油松枯梢病菌分生孢子器誘導(dǎo)方法探索

暴可心，王雪菲，董亞新，張思涵，崔建州,2，李會(huì)平,2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000； 2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

油松Pinustabulaeformis為松科針葉常綠喬木，是非常重要的造林和綠化景觀植物，為中國特有樹種，廣泛分布于我國北方，因其樹干挺拔蒼勁、四季常綠、枝條開展等優(yōu)良特點(diǎn)而被選為園林綠化、荒山造林樹種[1-3]。近年來，秦皇島市聯(lián)峰山的油松枯梢病較為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為油松枝梢叢狀枯死、針葉灰白且不脫落，造成樹勢衰弱，嚴(yán)重時(shí)整株死亡[4]。李會(huì)平 等[4]已對發(fā)生在聯(lián)峰山的油松枯梢病的病原進(jìn)行了分離、鑒定，病原菌為球殼孢屬真菌Sphaeropsissapinea。該病原菌的分生孢子器為黑色球形，半埋生于松梢表皮層，分生孢子長橢圓形，單胞或多胞，淺棕色，著生在分生孢子器內(nèi)[3]。對于該病原菌的生物學(xué)特性研究、化學(xué)或生物藥劑的篩選等工作均需要大量的分生孢子器和分生孢子。如何在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下快速獲得該病原菌的分生孢子器顯得尤為重要。在誘導(dǎo)真菌孢子時(shí)，對菌絲進(jìn)行機(jī)械損傷及在菌絲中放置寄主組織段是常用的方法[5]，但通常是放入健康的寄主組織，另外，菌絲在生長過程中經(jīng)常會(huì)覆蓋寄主組織，導(dǎo)致分生孢子器不易獲取。因此，本研究在利用傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法的同時(shí)，放置已滅菌3次的發(fā)病寄主組織段作為對比，在菌絲上放置玻璃紙避免菌絲覆蓋寄主組織，并嘗試將幾種方法進(jìn)行組合，誘導(dǎo)病原菌快速產(chǎn)生大量分生孢子器，以期為后續(xù)的研究提供充足的分生孢子。

1 材料與方法

1.1 材料 油松枯梢病菌分離自秦皇島聯(lián)峰山油松枯梢病株的病梢，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實(shí)驗(yàn)室提供。松針采自秦皇島聯(lián)峰山公園生長健壯的和發(fā)病的2 a生油松。各剪取4 cm段，自來水沖洗，自然風(fēng)干后，置于培養(yǎng)皿中，加少量蒸餾水保持濕潤，121 ℃下高壓滅菌25 min，連續(xù)滅菌3次備用。

1.2 方法

1.2.1 菌絲培養(yǎng) 用打孔器在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)3 d的油松枯梢病菌邊緣打孔取菌塊，接種到新的PDA培養(yǎng)基中，在23 ℃、光照12 000 Lx的智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2 分生孢子器誘導(dǎo) 對長滿培養(yǎng)皿的油松枯梢病菌的菌絲分別進(jìn)行機(jī)械損傷(玻璃鏟刮平菌絲)、鋪玻璃紙(半透性)、放置已滅菌3次的健康或發(fā)病寄主松針等8種不同組合處理，誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子器(表1)。每種處理4個(gè)重復(fù)，共32皿，每皿放置5根松針。

1.2.3 培養(yǎng)及觀察 將經(jīng)過以上8種處理的油松枯梢病菌菌絲放在23 ℃、光照12 000 Lx的智能培養(yǎng)箱中，逐日觀察記錄松針上分生孢子器產(chǎn)生情況。分生孢子器的形態(tài)和大小用奧林巴斯SZX-16顯微鏡觀察并測量。每種處理隨機(jī)選取50個(gè)分生孢子器進(jìn)行測量、觀察。分生孢子器的成熟度用第10天每種處理下分生孢子器的大小和萌發(fā)率表示。萌發(fā)率參照李會(huì)平 等的方法，分生孢子器作為觀察單位，以分生孢子器上及邊緣長出白色菌絲作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel軟件和SPSS軟件分別整理錄入及分析數(shù)據(jù)，用LSD法(最小顯著差法)進(jìn)行方差分析(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下分生孢子器的產(chǎn)生情況 不同處理下分生孢子器的產(chǎn)生情況見表1。

表1 不同處理產(chǎn)生分生孢子器的日平均值

自第3天開始，各種處理的松針上開始出現(xiàn)黑色小粒點(diǎn)，即分生孢子器。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，分生孢子器數(shù)量增逐漸多，形狀逐漸變大，球形，半埋生在表皮層，隨后逐漸突出表皮外露。但不同處理下分生孢子器產(chǎn)生的時(shí)間及數(shù)量不同?？傮w來看，無論是否機(jī)械損傷、是否鋪玻璃紙，發(fā)病松針上產(chǎn)生的分生孢子器均比健康松針上產(chǎn)生的時(shí)間早且數(shù)量多。無論何種處理，鋪玻璃紙后分生孢子器產(chǎn)生的速度降低、數(shù)量減少，但試驗(yàn)中明顯看到，鋪玻璃紙后松針上產(chǎn)生的分生孢子器極為干凈，非常方便分生孢子的獲取(圖1)。菌絲機(jī)械損傷后對分生孢子器的產(chǎn)生也有明顯的影響，不論何種處理，機(jī)械損傷均使分生孢子器產(chǎn)生速度減慢，但隨著時(shí)間的延長，最終產(chǎn)生分生孢子器的數(shù)量差異不明顯。

圖1 松針上產(chǎn)生的分生孢子器

2.2 不同處理下分生孢子器的成熟情況 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，分生孢子器逐漸增大，成熟。培養(yǎng)第10 d時(shí)分生孢子器大小和萌發(fā)率見表2。

表2 不同處理后第10天時(shí)分生孢子器的大小和萌發(fā)率

注：同列不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

第10天時(shí)，不同處理下產(chǎn)生的分生孢子器成熟情況明顯不同。其中，在不鋪玻璃紙的菌絲上放置已滅菌3次的發(fā)病松針的兩個(gè)處理(是否機(jī)械損傷)間差異不顯著，分生孢子器的大小分別為1.423 mm和1.396 mm，萌發(fā)率分別為87.1%和85.4%，但均明顯高于其他處理。

3 結(jié)論與討論

研究表明，在不鋪玻璃紙的菌絲上放置已滅菌3次的發(fā)病松針處理后，不論是否機(jī)械損傷，均可誘導(dǎo)分生孢子器快速大量產(chǎn)生。但鋪玻璃紙更有利于獲得干凈的分生孢子器。該研究結(jié)果可為油松枯梢病病菌的后續(xù)研究提供大量的分生孢子器和分生孢子，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

目前，利用植物組織誘導(dǎo)法是室內(nèi)誘導(dǎo)植物病原菌產(chǎn)孢的主要方法，吳湘琴 等[7]用健康梨樹枝條誘導(dǎo)出梨樹腐爛病菌分生孢子器；趙紅 等[8]研究結(jié)果表明，采用滅菌的蘋果枝條能誘導(dǎo)出蘋果腐爛病菌分生孢子器。本研究亦利用油松松針誘導(dǎo)出大量油松枯梢病的分生孢子。另外，本文分別采用健康松針和發(fā)病松針進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢，結(jié)果表明，以發(fā)病松針誘導(dǎo)分生孢子器效果明顯優(yōu)于健康松針，可能是由于發(fā)病松針與健康松針相比，營養(yǎng)成分更加貧乏，不利于菌絲的營養(yǎng)生長，而刺激了其繁殖生長。本試驗(yàn)中，為了獲得干凈的分生孢子器，嘗試在長好的菌絲中鋪玻璃紙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋪玻璃紙后會(huì)影響松針上分生孢子器的產(chǎn)生，但試驗(yàn)中觀察到，在玻璃紙下面培養(yǎng)基上產(chǎn)生了一定數(shù)量的分生孢子器。因此，應(yīng)該是玻璃紙影響了菌絲向松針組織的蔓延，進(jìn)而影響了分生孢子器的產(chǎn)生。同時(shí)，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，盡管玻璃紙上的松針上分生孢子器的數(shù)量少，但由于沒有菌絲在松針上的生長、蔓延，分生孢子器清晰可見、極為干凈，非常便于自分生孢子器中獲取大量干凈的分生孢子。但如何從分生孢子器中快速簡便獲取分生孢子還有待進(jìn)一步探索。