腺有明顯出血點和水腫，逐層縫合肌層和皮膚。術后，于所有實驗動物左右后肢皮下各注射生理鹽水10 mL/kg,均禁食不禁水。假手術組僅開腹、翻轉胰腺后關腹。

1.4.2檢測項目與方法 各組大鼠于術后24 h麻醉后開腹，腹主動脈取血3～5 mL, 分離血清，檢測淀粉酶( Amy)，采用 ELISA 法測定血清腫瘤壞死因子-α( TNF-α)、白介素-6( IL-6)；靠近十二指腸壺腹部取1 cm×1 cm胰腺組織，用10%的甲醛固定，脫水、透明與浸蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅( HE) 染色后光鏡下觀察病理組織形態(tài)。

1.5統(tǒng)計學方法 數據均采用 SPSS 17.0

2結果

2.1大鼠死亡率比較

手術各組大鼠術后均出現萎靡不振，皮毛豎立等表現，以5%濃度組為甚，假手術組麻醉蘇醒后表現無異常。假手術組大鼠死亡1只，考慮為麻醉意外。1.5%濃度組死亡1只，3.5%濃度組死亡2只，5%濃度組死亡4只。5%濃度組死亡率較1.5%濃度組顯著升高(P< 0.05)(表1)。

表1　大鼠死亡率比較

注：與假手術組比，*P< 0.05；與1.5%濃度組比，#P< 0.05。

Note:*P< 0.05 vs. Sham operated group;#P< 0.05 vs. Group of 1.5% in concentration.

表2　各組血淀粉酶、TNF-α、IL-6 水平比較

注：與假手術組比，*P< 0.05；與1.5%濃度組比，#P< 0.05；與3.5%濃度組比，△P< 0.05。

Note:*P< 0.05 vs. Sham operated group;#P< 0.05 vs. Group of 1.5% in concentration;△P< 0.05 vs. Group of 3.5% in concentration.

表3　各組胰腺組織評分比較

注：與假手術組比，*P< 0.05；與1.5%濃度組比，#P< 0.05；與3.5%濃度組比，△P< 0.05。

Note:*P< 0.05 vs. Sham operated group;#P< 0.05 vs. Group of 1.5% in concentration;△P< 0.05 vs. Group of 3.5% in concentration.

2.2生化指標檢測結果

各濃度組血淀粉酶水平較假手術組顯著升高(P< 0.05)，5%濃度組較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高(P< 0.05)；各濃度組TNF-α水平較假手術組顯著升高(P< 0.05)，5%濃度組較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高(P< 0.05)；各濃度組IL-6水平較假手術組顯著升高(P< 0.05)，5%濃度組較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高(P< 0.05)。1.5%濃度組和3.5%濃度組的各實驗室檢查比較均未見明顯差異(P> 0.05)(表2)。

2.3組織病理學觀察結果

各濃度組胰腺組織水腫、炎癥浸潤、出血、腺泡壞死的組織評分較假手術組均有明顯升高(P< 0.05)；在出血和腺泡組織壞死方面，5%濃度組較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高(P< 0.05)；1.5%濃度組和3.5%濃度組的胰腺組織水腫、炎癥浸潤、出血、腺泡壞死的組織評分未見明顯差異(P> 0.05)(表3,彩插8圖1)。

3討論

SAP的造模方法分為非侵入型和侵入型兩種。常見的非侵入型制備方法包括飼喂法、雨蛙素(caerulein,CAE)注射法、L-精氨酸注射法[1-2]。飼喂法指給造模動物喂食無膽鹽乙硫氨酸 (choline deficient ethionine supplemental，CDE)而誘發(fā)SAP。1992年Niederau 等[3]給雌性小鼠服CDE誘發(fā)出SAP。CAE注射法指給造模動物注射雨蛙素而誘發(fā)的胰腺炎。此法有損傷較小，操作較簡便,可重復性好，給藥方式多樣(皮下注射、肌肉注射、靜脈輸注、腹腔注射)等諸多優(yōu)點，主要用于水腫型胰腺炎發(fā)病機理的研究。L-精氨酸注射法多指腹腔多次注射L-精氨酸而誘發(fā)SAP。此法操作簡便、價錢便宜、感染機會少等，缺點是成活率偏低。

侵入型制備方法主要有電針刺激法、結扎法和逆行膽胰管注射法。電針刺激法可較好的模擬膽源性胰腺炎，但操作較復雜，可重復性較差，成活率偏低。結扎法有十二指腸閉襻法和膽總管結扎法兩種。1975年Nevalainen[4]報道十二指腸閉襻法，即結扎膽總管開口遠近各1cm的十二指腸，使十二指腸腔內壓力增高,致膽汁返流入胰管引起胰腺炎。此法與臨床常見的急性膽源性胰腺炎類似，雖然操作簡單，但易引起感染，也影響腸道的正常生理功能。王廣義等[5]將膽總管結扎法改進為膽總管末端結扎法，結果呈現典型急性胰腺炎的征象，缺點是實驗動物的死亡率較高，可重復性較差。1980年Aho[6]首次采用切開大鼠十二指腸前壁，經十二指腸乳頭插入塑料管，向胰膽管內逆行注射5%?；悄懰徕c，制備成急性出血壞死性胰腺炎(acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis，AHNP)模型,稱為膽胰管逆行注射法，或者稱為逆行膽胰管注射法(retrograde injection into the biliopancreatic duct)。Zhang[7]等用0.1 mL/100 g ,3.5%牛磺膽酸鈉逆行注射膽胰管也成功建立小鼠 SAP 模型。此法效果確切，在病因、致病機制及病變等方面與臨床SAP相似，且誘發(fā)成功率高，有很好的重復性，因此是目前被證明的最有效的SAP研究的動物模型。

逆行膽胰管注射法的造模過程需經過麻醉、備皮、消毒、開腹、尋找胰腺、夾閉膽胰管、穿刺及注射、關腹這8個步驟。其中關鍵部分和難點為“尋找胰腺”和“逆行膽胰管穿刺”兩方面。對于“尋找胰腺”，首先要明確大鼠胰腺的解剖位置，其胰腺組織被小腸組織包圍呈C型。故較容易由胃而找到小腸，從而由C型小腸包繞的位置找到胰腺組織。對于“逆行膽胰管穿刺”，涉及到選擇“穿刺器具”和“穿刺點”兩個方面。 對于“穿刺器具”，最常用的是頭皮針和BD套管針。頭皮針的優(yōu)點價格便宜，而BD套管針其優(yōu)點是進針后，可以拔出針芯，繼續(xù)進針，減少膽胰管的損傷。從課題組的長期實踐來看，BD套管針在拔出針芯再進針的過程中，可能有兩個問題。其一，因為動作繁瑣而增加了手術時間，增加了大鼠感染機會，增加了胰腺組織額外損傷的可能。其二，再次進針時，因為針芯已退出，此時的進針依靠針芯外側的塑料套管，因摩擦或者韌性不足，可能加重膽胰管的損傷，甚至因用力進針可能會出現胰腺組織的撕裂等意外情況。因此本次研究，課題組采用了5.5號頭皮針，從而減少手術時間，簡化流程，減少胰腺及大鼠的額外損傷。其次是“穿刺點”的選擇，“穿刺點”可以選擇的兩個地方分別是穿過胰腺組織的膽胰管上和膽胰管入十二指腸處。對于在穿過胰腺組織膽胰管上進針，存在增加胰腺組織額外損傷和難以刺入膽胰管兩個問題。因此本課題組穿刺點選在膽胰管入十二指腸處，此處相對容易進入膽胰管，又可減少胰腺的額外損傷。但要注意盡量靠近胰腺組織，減少十二指腸的穿刺。

文獻記載最多的?；悄懰徕c注射濃度分別為1.5%、3.5%、5%[6-8]。研究結果表明，三種濃度均在不同程度上制備SAP模型。從死亡率的角度看，5%濃度組與臨床中死亡率相近。從實驗室結果看， 5%濃度組血淀粉酶、TNF-α水平、IL-6水平較1.5%、濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高，而1.5%濃度組和3.5%濃度組之間的上述檢查比較均未見明顯差異。在病理評分的四個方面里，出血和腺泡組織壞死方面，5%濃度組較1.5%濃度組和3.5%濃度組均有顯著升高，1.5%濃度組和3.5%濃度組的胰腺組織水腫、炎癥浸潤、出血、腺泡壞死的組織評分未見明顯差異。以上結果說明5%的牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射法能更好的制備SAP模型，且更符合SAP的生理、病理表現。

參考文獻：

[1]Liang HY, Chen T, Wang T,etal. Time course of intestinal barrier function injury in a sodium taurocholate-induced severe acute pancreatitis in rat model[J]. J Dig Dis,2014,15(7):386-393.

[2]周秉舵，朱生樑，馬淑穎，等. 急性胰腺炎動物模型的研究進展[J]. 中國實驗動物學志,2006,16(7):442-446.

[3]Niederau C, Luthen R, Niederau MC,etal.Acute experimental bemorchagic-necrotizing pancreatitis induced by feeding acholine-deficient,ethionine-supplemented diet:methodology and standards[J]. Eur Surg Res,1992,24(1):40-54.

[4]Nevalainen TJ. Acute pancreatitis caused by closed by closed duodenal loop in the rat[J]. Scand J Gasteroent,1975,10(5):521-527.

[5]王廣義，劉銅軍，尹為民，等. 三種實驗型急性胰腺炎動物模型比較[J].中華實驗外科雜志，1995，12(1)：56.

[6]Aho HJ, Koskensalo SM, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis[J]. Scand J Gastroenterol,1980,15(4):411-416.

[7]Zhang XP, Ye Q, Jiang XG,etal.Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis[J]. World J Gastroenterol,2007,13(34)4566-4573.

[8]余夙慧，康牧星，孫洪偉，等.SIRS發(fā)展在胰腺壞死、繼發(fā)感染致胰腺炎病變加重中的作用[J].肝膽外科雜志，2014,26(1)：43-47.

〔修回日期〕2015-04-21

研究報告

Comparative study of severe acute pancreatitis model in rats with three different severity

YUAN Lin1，ZHOU Bing-duo2，WANG Xiao-su2，WU Zhong-hua1，KONG Jing2，XU Ting-ting2，WANG Hong-wei2，

ZHU Sheng-liang2，FANG Sheng-quan2，ZHOU Li2，LIU Chun-fang2，ZHANG Xiu-lian2，WANG Yi2

(1.Shanghai University of T.C.M Experiment Center for Science and Technology, Shanghai 201203,China；

2.Department of Gastroenterology, Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200437,China)

【Abstract】Objectiveto provide the evidence for inducing the SAP model in rats with proper concentration of sodium taurocholate. Methods 60 SD rats were divided into sham operated group, group of 1.5% in concentration, group of 3.5% in concentration and group of 5% in concentration randomly, while the SAP model was induced by the sodium taurocholate concentration of 1.5%,3.5% and 5% with the method of retrograde injection into the biliopancreatic duct.To calculate the mortality of different groups, measure the serum amylase, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6 (IL-6),and to observe the pancreatic pathological scores of HE staining in rats. ResultsThe mortality in group of 5% in concentration has a significant ascending compared with group of 1.5% in concentration, while the serum amylase, tumor necrosis factor-α(TNF-α) , interleukin-6( IL-6), pathological score of hemorrhage and acinar necrosis in group of 5% in concentration have a significant ascending compared with group of 1.5% in concentration and group of 3.5% in concentration. ConclusionsA better SAP model may be induced by sodium taurocholate with the concentration of 5% by the method of retrograde injection into the biliopancreatic duct, which may accord with the physiological and pathological manifestation of SAP.

【Key words】Severe acute pancreatitis；The method of retrograde injection into the biliopancreatic duct；Sodium taurocholate；Model，animal

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.005

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0020-04

[通訊作者]周秉舵(1978-)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：胰腺疾病研究。E-mail： tcmzbd@hotmail.com。

[作者簡介]袁琳(1980-)，女，博士生，助理研究員，研究方向：中西醫(yī)結合實驗研究。

[基金項目]國家自然科學基金青年基金(81302929)；上海市教委科研創(chuàng)新項目(14YZ065)；上海市杏林新星計劃(ZYSNXD011-RC-XLXX-20130019)。