香梨樹(shù)腐爛病菌分生孢子獲取方法及萌發(fā)條件的研究

唐俊煜 王延芳 李春燕 茍 巧 謝 新 張王斌，2*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

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香梨樹(shù)腐爛病菌分生孢子獲取方法及萌發(fā)條件的研究

唐俊煜1王延芳1李春燕1茍 巧1謝 新1張王斌1，2*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

【目的】分生孢子在樹(shù)木腐爛病菌傳播過(guò)程中起著極其重要的作用，是進(jìn)行病原菌研究的重要實(shí)驗(yàn)材料，獲得形態(tài)和萌發(fā)率一致的分生孢子尤為重要。【方法】本研究采用不同方法獲得病菌的分生孢子，置于不同環(huán)境條件下，測(cè)定其萌發(fā)率篩選最優(yōu)獲取方法和萌發(fā)條件。【結(jié)果】田間采集發(fā)病組織獲得分生孢子較為容易但易被污染；接種發(fā)病枝條和30 %PBA培養(yǎng)基15d左右均可獲得形態(tài)一致和萌發(fā)率較為一致的分生孢子?！窘Y(jié)論】病菌分生孢子萌發(fā)最適溫度為25 ℃、相對(duì)濕度100 %、pH為5.0～6.0、黑暗條件并需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

庫(kù)爾勒香梨； 腐爛病菌； 分生孢子； 萌發(fā)

庫(kù)爾勒香梨是我國(guó)優(yōu)良的地方梨品種之一，已遠(yuǎn)銷(xiāo)全國(guó)各地及東南亞等世界其他國(guó)家[1]，而近幾年受天氣等因素影響，梨樹(shù)腐爛病頻繁發(fā)生，自1967年以來(lái)庫(kù)爾勒市香梨經(jīng)歷了6次腐爛病大流行，吳芳等于2011年5～8月在庫(kù)爾勒市的香梨園調(diào)查病株率達(dá)100 %[2]，該病被人們視為梨樹(shù)的“絕癥”，一旦發(fā)生就會(huì)造成大量死樹(shù)或毀園[3-5]。因進(jìn)行病原鑒定、病害流行規(guī)律、防治技術(shù)等方面的研究都需要大量且整齊度均一的分生孢子作為研究實(shí)驗(yàn)材料，然而，目前有人做過(guò)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病分生孢子獲取方法的研究[6-9]，但關(guān)于此方面研究未見(jiàn)綜合性報(bào)道 。因此本研究主要通過(guò)改變產(chǎn)孢基質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)，根據(jù)所獲分生孢子大小，形態(tài)與萌發(fā)率等指標(biāo)篩選能大量、迅速產(chǎn)孢的理想方法，并進(jìn)行分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，確定生長(zhǎng)整齊且萌發(fā)率高的最適條件。優(yōu)化產(chǎn)孢條件，篩選出合適的產(chǎn)孢基質(zhì)及生長(zhǎng)整齊的分生孢子，確定分生孢子萌發(fā)的最適條件，為梨樹(shù)腐爛病菌病原鑒定、病害流行規(guī)律、防治技術(shù)等方面的研究提供優(yōu)質(zhì)病原菌。

1 材料與方法

1.1 材料采集

1.1.1 病樣采集

采集阿拉爾周邊庫(kù)爾勒香梨樹(shù)木發(fā)病枝條或樹(shù)皮，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試菌

南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的腐爛病菌菌株，分離于阿拉爾周邊庫(kù)爾勒香梨樹(shù)木發(fā)病枝條上。實(shí)驗(yàn)前在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)4～5 d活化以備用。

1.2 分生孢子獲取方法

1.2.1 田間發(fā)病組織獲取

將帶有腐爛病菌分生孢子角的枝條或樹(shù)皮，或?qū)в蟹稚咦悠鞯臉?shù)皮置于產(chǎn)孢器中保濕培養(yǎng)，直到出現(xiàn)孢子角。挑取孢子角，將其均勻融在滅菌水，制成孢子懸浮液備用。

1.2.2 培養(yǎng)基獲取

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂10 g、水1000 ml，滅菌備用。

30 % PBA培養(yǎng)基：梨樹(shù)皮300 g、瓊脂30 g、水1000 ml，滅菌備用。

將在PDA上活化的病菌打成直徑5 mm的菌餅，分別接種于PDA平板培養(yǎng)基和30 % PBA培養(yǎng)基上，每個(gè)處理5次重復(fù)，用保鮮膜密封置于25 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 接種枝條獲取

將活化好的菌餅接種于處理好的梨樹(shù)枝條上，置于加有5 ml無(wú)菌水的250 ml三角瓶中。將三角瓶放置在25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3 分生孢子萌發(fā)條件測(cè)定方法

1.3.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

將獲得的分生孢子制成分生孢子懸浮液，高倍鏡(10×40)下每視野20～30個(gè)孢子。孢子懸浮液均勻涂在PDA平板上，設(shè)置5、10、15、20、25、30 、35和40 ℃ 8個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。分別在12 h、24 h、36 h、48 h檢查分生孢子萌發(fā)情況(檢查時(shí)取培養(yǎng)皿上均勻分布的3個(gè)點(diǎn)切成1 cm2小塊，放在載玻片上，在顯微鏡下檢查孢子萌發(fā)情況。每個(gè)小塊檢查100個(gè)孢子[10]。

1.3.2 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

用不同濃度的硫酸溶液控制80 %、90 %、95 %和100 %的空氣相對(duì)濕度，將PD液涂于滅菌的載玻片上，自然風(fēng)干，再涂上孢子懸浮液，待風(fēng)干后，置于各個(gè)不同相對(duì)濕度的環(huán)境中，3次重復(fù)，25 ℃黑暗恒溫條件下培養(yǎng)，在12 h、24 h、36 h、48 h鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。(檢查方法同1.3.1)

1.3.3 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0，將孢子懸浮液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，作3次重復(fù)，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，在12 h、24 h、36 h、48 h鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。(檢查方法同1.3.1)

1.3.4 光照條件對(duì)分生孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

孢子懸浮液均勻涂在PDA平板上，設(shè)置全光照、全黑和半光照半黑暗3個(gè)處理，每個(gè)處理作3次重復(fù)，25 ℃條件下培養(yǎng)，在6 h、12 h、18 h、24 h、30 h鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。(檢查方法同1.3.1)

1.3.5 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)分生孢子萌發(fā)影響的測(cè)定

將分生孢子懸浮液分別凃于PDA平板、水瓊脂平板和30 % PBA平板上，同1.3.1的方法做分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，在24 h、48 h、72 h鏡檢，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

分生孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)的孢子個(gè)數(shù) / 檢查的孢子總數(shù))×100%[11]

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分生孢子獲取方法比較

從田間帶有分生孢子角的發(fā)病組織可以直接獲得分生孢子?；蛘卟〔繋в蟹稚咦悠鞯牟〗M織置于保濕器內(nèi)，經(jīng)過(guò)幾十分鐘就可以獲得大量分生孢子。但是，所獲得的分生孢子在培養(yǎng)過(guò)程中易被其它雜菌污染，且分生孢子大小存在差異。

經(jīng)梨樹(shù)枝條接種腐爛病菌后3 d顯癥，14 d后在枝條上形成大量的黑色分生孢子器，部分吐出黃色卷曲的分生孢子角。在30 % PBA培養(yǎng)基上接種病菌菌餅12 d后表面產(chǎn)生凸起的分生孢子器，這兩種方法所獲得分生孢子大小基本一致，在一定時(shí)間內(nèi)萌發(fā)率均在90%以上。在PDA平板上接種梨樹(shù)腐爛病菌菌餅后，3～5 d菌落長(zhǎng)滿(mǎn)全皿，7 d后開(kāi)始凸起少量白色的產(chǎn)孢體，但直到50 d仍未獲得成熟可萌發(fā)的分生孢子(見(jiàn)表1)。

表1 分生孢子不同獲取方法比較結(jié)果

注：“-”表示白色菌絲大量生長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

2.2 分生孢子萌發(fā)條件的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

病菌分生孢子在相同的濕度、pH、營(yíng)養(yǎng)條件，黑暗下培養(yǎng)觀察(見(jiàn)表2)可知，分生孢子在15～35 ℃范圍內(nèi)經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)后均能萌發(fā)。15 ℃時(shí)經(jīng)36 h后培養(yǎng)萌發(fā)率可達(dá)16. 3 %，當(dāng)溫度達(dá)到25 ℃時(shí)僅需12 h萌發(fā)率就可達(dá)11. 3 %，但當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃時(shí)萌發(fā)所需時(shí)間較長(zhǎng)，溫度超過(guò)40 ℃時(shí)會(huì)出現(xiàn)分生孢子萌發(fā)前的變形現(xiàn)象。在25 ℃和30 ℃培養(yǎng)相同時(shí)間后，25 ℃萌發(fā)率高于同期30 ℃萌發(fā)率。因此確定25 ℃有利于分生孢子的萌發(fā)。

表2 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

注：“-”表示白色菌絲大量生長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

2.2.2 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

在pH、營(yíng)養(yǎng)一致，25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)后，由表3可得，分生孢子在相對(duì)濕度100%條件下24 h已有萌發(fā)，在相對(duì)濕度95%的條件下36 h后開(kāi)始萌發(fā)，在48 h時(shí)相對(duì)濕度為90%的條件下分生孢子有萌發(fā)前的變形現(xiàn)象，在觀察期內(nèi)相對(duì)濕度低于90%時(shí)無(wú)孢子萌發(fā)，也無(wú)萌發(fā)前的變形現(xiàn)象。

表3 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

注：“-”表示白色菌絲大量生長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

2.2.3 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

控制濕度、營(yíng)養(yǎng)一致，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)觀察，由表4可知，病菌分生孢子在酸堿度范圍為3. 0～7. 0均能萌發(fā)，pH低于2. 0和或者高于8. 0分生孢子不能萌發(fā)。分生孢子在pH為3. 0和7. 0條件下，48 h后有少量孢子萌發(fā)；pH為5. 0和6. 0時(shí)，分生孢子在12 h時(shí)萌發(fā)率可達(dá)15. 7%以上。由此可見(jiàn)該菌分生孢子在酸性條件下易萌發(fā)。PH為5. 0時(shí)分生孢子萌發(fā)率最高，因此確定該菌分生孢子的最適萌發(fā)酸堿度為pH=5. 0。

表4 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

注：“-”表示白色菌絲大量生長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

2.2.4 光照條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

病菌分生孢子在濕度、pH、營(yíng)養(yǎng)一致的條件下，由表5可知，不同光照條件對(duì)梨樹(shù)腐爛病菌分生孢子的萌發(fā)有一定的影響。且在全黑暗條件下分生孢子萌發(fā)率最高，在全光照條件下分生孢子萌發(fā)率最低。因此，全黑暗條件利于分生孢子萌發(fā)。

表5 光照條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

注：利用新復(fù)極差法，同一列進(jìn)行多重比較，不同字母表示0. 05水平上差異顯著。

2.2.5 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

由表6可知，病菌分生孢子在不同培養(yǎng)基上萌發(fā)率不同，在PDA培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，30 % PBA培養(yǎng)基次之，在水瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，說(shuō)明該菌分生孢子萌發(fā)需要一定的營(yíng)養(yǎng)條件。

表6 營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

注：“-”表示白色菌絲大量生長(zhǎng)，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)

3 結(jié)論

采集田間發(fā)病組織、梨樹(shù)枝條和30 % PBA培養(yǎng)基接種培養(yǎng)等方法均能獲得分生孢子，在PDA培養(yǎng)基上形成產(chǎn)孢體，觀察期內(nèi)未獲得分生孢子。田間發(fā)病組織采集容易、獲得分生孢子所需時(shí)間較短，但易被雜菌污染。經(jīng)梨樹(shù)枝條和30 % PBA培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，在15 d均可獲得形態(tài)較為一致，萌發(fā)率較好的分生孢子。香梨腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的最適條件為溫度25 ℃、pH 5. 0、相對(duì)濕度100 %、黑暗條件和一定的營(yíng)養(yǎng)條件。

4 討論

梨樹(shù)腐爛病菌可存活4年左右，一個(gè)病斑釋放孢子的能力可持續(xù)1年半，其分生孢子常與膠質(zhì)物一起形成孢子角，在雨后或高濕的條件下，分生孢子器及子囊殼便可釋放分生孢子，通過(guò)分生孢子傳播擴(kuò)散進(jìn)行侵染循環(huán)。在梨樹(shù)腐爛病的研究過(guò)程中需要大量且整齊度均一的分生孢子作為進(jìn)行病原鑒定、病害流行規(guī)律、防治技術(shù)等方面的實(shí)驗(yàn)原材料。因此，本實(shí)驗(yàn)采用前期研究所篩選到的產(chǎn)孢基質(zhì)，可以誘導(dǎo)病原菌快速、大量的產(chǎn)生子實(shí)體，獲得了生理狀況基本一致的分生孢子，所以在分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中保證了供試分生孢子的一致性。

在蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子獲取方法與萌發(fā)條件的研究中,本研究將周宗山[12]分生孢子獲取方法做了優(yōu)化調(diào)整，與其的結(jié)果不同之處是接種PDA培養(yǎng)基上的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌在40～45 d可獲得分生孢子角，而本研究中分生孢子器在50 d時(shí)未觀察到此現(xiàn)象，而在枝條或樹(shù)皮培養(yǎng)基上產(chǎn)孢都較為理想，這可能是由于營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的改變，加速了病菌由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的過(guò)渡時(shí)間。在臧睿[13]等人的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌分生孢子的萌發(fā)條件的研究中，各種光照處理對(duì)其分生孢子萌發(fā)無(wú)明顯影響，本實(shí)驗(yàn)中黑暗條件有利于分生孢子的萌發(fā)，其他與梨樹(shù)腐爛病分生孢子萌發(fā)條件基本一致。

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Study on Acquisition Method and Germination Condition of Conidiospore of Pear Tree Canker Pathogen

Tang Junyu1Wang Yanfang1Li Chunyan1Gou Qiao1Xie Xin1Zhang Wangbing1，2*

(1 College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

(2 Comprehensive management of Agricultural Pests in South Xinjiang Key Laboratory, Xinjiang 843300)

[Objective]Conidia plays an important role in the spread of tree canker pathogens ,and it is an major experimental material in studying rot fungi. Therefore, It is significant to gain condia with almost the same morphology and germination rate.[Methods]Pathogen conidia obtained with different methods, was placed in distinct circumstances to measure germination rate in order to select optimal acquisition method and germination conditions.[Results]It is easier to obtain conidia with which the incidence tissues directly collected from field, but it is easier polluted; Condia with consistent germination rate and morphology can be attained both in case of inoculated in disease branches and 30 % PBA culture for about 15 d.[Conclusion]The conidia germination optimum temperature is 25 ℃, relative humidity 100 %, and pH 5.0-6.0, under the dark condition and certain nutrients.

fragrant pear in korla; canker pathogen; condia; germination

2014-06-18

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201310757002)；塔里木大學(xué)校長(zhǎng)基金項(xiàng)目(TDZKSS201401)。

唐俊煜(1989-)，男，2014級(jí)在讀碩士，研究方向?yàn)楣麡?shù)優(yōu)質(zhì)高效栽培生理。E-mail：704203773@qq.com.

*為通訊作者E-mail：zwbzky@163.com

1009-0568(2014)01-0029-06

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.01.003