親代三丁基錫暴露對F1代KM小鼠血常規(guī)的影響

尹玉偉，孫 平，孫 杰，王書文，張紀亮，熊建利

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽　471003)

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親代三丁基錫暴露對F1代KM小鼠血常規(guī)的影響

尹玉偉，孫 平，孫 杰，王書文，張紀亮，熊建利

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽471003)

【摘要】目的 探討親代三丁基錫暴露對F1昆明小鼠血常規(guī)的影響。方法將雌、雄各40只小鼠隨機分別分為空、低、中、高濃度組(0、0.2、2和20 μg/kg)，每天進行染毒，持續(xù)45 d。在第60天時，將同濃度組的雌:雄鼠按1:1進行同籠配種。仔鼠出生60 d后取血，進行血常規(guī)的檢測。結(jié)果與對照組相比，F(xiàn)1代雄性低濃度和高濃度組的紅細胞數(shù)量和血紅蛋白量顯著增加(P < 0.01)；F1代雄性低濃度組紅細胞體積、平均血紅蛋白含量(P < 0.01)和淋巴細胞絕對值(P < 0.05)顯著降低；F1代雌性高濃度組的紅細胞數(shù)量顯著增加(P < 0.01), F1代雌性小鼠的血紅蛋白量、紅細胞壓積、血小板量三項指標隨著TBT濃度的增加呈劑量依賴性。結(jié)論親代TBT暴露影響F1代小鼠的血常規(guī)，且低濃度時對F1代雄性小鼠的影響最大，高濃度時對F1代雌性小鼠的影響最大。

【關鍵詞】三丁基錫；小鼠；血常規(guī)指標

有機錫因具有良好的殺菌滅藻以及防止軟體海洋生物附著于船體的功能而被廣泛用于船體和海洋建筑表面，但防污的同時它對海洋環(huán)境和海洋動物造成嚴重的影響[1]，三丁基錫(tributyltin，TBT)被認為是迄今為止由人為因素大量進入海水環(huán)境的最毒的化學品之一[2]。目前在海水[3-4]、底泥[5-7]、紡織品[8-9]和尿樣[10]中均發(fā)現(xiàn)有機錫化合物的存在。海洋生物對TBT有很強的富集能力，使TBT通過食物鏈進入人體，對人類的健康構成潛在威脅[11]。駱煥榮等[12]的研究表明，人TBT急性中毒時表現(xiàn)出嚴重的胃腸系統(tǒng)毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和腎臟毒性。近年來報道，TBT不僅具有急性毒性，還具有遺傳毒性、免疫毒性和環(huán)境內(nèi)分泌干擾毒性[13]。D.阿那尼等[14]的研究表明，氯化二丁基錫對雌性小鼠有生殖毒性，在劑量≥0.05 μg/kg作用下，母鼠食欲不振，體重下降，陰道、子宮萎縮，懷胎數(shù)下降等。鑒于TBT的廣泛地毒性，人們對其致毒機制進行深入的探究。

血液在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上起著重要的作用，具有運輸、緩沖、營養(yǎng)和防御等功能[15]。劉鳳軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠鉬中毒時，嚴重影響小鼠的血常規(guī)。呂良炬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，對家兔分別進行0.03、0.3、3 mg/kg TBT和TBT的急性注射實驗，觀察到TBT和TBT導致家兔的心率和動脈血壓產(chǎn)生劑量依賴性的下降。張朝紅等[18]的研究表明，TBT與牛血清白蛋有明顯的相互作用，且程度和方式與濃度、酸度和有機溶劑等因素有關。然而親代TBT攻毒對子代小鼠血常規(guī)的影響尚未知，鑒于此，本實驗以不同濃度的TBT暴露親代小鼠，研究對子代小鼠血常規(guī)產(chǎn)生的影響。

1材料和方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑與配制方法

TBT(純度 ≥ 97%，F(xiàn)luka公司，4℃保存)，西王玉米胚芽油(山東西王食品有限公司)。

TBT母液配制：a．配180 μg/mL濃度的母液：用移液槍取10850 μL的玉米油裝入棕色廣口瓶中，在用移液槍取1.6 μLTBT注入該瓶中，混勻，即得到母液；b．用鋁箔紙將其全封住，放入4℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2主要儀器

電子天平(10200-3-G)(沈陽龍騰電子有限公司)；不同量程的微量移液槍若干(鄭州鼎國生物技術有限公司)；XF9080A動物血液自動分析儀(南京皓海儀器)。

1.2實驗動物

清潔級，4～5周KM小鼠，體重16～18 g，雌、雄各40只，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料，購于河南省實驗動物中心【SCXK(豫)2010-0002】,飼養(yǎng)于洛陽普萊柯生物實驗動物屏障系統(tǒng)【SYXK(豫)2013-0003】。12 h循環(huán)光照，室溫(23±2)℃，恒定濕度，自由飲食。并按實驗動物的3R原則，給予人道關懷。

1.3實驗方法

1.3.1親代(F0代)TBT暴露

F0代TBT暴露，將80只小鼠隨機分成8組(♂：4組；♀：4組)，每組10只，分別飼喂玉米油對照組(CK組)，0.2 μg/kg TBT低濃度組(LTBT組)，2 μg/kg TBT中濃度組(MTBT組)和20 μg/kg TBT高濃度組(HTBT組)。將TBT母液稀釋注入質(zhì)量為2 g左右的長條狀胡蘿卜中，每天上午定時飼喂小鼠，對照組飼喂含玉米油的胡蘿卜，每天中午進行檢查，對已經(jīng)吃完胡蘿卜的小鼠，在料槽中添加全價飼料，沒有吃完的等到吃完后再進行添加。每3 d稱重一次并記錄，計算下一次用藥量。暴露持續(xù)45 d。

1.3.2子代(F1代)小鼠血樣采集

F0代暴露結(jié)束后的第10天時，將同濃度組的雌:雄鼠按1∶1進行同籠配種。仔鼠在出生后到達20日齡左右，斷奶并將雌、雄分籠飼養(yǎng)。F1代子鼠到達60日齡時，F(xiàn)1代小鼠體重在40～45 g，每一濃度組隨機取出雌、雄小鼠各6只進行摘眼球取血，對血樣進行常規(guī)檢查包括以下項目：紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)、紅細胞體積分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、白細胞數(shù)(WBC)、淋巴細胞百分比(LYM)、淋巴細胞絕對值(LYMPH)、大型血小板比率(P-LCR)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板(PLT)。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和兩兩比較(LSD)，P< 0.05為顯著，P< 0.01為極顯著。

2結(jié)果

2.1親代TBT暴露對F1代雄性血常規(guī)的影響

如表1所示：與對照組相比：LTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高顯著(P< 0.05)、MCV降低極顯著(P< 0.01)、MHC降低極顯著(P< 0.01)、RDW-SD降低極顯著(P< 0.01)、LYMPH降低顯著(P< 0.05)、P-LCR降低極顯著(P< 0.01)、PDW減小極顯著(P< 0.01)、MPV縮小極顯著(P< 0.01)；MTBT組在RDW-SD降低極顯著(P< 0.01)、P-LCR降低顯著(P< 0.05)；HTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高顯著(P< 0.05)、RDW-SD降低顯著(P< 0.01)、P-LCR降低極顯著(P< 0.01)、PDW減少極顯著(P< 0.01)、MPV縮小極顯著(P< 0.01)。

2.2親代TBT攻毒對F1代雌性血常規(guī)

如表2所示：與對照組相比，LTBT組在HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、PLT數(shù)目增加顯著(P< 0.05)；MTBT組在HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、RDW-SD升高極顯著(P< 0.01)、RDW-CV升高極顯著(P< 0.01)、PLT數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、MCHC指標顯著降低(P< 0.05)；HTBT組在RBC數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、HGB含量升高極顯著(P< 0.01)、HCT升高極顯著(P< 0.01)、RDW-SD升高極顯著(P< 0.01)、RDW-CV升高顯著(P< 0.05)、PLT數(shù)目增多極顯著(P< 0.01)、MCHC指標顯著降低(P< 0.05)。

在F1代雌性血常規(guī)中，隨著對親代暴露TBT劑量的增高，部分血常規(guī)指標存在一定的劑量效應。隨著TBT濃度的增高：HGB含量、HCT含量、PLT數(shù)量呈現(xiàn)劑量依賴性增加；MCHC指標呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，但是TBT組都低于CK組；RDW-SD指標、RDW-CV指標呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但是TBT組都高于CK組。

表1　親代三丁基錫攻毒對子代雄性血常規(guī)的影響

注：同行數(shù)據(jù)與CK組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the CK group in the same line data，*P< 0.05，**P< 0.01.

表2　親代三丁基錫攻毒對子代雌性血常規(guī)的影響

注：同行數(shù)據(jù)與CK組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the CK group in the same line data，*P< 0.05，**P< 0.01.

3討論

近期大量研究表明，環(huán)境重金屬(包括有機錫)能夠?qū)游锏难涸斐蓢乐赜绊?，而且環(huán)境重金屬暴露與肥胖有關[19-20]。Grün F等[21]在2007年提出“環(huán)境致肥因子”的概念，提出的第一批候選致肥因子，有機錫包括在內(nèi)。WhaIen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，人體暴露于DBT、TBT和苯基錫后會削弱NK細胞殺死腫瘤的功能，導致人體NK細胞的功能產(chǎn)生不可逆的抑制作用，從而影響機體的免疫力。孔皓等[23]研究了三苯基錫對大鼠肥胖發(fā)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一定劑量的三苯基錫對大鼠有致肥作用，但是隨著濃度的改變，對雄性大鼠的致肥作用減弱，而對雌性大鼠各項指標影響不明顯。通過對親代的體重記錄，分析后發(fā)現(xiàn)三丁基錫暴露后，對雌雄小鼠的體重的影響不一致，雌性中劑量組小鼠的體重顯著抑制，雄性低劑量組小鼠體重顯著促進。

胎盤是胎兒發(fā)育過程中重要的臨時性器官。胎兒發(fā)育過程中各種營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和代謝廢物排出都通過胎盤實現(xiàn)[15]。研究證實有機鉛、有機鎘、有機汞等都能通過胎盤屏障，特別是鉛，可在整個妊娠時期通過胎盤[24]，而錫作為鉛的同族元素，作用機理可能與之相似。TBT通過胎盤后，會對子代產(chǎn)生一定的影響。

血液是循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，參與機體的新陳代謝，所以血常規(guī)的檢查不管是在臨床還是科研都有很重要的意義。研究表明，各種重金屬急性中毒時，會嚴重損傷動物的血液系統(tǒng)[12,15,25]，而親代實驗動物慢性攻毒對子代血常規(guī)影響的報道甚少。紅細胞的各項指標的改變直接影響機體的氧化功能和免疫功能[15]，在本實驗中，與對照組相比，盡管F1代雄性TBT組的RBC明顯增加，HGB也明顯增加，但LTBT組的MCV明顯縮小，且MCH也明顯降低，然而MTBT組與HTBT組的MCV和MCH指標無顯著變化，這些結(jié)果都暗示紅細胞的運輸功能有所降低。與對照組相比，F(xiàn)1代雌性TBT組HGB顯著增加，但MCV與MCH都無顯著差異這暗示紅細胞的運氧能力并未下降。紅細胞運氧能力的下降會使得機體的氧化反應速度下降，從而增加脂肪的積累的趨勢。除了血常規(guī)之外，我們還記錄了F1代小鼠發(fā)育過程中的體重數(shù)據(jù)，結(jié)果和我們預測的一樣，雄性LTBT組體重增加顯顯著，其他組體重增加不顯著，對于其中的一些機制，我們正在做進一步的研究。

白細胞具有滲出、趨化、吞噬和分泌等生理特性主要是執(zhí)行防御功能。淋巴細胞主要參與機體的特異性免疫反應[15]。在本實驗中，與對照組相比，F(xiàn)1代雄性TBT組的WBC和LYM差異不顯著，而LTBT組LYMPH指標顯著降低，MTBT組和HTBT組的LYMPH指標無顯著差異，這暗示著TBT可能影響小鼠的免疫功能；與對照組相比，F(xiàn)1代雌性TBT組的WBC、LYM和LYMPH均無顯著差異。

血小板是從骨髓中成熟的巨核細胞胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物活性的細胞質(zhì)碎塊，形狀不規(guī)則，沒有細胞核，體積較小，主要功能參與凝血、生理性止血和保持血管內(nèi)皮的完整性[15]。本實驗中，與對照組相比，F(xiàn)1代雄性TBT組的P-LCR顯著降低，但是對PLT卻無顯著差異；F1代雌性TBT組的PLT指標隨著TBT濃度的增高呈劑量依賴增加，其他指標無顯著差異，所以初步推斷，TBT可能會影響巨核細胞裂解細胞質(zhì)的大小。

綜上所述不同濃度的TBT暴露親代小鼠時，會影響F1代小鼠的血常規(guī)，且低濃度時對F1代雄性影響最大，高濃度時對F1代雌性影響最大。

致謝：感謝河南科技大學動物科技學院韓坤、孫偉杰和孫原野同學的大力幫助。感謝洛陽普萊柯生物實驗動物中心對實驗動物的管理和飼養(yǎng)。

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〔修回日期〕2015-04-10

研究報告

Effects of parents exposure to tributyltin(TBT)on blood

routine of F1 generation KM mice

YIN Yu-wei，SUN Ping，SUN Jie，WANG Shu-wen，ZHANG Ji-liang，XIONG Jian-li

(Animal Science and Technology College，Henan University of Science and Technology，Henan Luoyang 471003，China)

【Abstract】Objective To explore effects of parents exposure to TBT on blood routine of F1 generation mice. Methods 80 mice including 40 males and 40 females, were randomly divided into control groups (CK) , low dose groups (LTBT), middle dose groups (MTBT) and high dose groups (HTBT). They were given dose of TBT (0，0.2，2，20μg/kg) every day. The experiment lasted 45 days. At 60 days, one female and one male of the same concentration were bred in the same cage according to 1∶1. At postnatal day 60, blood was collected for the determination of blood routine. ResultsCompared with control group, the number of red blood cells and hemoglobin of F1 generation male mice in LTBT and HTBT groups were significantly increased (P < 0.01); Red blood cell volume, mean corpuscular hemoglobin (P < 0.01), and the lymphocyte absolute value in F1 generation male LTBT were significantly reduced (P < 0.05); HTBT of female mice were significantly increased about the number of red blood cells (P < 0.01). A dose-dependent increase of the hemoglobin, red blood cells, and platelet count of F1 generation female experimental groups was observed. Conclusion Parental TBT exposure affects the F1 mice blood routine. There is the greatest influence on LTBT in F1 generation male mice and on HTBT in F1 generation female mice.

【Key words】Tributyltin；Mice；Blood routine examination

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.010

【中圖分類號】R332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 05-0042-05

[通訊作者]孫平(1975-)，男，博士，副教授，研究方向：動物生態(tài)。E-mail： pingsunny@msn.com。

[作者簡介]尹玉偉(1992-)，男，本科生，動物醫(yī)學。

[基金項目]河南科技大學SRTP項目(2014264)。