玉米大斑病抗病鑒定谷物粒培養(yǎng)基產(chǎn)孢因素探討

蒙 成，黃艷花，梁慶平，蔣益敏，吳 地

(廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530007)

【研究意義】玉米大斑病(Northern leaf blight of corn)是玉米的一種重要葉部病害，在我國各地普遍發(fā)生，對玉米產(chǎn)量影響嚴重，一般可導(dǎo)致減產(chǎn)20%左右，嚴重時減產(chǎn)可達50%［1－4］。該病害由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起，病菌可通過分生孢子實現(xiàn)病害遠距離傳播［5］。利用抗病種質(zhì)資源，選育和種植抗病品種是控制玉米大斑病流行的有效措施［6］。在抗病品種選育過程中，必須進行抗病性鑒定接種。孢子懸浮液噴霧接種和粉碎玉米病葉接種，受降雨和環(huán)境相對濕度影響較小，是開展玉米大斑病抗病性鑒定較好的人工接種方法。大田進行抗病性鑒定接種需要大量接種體，因此，探索影響分生孢子產(chǎn)生的外界條件，從而獲得大量分生孢子對玉米大斑病抗病性接種鑒定具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】在抗病品種的選育與利用過程中，抗病性鑒定已成為玉米育種及其區(qū)域適應(yīng)性的常規(guī)工作。玉米大斑病抗病性鑒定常用方法有:把保存的玉米大斑病菌接種在PDA斜面上，待產(chǎn)生大量孢子后用無菌水配成孢子懸浮液噴霧接種［7］;采用高粱粒培養(yǎng)基培養(yǎng)玉米大斑病分生孢子做接種體，然后放入玉米心葉內(nèi)接種［8－11］;也有把玉米大斑病病葉粉碎撒在玉米心葉內(nèi)接種［12－13］;劉燁玨等［14］研究結(jié)果表明，菌液灌心和帶菌高粱粒接種可以保證玉米單株接種量一致，同時，接種體被接種于玉米心葉中，保證了玉米大斑病菌孢子萌發(fā)所需的水分和濕度，提高病菌侵染率;分生孢子在不同營養(yǎng)及培養(yǎng)環(huán)境條件下，其產(chǎn)孢效果差異顯著。沈江衛(wèi)等［15］研究結(jié)果表明:甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata Elliset Halsted)在番茄培養(yǎng)基上生長最好，在胡蘿卜培養(yǎng)基上生長最差;分生孢子產(chǎn)量以在PDA培養(yǎng)基上最多，在玉米粉培養(yǎng)基上最少;菌絲適宜生長溫度25℃，在15℃下分生孢子產(chǎn)孢量最大;光照條件對黑斑病菌分生孢子產(chǎn)孢量沒有明顯差別。劉海英等［16］認為繼代培養(yǎng)一般會引起微生物退化，但也不排除使微生物增強適應(yīng)性的可能。利用谷物粒(麥粒，玉米粒，高梁粒等)培養(yǎng)基制備接種體是目前病害接種中廣泛使用的方法之一。玉米大斑病分生孢子通常采用高粱粒培養(yǎng)基來培養(yǎng)［17］，但產(chǎn)孢效果不甚理想，且在實際操作中，制備的接種體往往存在污染率高、滋長小昆蟲、制備慢和操作過程復(fù)雜等缺點。馮勝澤等［18］和姜開梅等［19］利用其他平板培養(yǎng)基來做產(chǎn)孢實驗，但這些產(chǎn)孢方法操作過程繁瑣，不便于大面積抗病鑒定操作，不能用帶病菌組織進行接種。目前，關(guān)于玉米大斑病利用谷物粒培養(yǎng)基培養(yǎng)分生孢子，并對其產(chǎn)孢影響因素進行研究尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】為獲得產(chǎn)孢效果好、成本低且操作簡單、便于進行大面積抗病性鑒定。以高粱粒、小麥粒、玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為輔料，組配25種植物組織培養(yǎng)基開展產(chǎn)孢量試驗，同時對溫度、培養(yǎng)時間、光照、同一菌株不同代數(shù)等影響產(chǎn)孢因素進行探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對影響玉米大斑病抗病鑒定谷物粒培養(yǎng)基產(chǎn)孢因素進行探討，尋找一種谷物粒培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，在玉米大斑病抗病鑒定時獲得產(chǎn)孢效果好、成本低且操作簡單、便于進行大面積抗病性鑒定，可以用帶病菌谷物粒進行接種，為玉米大斑病抗病鑒定工作的簡化性、時效性、準確性提供保障。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

在玉米大斑病集中發(fā)生期，從田間采集具有典型玉米大斑病癥狀的葉片進行病菌分離:在PDA培養(yǎng)基上進行單病斑分離(第1代)，經(jīng)純化后(第2代)進行單孢子分離(第3代)，獲得野生型玉米大斑病菌菌株，即為供試菌株。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基，分別由高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉、玉米葉等為輔料，單因素組配25種培養(yǎng)基。高粱粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮高粱水煮25 min后水洗瀝干備用;小麥粒處理方法:挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮小麥粒浸泡20～25 min后，水煮15～18 min后水洗瀝干備用;玉米粒的處理方法為:挑選大小一致、無病蟲的玉米粒侵泡12～15 h，水煮1h，水洗瀝干備用;玉米葉用從大田采集新鮮嫩葉切成約1 cm2的碎片備用;培養(yǎng)基制作方法:按配方配置，把所需成分混勻，濕度以藥品能溶解，玉米葉能摻和在籽粒上而無滴水為度。配好的培養(yǎng)基裝入250 mL的三角瓶中(簡稱培養(yǎng)瓶，下同)，每瓶裝100 g，經(jīng)121 Pa高壓滅菌45 min備用。

1.3 供試儀器

供試培養(yǎng)箱為珠江牌培養(yǎng)箱，型號:LRH-250-GSB1。

1.4 不同培養(yǎng)條件對分生孢子產(chǎn)量的影響

1.4.1 培養(yǎng)基對分生孢子產(chǎn)量的影響 單因素組配25種植物組織培養(yǎng)基進行產(chǎn)孢量試驗，每個配方一個處理，共25個處理(表1)，3次重復(fù)。供試菌株在PDA培養(yǎng)基上擴繁6 d，菌絲長滿9 cm培養(yǎng)皿后，用帶PDA培養(yǎng)基的菌絲接種到供試谷物粒培養(yǎng)基上，每份處理接種半皿菌塊(下同)，接種后的培養(yǎng)瓶置于20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強度2000 lx)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 d，測定產(chǎn)孢量。

1.4.2 溫度對分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別在 8、12、16、20、24、28、32 和36 ℃共8 個溫度梯度［20］、光周期:12 L∶12 D(光照強度2000 lx)條件下培養(yǎng)，3次重復(fù)，培養(yǎng)11 d后測定產(chǎn)孢量。

1.4.3 光照條件對分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別在24 D、12 L∶12 D(1500、2000、3000 lx等3種不同光照強度梯度)、24 L(光照強度3000 lx)共5種不同光照處理下20℃恒溫培養(yǎng) 11 d［18］，3 次重復(fù)。

1.4.4 培養(yǎng)時間對分生孢子產(chǎn)量的影響 以9號培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，接種后的培養(yǎng)瓶分別置于20℃和24℃、12 L∶12 D光照(光照強度2000 lx)條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 次重復(fù)。于第 5、7、9、11、15、20 和25 d測定產(chǎn)孢量。

1.5 供試菌株不同代數(shù)對分生孢子產(chǎn)量的影響

將供試菌株(第3代)的菌塊移植在PDA平面培養(yǎng)基上(即為第4代)，置于25～26℃溫箱中培養(yǎng)，同時移植在PDA斜面培養(yǎng)基上作為分代保存菌種。每一代培養(yǎng)7 d時用菌塊繼代轉(zhuǎn)移1次，連續(xù)對菌株進行菌塊繼代移植和培養(yǎng)，可獲得該病菌的繼代培養(yǎng)菌種，共移植到第10代，斜面培養(yǎng)基保存的分代菌種培養(yǎng)7 d后放入4℃進行保存［21］。試驗時將3～10代的菌種做試驗處理，以9號培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，8個處理，3次重復(fù)。接種后的培養(yǎng)瓶放入20℃、12 h黑暗12 h光照(光照強度2000 lx)條件下培養(yǎng)11 d后測定產(chǎn)孢量。

1.6 分生孢子產(chǎn)量的測定

取各處理菌粒2 g放入50 mL燒杯加水10 mL，用不繡鋼勺子連續(xù)攪拌約100次，以保證能將菌株所產(chǎn)生的分生孢子刮下至孢子脫落水里，過濾得到的孢子懸浮液，用血球記數(shù)板計算1 mL孢子懸液中所含的孢子數(shù)，折算每g培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子量。每處理取樣3次，每樣品讀數(shù)3次。

表1 25種供試培養(yǎng)基Table 1 25 tested media

圖1 不同培養(yǎng)基對產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of different media on conidia production

2 結(jié)果與分析

2.1 不培養(yǎng)基對產(chǎn)孢量的影響

將供試菌株分別接種在25種不同培養(yǎng)基上，培養(yǎng)11 d后觀察發(fā)現(xiàn)每種培養(yǎng)基上均有分生孢子產(chǎn)生，但其產(chǎn)孢量不同。由圖1可知，18個不同配方的培養(yǎng)基產(chǎn)胞量顯著高于對照，配方小麥100 g+甘露醇2.5 g+玉米葉15 g的9號培養(yǎng)基產(chǎn)孢數(shù)量最多，為1.69 ×105個/g;配方玉米100 g+甘露醇2.5 g+碳酸鉀0.2 g+玉米葉15 g的20號培養(yǎng)基產(chǎn)孢量次之，為1.49 ×105個/g;排第 3、4、5、6、7 的分別為5、3、11、12、19 號培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量分別為 1.28 ×105、1.18 × 105、1.13 × 105、1.13 × 105、1.09 × 105個/g;14號與22號培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相當，分別為7.20×104、6.18 ×104個/g;17、6、8 號培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相同，其與13、21、2、15號培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相當，產(chǎn)孢量依次為 2.17 × 104、3.63 × 104、3.44 × 104、2.61 ×104、2.29×104個/g;1號和24培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相同，產(chǎn)孢量為1.02×104個/g;25號常用高粱培養(yǎng)基(CK)產(chǎn)孢量為9.10 ×103個/g;10、7、18、16、23、4 號培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較對照少，分別為8.92×103、8.92×103、5.10 × 103、3.18 × 103、2.55 × 103、2.00 × 103個/g。因此，9號培養(yǎng)基為玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基。

圖2 不同溫度對產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The effects of different temperatures on conidia production

2.2 不同溫度條件對產(chǎn)孢量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)溫度對玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的影響較大，溫度過低或過高都不利于分生孢子產(chǎn)生。20℃條件下產(chǎn)孢量顯著高于其它，24℃條件下產(chǎn)孢量其次，溫度≤8℃或≥32℃時，不產(chǎn)生分生孢子。因此，接種后的培養(yǎng)基在20℃條件下培養(yǎng)是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度。

2.3 不同光照條件對產(chǎn)孢量的影響

圖3 光照對產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Effects of light treatments on conidia production

圖4 不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)孢量的影響Fig.4 The effects of different culture duration on spore production

由圖3可知，光照條件對玉米大斑病菌產(chǎn)孢量有一定影響，適量光照對該病菌產(chǎn)孢有促進作用。12 L∶12 D，2000 lx光照強度條件下產(chǎn)孢量顯著高于其它光照條件，產(chǎn)孢量為1.69 ×105個/g;12 L∶12 D，光照強度1500 lx條件下產(chǎn)孢量次之，產(chǎn)孢量為1.41×105個/g;高強度光照即12 L∶12 D，光照強度3000 lx條件對該病菌產(chǎn)孢量有明顯抑制作用，產(chǎn)孢量為2.7×104個/g;24D條件下不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為8.99×104個/g;24 L，光照強度為3000 lx條件下最不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量僅為1.71×104個/g。

2.4 不同培養(yǎng)時間對產(chǎn)孢量的影響

由圖4可知，培養(yǎng)時間對玉米大斑病菌產(chǎn)孢量影響差異顯著。20和24℃條件下培養(yǎng)時間7～11 d，培養(yǎng)時間越長，產(chǎn)孢量顯著增加，20℃條件下培養(yǎng)11 d產(chǎn)孢量最多;培養(yǎng)時間11～25 d，培養(yǎng)時間越長，產(chǎn)孢量顯著減少。因此，在20℃條件下，培養(yǎng)時間在第11天是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時間。

2.5 供試菌株不同代數(shù)對產(chǎn)孢量的影響

由圖5可知，玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，不同代數(shù)對產(chǎn)孢量影響差異顯著。產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。第3代產(chǎn)孢量最高，為1.69×105個/g;第 4 代其次，產(chǎn)孢量為 1.36 ×105個/g;因此，第3代菌株最有利于玉米大斑病菌分生孢子生長，產(chǎn)孢量最多。

3 討論

圖5 菌株不同代數(shù)對產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effects of different strain generations on the conidia yield

在促進植物病原真菌產(chǎn)孢的研究進程中，方中達［22］認為培養(yǎng)基與孢子產(chǎn)生的關(guān)系最大，采用不同培養(yǎng)基或者改變它們的成分，是促進孢子產(chǎn)生的最主要途徑;劉麗麗等［23］認為不同培養(yǎng)基對多數(shù)茄鏈格孢的產(chǎn)孢量有明顯影響;莊義慶等［24］認為綠豆湯培養(yǎng)液是蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產(chǎn)孢最好的培養(yǎng)液，在適宜條件下，產(chǎn)孢量達到1×106mL－1;蘭成忠等［25］認為辣椒疫霉菌在胡蘿卜、黑麥和燕麥培養(yǎng)基均能產(chǎn)生孢子囊，胡蘿卜培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子囊的數(shù)量最多;馮勝澤等［18］用13種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)玉米大斑病菌分生孢子的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)使用玉米籽粒葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CDA)、玉米籽粒瓊脂培養(yǎng)基(CA)及水瓊脂培養(yǎng)基(WA)3種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較低，均≤8.89×103個/mL，PDA 培養(yǎng)基產(chǎn)孢量為 1.32 ×105個/mL，而玉米葉片葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CLDA)最有利于分生孢子的產(chǎn)生，產(chǎn)孢量達到 1.63×105個/mL，使用含有玉米葉片的CLDA培養(yǎng)基與使用普通PDA培養(yǎng)基相比產(chǎn)孢量差異顯著。本研究采用25種不同谷物粒培養(yǎng)基誘導(dǎo)玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)使用配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號培養(yǎng)基最佳，產(chǎn)孢量最多，產(chǎn)孢量為1.69 ×105個/g;配方為玉米 100 g、甘露醇 2.5 g、碳酸鉀0.2 g玉米葉15 g的20號培養(yǎng)基其次，產(chǎn)孢量第二，產(chǎn)孢量為1.49×105個/g，說明，這兩種培養(yǎng)基搭配合理，適宜玉米大斑病菌生長。

陳利峰和徐敬友［26］研究結(jié)果表明，玉米大斑病菌分生孢子形成溫度為13～30℃，產(chǎn)孢最適溫度為20℃;馮勝澤等［18］認為培養(yǎng)溫度過低或過高都不利于分生孢子的產(chǎn)生，在15、35℃均不產(chǎn)生分生孢子，僅在20、25、30 ℃能夠產(chǎn)生孢子，其中在 20、30℃的產(chǎn)孢量較少，25℃為病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度。本研究認為:玉米大斑病菌在溫度≤8℃或≥32℃時，不產(chǎn)生分生孢子;16～24℃產(chǎn)孢量較多，其中20℃條件下產(chǎn)孢量最多。說明，培養(yǎng)溫度過低或過高都不利于玉米大斑病菌生長，低于8℃或32℃以上病菌停止生長。

光照條件對玉米大斑病菌生長影響差異顯著，本研究發(fā)現(xiàn)，在全光照培養(yǎng)條件下(光照強度3000 lx)顯著抑制分生孢子產(chǎn)生;12 h黑暗12 h光照培養(yǎng)條件與全黑暗培養(yǎng)相比，光照強度3000 lx抑制分生孢子產(chǎn)生，光照強度2000 lx促進分生孢子產(chǎn)生;連續(xù)24 h黑暗條件下不利于分生孢子產(chǎn)生。說明在玉米大斑病菌中不同光照強度對分生孢子產(chǎn)生的影響不同。由此可見，在不同植物病原真菌中，光照時間、光照強度、光質(zhì)等對病菌分生孢子產(chǎn)生均具有不同程度影響，本研究結(jié)果與馮勝澤等［18］研究結(jié)果基本一致。

培養(yǎng)時間對玉米大斑病菌產(chǎn)孢量差異顯著。以配方小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的培養(yǎng)基在20和24℃條件下，培養(yǎng)7～11 d、培養(yǎng)時間越長，產(chǎn)孢量顯著增加;培養(yǎng)11～25 d培養(yǎng)時間越長，產(chǎn)孢量顯著減少。因此，該配方的培養(yǎng)基在20和24℃條件下，培養(yǎng)時間11 d是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時間。其它配方的培養(yǎng)基，其產(chǎn)孢量與培養(yǎng)時間關(guān)系是否與該配方培養(yǎng)基相一致，有待進一步研究。

本研究結(jié)果玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，第3代產(chǎn)孢量最多，從第3～10代產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。劉海英等［16］研究認為，經(jīng)連續(xù)單孢分離和培養(yǎng)，獲得玉米大斑病菌的22次繼代培養(yǎng)菌株，前13代菌株沒有明顯的生長和發(fā)育變化，從第14代開始，繼代培養(yǎng)對病菌的生長和發(fā)育存在顯著影響，隨著繼代次數(shù)增加，產(chǎn)孢量下降，本研究結(jié)果與其研究結(jié)果差異較大，原因可能是連續(xù)單孢分離和培養(yǎng)與菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)相比，菌株衰退較慢;也有可能兩者間供試的菌株本身存在較大的差異。

4 結(jié)論

利用單因素組配確定了促進玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)量增加的最佳谷物粒培養(yǎng)基配方為小麥100 g、甘露醇2.5 g、玉米葉15 g的9號培養(yǎng)基;該培養(yǎng)基在20℃、光暗交替各12 h，光照強度為2000 lx條件下，分生孢子產(chǎn)量最高;培養(yǎng)時間在11 d內(nèi)，培養(yǎng)時間越長產(chǎn)孢量越高，第11天是玉米大斑病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時間，培養(yǎng)時間11～25 d，培養(yǎng)時間越長，產(chǎn)孢量越少;玉米大斑病菌經(jīng)菌塊繼代轉(zhuǎn)移和培養(yǎng)，第3代產(chǎn)孢量最多，從第3～10代產(chǎn)孢量隨著代數(shù)增加而遞減。