假禾谷鐮孢菌產(chǎn)孢條件研究

陸寧海，張 強(qiáng),楊 蕊，霍云鳳，郎劍鋒，石明旺，陳錫嶺

(河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院植保系，新鄉(xiāng)河南 453003)

小麥莖基腐病(wheat crown rot)最早于1951年由澳大利亞昆士蘭州的Knight記載，該病害在澳大利亞的所有麥類種植區(qū)均有報(bào)道[1]。目前，莖基腐病已成為一種全球性的重要病害，在美國(guó)的西北太平洋區(qū)、南非、意大利、埃及和敘利亞、土耳其、西亞、南非和加拿大西部已發(fā)生[2]。在澳大利亞，莖基腐病造成小麥產(chǎn)量損失高達(dá)89%[3]。據(jù)調(diào)查，在澳大利亞，小麥莖基腐病造成減產(chǎn)所導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失每年約為7 900萬(wàn)澳元，間接損失大約為4.34億澳元[4-5]。

近幾年，莖基腐病在中國(guó)黃淮小麥主產(chǎn)區(qū)的河南、河北、山東、安徽、江蘇等省普遍發(fā)生；河南省焦作、許昌、商丘、新鄉(xiāng)等地部分麥田發(fā)生嚴(yán)重，而且呈現(xiàn)不斷加重和蔓延趨勢(shì)[6-10]。據(jù)本課題組調(diào)查，在河南省的部分地區(qū)，莖基腐病造成小麥減產(chǎn)達(dá)30%～50%。莖基腐病除了造成小麥產(chǎn)量損失外，還產(chǎn)生毒素，受害小麥作為食物或用作飼料，對(duì)人和牲畜的健康有極大威脅。本課題組前期研究表明，假禾谷鐮孢菌是引起河南豫北地區(qū)小麥莖基腐病的主要病原菌。有關(guān)該病害的致病機(jī)理、寄主抗性、病原檢測(cè)、遺傳變異等基礎(chǔ)研究需要大量的分生孢子作為材料，但假禾谷鐮孢菌在常規(guī)條件下培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)孢量偏少。本研究擬對(duì)假禾谷鐮孢菌的產(chǎn)孢條件進(jìn)行初探，以期為小麥莖基腐病的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試病菌

假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)菌株由本課題組分離、鑒定、保存。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 產(chǎn)孢量的測(cè)定[11]

供試菌株活化7 d后，用直徑4 mm的打孔器在距離培養(yǎng)皿中心位置打取菌餅，接入到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)平板的相同位置，置于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)條件下；培養(yǎng)10 d后，用直徑10 mm的打孔器打取4個(gè)菌餅置于10 mL的試管里，再加入1 mL的無(wú)菌水，在混均器上快速震蕩10 min，使孢子充分洗脫下來(lái)，然后鏡檢并計(jì)數(shù)。

1.2.2 最佳培養(yǎng)基的確定[12-14]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，分別接種于以下不同培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)10 d后測(cè)產(chǎn)孢量，每個(gè)處理重復(fù)三次。培養(yǎng)基種類如下：

(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(2)PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g,蔗糖 20 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(3)燕麥片瓊膠培養(yǎng)基： 燕麥片30 g，瓊膠17～20 g，水1 000 mL。

(4)玉米粉瓊膠培養(yǎng)基： 玉米粉 300 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(5)理查固體培養(yǎng)基(Richard)： 硝酸鈉 10 g，磷酸二氫鉀5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)2.5 g，氯化鐵(FeCl3)0.02 g，蔗糖 50 g，瓊膠 17 g，水1 000 mL。

(6)查彼固體培養(yǎng)基(Czapek)：硝酸鉀2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，硫酸亞鐵(FeSO4) 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(7)SDA培養(yǎng)基：葡萄糖40.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂12.0～15.0 g，水1 000 mL。

(8)麥芽糖培養(yǎng)基：麥芽糖 25 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

1.2.3 最佳碳源的確定[15]

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：蔗糖20 g，硝酸鉀5 g，磷酸鈉2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL。分別用等量的葡萄糖、甘露醇、果糖、麥芽糖與蔗糖置換，配成不同碳源培養(yǎng)基，按照1.2.1方法于25 ℃培養(yǎng)10 d后測(cè)產(chǎn)孢量。

1.2.4 最佳氮源的確定[16]

基礎(chǔ)培養(yǎng)基同1.2.3，分別用等量的蛋白胨、氯化銨、尿素、硫酸銨與其中的硝酸鉀置換，配置成不同氮源的培養(yǎng)基，按照1.2.1方法于25 ℃培養(yǎng)10 d后測(cè)產(chǎn)孢量。

1.2.5 最佳光照方式的確定[17]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，接種于PDA平板上，25 ℃下分別置于24 h連續(xù)光照、24 h連續(xù)黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替，培養(yǎng)10 d后測(cè)量產(chǎn)孢量。

1.2.6 最佳培養(yǎng)溫度的確定[18]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，接種于PDA平板上，分別于15 ℃、20 ℃、25 ℃、 30 ℃、35 ℃培養(yǎng)10 d后測(cè)產(chǎn)孢量。

1.2.7 最佳pH值的確定[19]

用1% HCl(V/V)和1% NaOH(W/V)溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值配成pH為3～11共9個(gè)梯度，將活化直徑為4 mm的活化菌餅接種于不同pH值的PDA平板，25 ℃培養(yǎng)10 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003 整理數(shù)據(jù)，用Duncan’s進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表1可以看出，在不同的培養(yǎng)基上假禾谷鐮孢菌的產(chǎn)孢量差異程度不同。PSA培養(yǎng)基和麥芽糖培養(yǎng)基上的分生孢子數(shù)量較多，分別為13.52×102和11.45×102個(gè)·cm-2，且顯著高于其他處理。其次是燕麥片培養(yǎng)基和SDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，分別為 9.75×102和9.61 ×102個(gè)·cm-2。玉米粉培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量為6.51×102個(gè)·cm-2。査理培養(yǎng)基和査彼培養(yǎng)基均不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量分別為 3.36×102和2.91 ×102個(gè)·cm-2，顯著低于其他處理。 因此， PSA培養(yǎng)基和麥芽糖培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

2.2 不同碳源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表2可以看出，病原菌在以麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和甘露醇為碳源的條件下均能產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量分別為15.61×102、8.76×102、5.28×102、2.34×102和1.46×102個(gè)·cm-2。不同處理間差異顯著，最有利于病原菌產(chǎn)孢的碳源是麥芽糖，其次是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇。故最佳碳源為麥芽糖。

2.3 不同氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表3可知，病原菌以硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鉀和蛋白胨為氮源時(shí)均能產(chǎn)生孢子，其中以硫酸銨為氮源時(shí)的產(chǎn)孢量為13.31×102個(gè)·cm-2，顯著高于其他處理；氯化銨和尿素次之，產(chǎn)孢量分別為7.68×102和6.31×102個(gè)·cm-2；硝酸鉀和蛋白胨則不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量分別為2.32×102和2.14×102個(gè)·cm-2。因此，硫酸銨為最佳氮源。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 1 Effect of different medium on sporulation of Fusarium pseudograminearum

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著。下表同。

Different lower-case letters following data indicate significant difference among the treatments at 0.05 level. The same in tables 2-6.

表2 不同碳源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 2 Effect of different carbon sources on sporulation of Fusarium pseudograminearum

表3 不同氮源對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on sporulation of Fusariumpseudograminearum

表4 不同光照對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effect of different light conditions on sporulation of Fusarium pseudograminearum

2.4 不同光照對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表4可知，病原菌產(chǎn)孢量在12 h光照和12 h黑暗交替條件下達(dá)到15.8×102個(gè)·cm-2，顯著高于其他處理，24 h連續(xù)光照和24 h連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量較低，分別為2.71×102和1.7×102個(gè)·cm-2。因此，最佳光照條件為12 h光照和12 h黑暗交替。

2.5 不同溫度對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表5可以看出，產(chǎn)孢量隨著溫度的升高而先升后降， 25 ℃時(shí)病原菌產(chǎn)孢量最大，為13.31×102個(gè)·cm-2，15～25 ℃處理間差異不顯著；溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，病原菌產(chǎn)孢量急劇減少。因此，最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.6 不同pH值對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響

由表6可知，隨pH值升高，病原菌產(chǎn)孢量呈先增后減之勢(shì)，當(dāng)pH值為8和9 時(shí)，產(chǎn)孢量分別為12.36×102和12.58×102個(gè)·cm-2，且顯著高于其他處理；隨pH值的繼續(xù)增大，產(chǎn)孢量逐漸減少。因此，最佳培養(yǎng)pH值為9～8。

表5 不同溫度對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 5 Effect of different temperatures on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

表6 不同pH值對(duì)病原菌產(chǎn)孢量的影響Table 6 Effect of different pH on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

3 討 論

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小麥莖基腐病的病原進(jìn)行了大量研究， 但結(jié)果差異較大。Fernandez等[20]和Jefferson等[21]從加拿大小麥地下組織中分離得到木賊鐮孢菌(F.equiseti)、銳頂鐮孢菌(F.acumiuatum)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和燕麥鐮孢菌(F.aveuaceum)，但致病力均不高。其他學(xué)者在西北太平洋地區(qū)分離獲得根腐離蠕孢(Bipolarissorokiuiaua)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)、燕麥鐮孢菌(F.aveuaceum)和雪霉葉枯菌(Microdochiumnivale)，其中黃色鐮孢菌和假禾谷鐮孢菌對(duì)小麥的危害最大[22-25]。陳厚德等[26]認(rèn)為，小麥莖基腐病的病原菌以鐮孢菌屬(Fusarium)種類為主，交鏈孢屬(Alternaria)次之，而且鐮孢菌屬(Fusarium)種類致病力較強(qiáng)。李 偉等[27]研究認(rèn)為，小麥莖基腐病的病原菌主要種類是鐮孢菌(Fusarium)、根腐離蠕孢(B.sorokiuiaua)和雪霉葉枯菌(M.nivale)。綜合國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究，禾谷鐮孢菌(F.gramiuearum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)和黃色鐮孢菌(F.culmorum)是大部分小麥種植區(qū)小麥莖基腐病主要病原菌種類，其中，假禾谷鐮孢菌是該病害的主要病原菌，如在美國(guó)太平洋西北地區(qū)，南非，澳大利亞昆士蘭州和新南威爾士州北部、阿根廷、意大利、埃及和敘利亞、土耳其、西亞和北非及加拿大西部等均有該病原菌被發(fā)現(xiàn)[28-30]。

假禾谷鐮孢菌引起的小麥莖基腐病危害嚴(yán)重，亟待探索分析該病原菌的成災(zāi)機(jī)理、致病機(jī)制和寄主抗病性等問(wèn)題，但是在常規(guī)培養(yǎng)條件下，病原菌不易產(chǎn)生孢子或孢子的數(shù)量太少,限制了研究工作的快速開展。因此，優(yōu)化病原菌的產(chǎn)孢條件具有重要理論意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，假禾谷鐮孢菌在12 h光暗交替條件下產(chǎn)孢量顯著高于連續(xù)光照和連續(xù)黑暗條件下產(chǎn)孢量，最佳培養(yǎng)碳源、氮源、溫度、pH為麥芽糖、硫酸銨、25 ℃、8～9。