甘蔗渣生產(chǎn)白僵菌研究

馮玉元，何華

(1.玉溪市紅塔山自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局， 云南 玉溪 653100； 2.武漢生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430415)

白僵菌Beauveriabassiana是一種以昆蟲為寄主的病原真菌，可工業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)，利用其產(chǎn)生的分生孢子加工成微生物殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于生物防治農(nóng)林果蔬害蟲，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，是保護(hù)環(huán)境的理想生物殺蟲劑，值得推廣應(yīng)用[1]。目前大多選用麥麩作為生產(chǎn)原料，每克產(chǎn)品的含孢量越高，對害蟲的感染致死率越高，殺蟲效果越好；白僵菌既能蟲生，又能腐生，具有二重生活習(xí)性，同時(shí)是一種好氧性生長真菌。在生產(chǎn)過程中，其對營養(yǎng)物質(zhì)需求不苛刻，只要有一定的有機(jī)物和適量的氧氣，均能正常生長發(fā)育。甘蔗渣是甘蔗Saccharumofficinarum榨取糖汁后的殘?jiān)辔颷2]，比麥麩松散，顆粒之間的間隙大，空隙多，與麥麩混合，可使培養(yǎng)基形成優(yōu)良通透性。作者在日常培養(yǎng)基中使用一定甘蔗渣用量代替麥麩，用麥麩甘蔗渣不同比例的培養(yǎng)基多次生產(chǎn)試驗(yàn)，結(jié)合麥麩、甘蔗渣的市場價(jià)格核算生產(chǎn)原料成本，篩選白僵菌的最佳生產(chǎn)、最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)和優(yōu)化生產(chǎn)配方，以期變廢為寶，降低生產(chǎn)成本，提高白僵菌產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

儀器：電子天平(精確到0.001 g)，電磁爐，高溫高壓滅菌鍋(126 ℃，0.14 mPa，一次可滅菌15 mm×150 mm試管4 000支)，解剖刀，接種針，溫度計(jì)，濕度計(jì)，風(fēng)干機(jī)，空調(diào)，水分測定儀等。

菌種培養(yǎng)基配料：蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，一級面粉5 g，黃豆粉5 g，普鈣1 g，松毛蟲粉5 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，瓊脂20 g，水1000 mL。熬化配料，分裝試管(15 mm×150 mm)和培養(yǎng)皿(100 mm)，滅菌制成斜面培養(yǎng)基、平面培養(yǎng)基[3]。

生產(chǎn)原料：麥麩和甘蔗渣。

1.2菌種制作

1.2.1純菌種分離培養(yǎng) 可通過菌絲培養(yǎng)分離和孢子培養(yǎng)分離獲得純菌種。

菌絲培養(yǎng)分離菌種：從林間采集感染白僵菌的思茅松毛蟲DendrolimuskikuchiiMatsumura幼蟲體，在無菌接種箱內(nèi)，浸入96%乙醇中，取出在酒精燈火焰上立即燒一下，用無菌刀解剖蟲體成小塊，大小以1 mm為宜，挑取3個(gè)蟲體中部小塊分開接種于平面培養(yǎng)基上。在20 ℃室內(nèi)培養(yǎng)3 d，蟲體小塊四周可見白色菌絲，挑取分離蟲體小塊遠(yuǎn)端潔白粗壯菌絲，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這樣反復(fù)挑取分離2～3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，可分離到純菌絲。純菌絲培養(yǎng)10～15 d，培養(yǎng)基上長滿白色粉層即可作為菌種。

孢子培養(yǎng)分離菌種：在無菌接種箱內(nèi)，取2個(gè)上述解剖的中部蟲體小塊，置于250 mL三角瓶內(nèi)浸泡100 mL無菌水中并搖晃10 min，用吸管吸取蟲體浸泡液，滴入平面培養(yǎng)基上，傾斜并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使浸泡液均勻分布。在20 ℃室內(nèi)培養(yǎng)2 d，可見培養(yǎng)基生長微小白色圓點(diǎn)，圓點(diǎn)生長成圓形菌落，至直徑10 mm時(shí)，即可挑取菌落邊緣菌絲，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可1次性分離到純菌絲，培養(yǎng)基上長滿白色粉層即可作為菌種。

1.2.2 菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 用一級面粉作培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)白僵菌生產(chǎn)菌種[3]。

1.3 白僵菌產(chǎn)品生產(chǎn) 甘蔗渣曬干后粉碎即可，大小顆粒在1～2 mm為宜。日常生產(chǎn)白僵菌培養(yǎng)基為麥麩，在培養(yǎng)基中依次減少10%麥麩，依次加入等質(zhì)量的甘蔗渣代替麥麩，直至100%甘蔗渣，成為甘蔗渣麥麩不同比例的10個(gè)培養(yǎng)基處理，以全麥麩培養(yǎng)基作對照處理(表1)。分別用35%清水置于攪拌機(jī)內(nèi)，攪拌均勻，裝入130 mm×170 mm帶蓋塑料培養(yǎng)瓶中，每瓶裝料400 g左右。放入100 ℃常壓滅菌室(一次滅菌培養(yǎng)料1.5 t，3 000瓶)保溫滅菌3 h，趁熱移到無菌接種室，冷卻到25 ℃，每瓶接試管種1支，搖晃培養(yǎng)瓶，使菌種與培養(yǎng)料充分混合。放入20 ℃室內(nèi)培養(yǎng)7～10 d，將料從瓶中倒出，置于通風(fēng)的陰涼處晾干[3-4]。每個(gè)培養(yǎng)基處理做100瓶生產(chǎn)試驗(yàn)，每個(gè)處理做10次重復(fù)生產(chǎn)。

1.4 含孢量測定 測定白僵菌產(chǎn)品含水量在5%左右時(shí)，粉碎。取1 g樣品菌粉，用無菌水稀釋10 000倍，在清潔的血球計(jì)數(shù)板上加蓋片，用吸管吸取稀釋液從蓋片側(cè)面滴入稀釋液，讓稀釋液緩緩滲入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)。置于15×40倍顯微鏡下，靜止片刻，視野內(nèi)計(jì)數(shù)板中流動孢子相對穩(wěn)定后，用計(jì)數(shù)器逐格記錄每小格內(nèi)孢子數(shù)目。計(jì)數(shù)板內(nèi)400小格容量為0.000 1 mL，因此可計(jì)算1 mL(即1 g)菌粉的孢子含量。1 g菌粉孢子數(shù)量是小格內(nèi)孢子數(shù)目乘10 000倍，即1 g菌粉孢子數(shù)量=400小格內(nèi)孢子數(shù)目×10 000。

1.5 原料成本計(jì)算 按照市場價(jià)格，麥麩2元/kg，甘蔗渣0.5元/kg。以生產(chǎn)1 000 kg白僵菌為單位，計(jì)算1 000 kg生產(chǎn)原料成本(元)=麥麩質(zhì)量(kg)×2(元/kg)+甘蔗渣質(zhì)量(kg)×0.5(元/kg)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 將麥麩甘蔗渣不同用量比例培養(yǎng)基生產(chǎn)白僵菌產(chǎn)品含孢量原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2016軟件處理，采用SPSS 17.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

日常生產(chǎn)白僵菌培養(yǎng)基是用麥麩作原料，產(chǎn)品含孢量大約為105億個(gè)孢子/g。逐漸減少麥麩生產(chǎn)用量比例，相應(yīng)增加甘蔗渣生產(chǎn)用量比例，白僵菌產(chǎn)品的含孢量隨著甘蔗渣比例增加而逐漸上升；當(dāng)麥麩和甘蔗渣生產(chǎn)用量比例各占50%時(shí)，產(chǎn)品含孢量達(dá)到最高；而后隨著甘蔗渣生產(chǎn)用量比例增加，產(chǎn)品含孢量開始下降，生產(chǎn)培養(yǎng)基全部為甘蔗渣時(shí)，產(chǎn)品含孢量下降到85億個(gè)孢子/g(表1)。

表1 麥麩甘蔗渣不同比例培養(yǎng)基生產(chǎn)白僵菌的含孢量和原料成本

注：LSD多重比較，同列不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)， 不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

白僵菌產(chǎn)品含孢量單因素方差分析表明，不同比例甘蔗渣用量培養(yǎng)基對生產(chǎn)白僵菌產(chǎn)品的含孢量產(chǎn)生了顯著影響。除20%麥麩+80%甘蔗渣處理與對照全麥麩處理(P=0.014)，40%麥麩+60%甘蔗渣處理與60%麥麩+40%甘蔗渣處理(P=0.011)，同時(shí)與70%麥麩+30%甘蔗渣處理(P=0.017)間含孢量差異沒有達(dá)到極顯著；其余處理間含孢量差異均達(dá)到極顯著(F=276.269，Df=100)(表1)。結(jié)合麥麩、甘蔗渣的市場價(jià)格核算生產(chǎn)原料成本，得出白僵菌的最佳生產(chǎn)、最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)配方。

最佳生產(chǎn)配方：使用50%甘蔗渣代替麥麩生產(chǎn)白僵菌，與其他10個(gè)處理生產(chǎn)白僵菌比較，含孢量存在極顯著差異水平，能最大幅度提高產(chǎn)品含孢量，同時(shí)能降低成本，生產(chǎn)1 000 kg白僵菌產(chǎn)品可以降低生產(chǎn)原料成本750元。

最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)配方：使用70%甘蔗渣代替麥麩生產(chǎn)白僵菌含孢量，與全麥麩生產(chǎn)白僵菌比較，每克產(chǎn)品只提高大約3億個(gè)孢子，含孢量沒有達(dá)到極顯著差異水平，但能大幅度降低成本，生產(chǎn)1 000 kg產(chǎn)品可以降低生產(chǎn)原料成本1 050元。

3 結(jié)論與討論

在日常生產(chǎn)白僵菌培養(yǎng)基麥麩中，使用一定比例的甘蔗渣替代麥麩作培養(yǎng)基生產(chǎn)白僵菌。因?yàn)楦收嵩塞滬熕缮?，顆粒之間的間隙大，空隙多，與麥麩混合，可使培養(yǎng)基形成優(yōu)良通透性，在培養(yǎng)基中存貯大量氧氣，在養(yǎng)分和氧氣充足狀態(tài)下，菌絲生長旺盛，孢子梗發(fā)育完全，產(chǎn)孢子量大，所以用甘蔗渣代替麥麩可不同程度提高白僵菌產(chǎn)品的含孢量。

當(dāng)甘蔗渣比例增加到50%代替麥麩時(shí)，可以充分滿足菌絲生長、孢子梗發(fā)育和孢子形成的物質(zhì)條件，產(chǎn)品含孢量達(dá)到最高值。之后，產(chǎn)品含孢量隨著甘蔗渣用量比例增加而減小，甘蔗渣比例增加到一定程度時(shí)，雖然可以為菌絲生長、孢子梗發(fā)育和孢子形成的生理代謝提供充足氧氣，但麥麩量的減少，必然導(dǎo)致營養(yǎng)成分不足，影響菌絲生長、孢子梗發(fā)育和孢子形成，因此產(chǎn)品含孢量隨著甘蔗渣用量比例增加而減小。尤其是甘蔗渣用量比例增加至80%以上時(shí)，營養(yǎng)不足，含孢量顯著下降，僅97.6億個(gè)/g，達(dá)不到產(chǎn)品質(zhì)量要求100億個(gè)/g。完全用甘蔗渣，營養(yǎng)嚴(yán)重不足，含孢量低，僅為85億個(gè)/g，白僵菌產(chǎn)品質(zhì)量差。

當(dāng)甘蔗渣與麥麩比例各占50%時(shí)，每克白僵菌產(chǎn)品的含孢量最高，生產(chǎn)原料成本顯著下降，成為最佳生產(chǎn)配方。 當(dāng)甘蔗渣占70%麥麩占30%時(shí)，每克白僵菌產(chǎn)品的含孢量有一定提高，而生產(chǎn)原料成本大幅度下降，成為最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)配方。

當(dāng)甘蔗渣比例大于50%小于70%時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量在最佳生產(chǎn)配方之下而在最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)配方之上，經(jīng)濟(jì)效益在最佳生產(chǎn)配方之上而在最經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)配方之下，成為優(yōu)化生產(chǎn)配方，既能提高產(chǎn)品的含孢量，又能降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。優(yōu)化生產(chǎn)配方應(yīng)用于生產(chǎn)白僵菌產(chǎn)品，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益最優(yōu)化的相互統(tǒng)一。