青稞 HVA1和 blt4.9基因?qū)δM水分脅迫的響應(yīng)差異及其在抗旱育種中的應(yīng)用

王 越，姚曉華，吳昆侖，白羿雄，魏曉星

(1.青海大學(xué)，青海西寧 810016； 2.青海省青稞遺傳育種重點實驗室/國家麥類改良中心青海青稞分中心，青海西寧 810016； 3.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)為禾本科大麥屬植物，屬于栽培大麥的變種，因其成熟時籽粒內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故稱裸大麥[1]。青稞以其獨特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健作用而成為極具開發(fā)利用價值的高原特色農(nóng)作物之一[2]，主要種植于我國西北和西南高原地區(qū)(西藏、青海、甘肅、四川、云南等)。種植區(qū)域內(nèi)高寒缺氧，環(huán)境惡劣，降雨量少、蒸發(fā)量大[3]，但青稞在如此惡劣的條件下表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性，說明其基因組中蘊藏了豐富的與抗旱和抗寒相關(guān)的優(yōu)良基因。開發(fā)利用這些基因，不僅對選育青稞抗逆新品種具有重要理論意義，而且對作物抗脅迫基礎(chǔ)研究具有促進作用。

干旱嚴重影響農(nóng)作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量，尤其是在高原地區(qū)[4-5]，因而與抗旱相關(guān)的基因及相關(guān)蛋白成為研究的熱點。HVA1基因與LEA蛋白、blt基因與LTP蛋白為其中的兩大類。有研究表明，LEA 蛋白與細胞耐逆性有關(guān)[6]，特別是與失水抗性有緊密聯(lián)系[7]。根據(jù)蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列(TAQAAKEKAGE)，可將LEA蛋白分為6組[8]。而HVA1基因編碼的LEA3蛋白，在植物遇到干旱、鹽、低溫和外源ABA脅迫時會大量表達，從而抵抗逆境脅迫[9-10]。另有研究表明，LTP 蛋白在抵御非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要的作用，LTP基因在受低溫、干旱、外源ABA以及損傷等逆境脅迫時也會過量表達[11]。在大麥中blt(low-temperature responsive barley gene) 基因家族是一類低溫反應(yīng)基因，受低溫誘導(dǎo)表達[12]，其中blt4也受干旱和ABA的誘導(dǎo)[13]。

本實驗室前期克隆了青稞HVA1和blt4.9基因，并發(fā)現(xiàn)在模擬干旱脅迫下這兩個基因在抗旱性強的青稞品種中表達量顯著高于抗旱性弱的品種[13-14]，推測兩基因均與青稞的抗旱性有關(guān)，但并沒有轉(zhuǎn)基因進行功能驗證，也沒有比較二者在青稞抗旱過程中作用的強弱，更不了解二者的抗旱反應(yīng)機制。本研究以青稞為材料，從8個麥類作物常用候選內(nèi)參基因 (DHN1、GAPDH、Actin-1、Actin-2、18SrRNA-1、18SrRNA-2、TC139057和PKABA) 中篩選到穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，并研究青稞HVA1和blt4.9基因?qū)δM干旱脅迫的響應(yīng)，比較他們對抗旱性響應(yīng)的差異，并在轉(zhuǎn)基因擬南芥中驗證了其抗旱性，初步探討了二者在抗旱育種中的應(yīng)用，以期為進一步開展青稞抗旱的分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試青稞品種為昆侖17號、昆侖12號和北青1號，由青海大學(xué)林科學(xué)院作物所青稞研究室繁育保存，三個品種的抗旱性強弱順序為昆侖17號>昆侖12號>北青1號。

1.2 處理方法

精選籽粒飽滿的青稞種子于清水中浸泡 1 h，0.5%高錳酸鉀溶液消毒30 min，清水沖洗干凈后浸入蒸餾水中，于4 ℃冰箱放置24 h。之后，各取20 粒種子播種于鋪有 3 層蒸餾水浸潤濾紙、直徑為10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度為(25±1) ℃，光照度為433 mol·m-2·s-1，每天光照14 h，其間每天向濾紙加數(shù)滴蒸餾水 (約5 mL)，使濾紙浸透并稍有剩余，以避免干旱。待幼苗長至約10 cm高時(約2周) 對昆侖12號幼苗進行15%PEG脅迫，分別于1、24、48、96、120和144 h取葉片提取RNA，同時采用不同濃度的PEG (1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%) 和ABA (1、5、10、50、100、200和500 mol·L-1)脅迫；另外對昆侖17號、昆侖12號和北青1號幼苗進行PEG (1%、5%、15%和25%) 脅迫，24 h后分別取葉片提取RNA，并測定生理指標。

1.3 引物設(shè)計

利用Primer Primier5.0軟件，根據(jù)文獻中常用的內(nèi)參基因序列設(shè)計引物1～8；根據(jù)實驗室已克隆的青稞HVA1和blt4.9基因的序列，在開放閱讀框 (ORF) 內(nèi)設(shè)計熒光定量PCR引物9和10 (表1)。引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。

1.4 Real-time PCR

采用iQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Takara，日本) 說明書分別建立目的基因和內(nèi)參基因的反應(yīng)體系。其組成：cDNA 50.0 ng,10 μm·L-1，上下游引物各0.5μL,SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus) 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 61 ℃ 30 s, 95 ℃ 1 min, 61 ℃ 1 min, 40 個循環(huán)。

1.5 轉(zhuǎn)青稞 HVA1和 blt4.9擬南芥植株的獲得

利用本實驗室構(gòu)建的HVA1和blt4.9植物表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株，挑單菌落培養(yǎng)進行菌液PCR鑒定，獲得陽性菌株。然后選取健壯的擬南芥植株，以花序法轉(zhuǎn)化Columbia 生態(tài)型擬南芥。侵染植株收獲T0代種子后，鋪灑在25 mg·L-1的潮霉素抗性MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃暗培養(yǎng) 2 d后 22 ℃、16 h 光照培養(yǎng)。將正常生長的抗性苗移栽到土壤中，成活后提取DNA，利用引物11和12 (表1)進行目的基因PCR擴增檢測，保留陽性植株。再經(jīng)過上述方法連續(xù)篩選得到陽性苗(T2代)用于后續(xù)試驗。

1.6 基因表達分析

采用2-△△Ct法計算基因相對表達量[15]， 1%～30% PEG模擬干旱脅迫，以HVA1基因在1% PEG脅迫處理下的表達量為1；15% PEG模擬干旱脅迫1～144 h，以HVA1基因在脅迫處理1 h的表達量為1；ABA脅迫處理，以HVA1基因在1 μmol L-1ABA處理下的表達量為1；HVA1、blt4.9基因在不同抗旱性品種中的差異，以昆侖17號HVA1和blt4.9基因在1%PEG脅迫處理下的表達量為1。

1.7 生理指標測定

蛋白質(zhì)含量以考馬斯亮藍G250染色法[16]測定；相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀法測定，相對電導(dǎo)率=(浸泡電導(dǎo)率值/煮沸后電導(dǎo)率值)×100%[17]；丙二醛 (MD)含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定[18]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用Stst 2與SPSS 13.0進行方差分析和多重比較。用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬水分脅迫下青稞內(nèi)參基因的篩選結(jié)果

由于模擬干旱脅迫下青稞葉片中能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因未見報道，為保證研究結(jié)果的準確性，本研究首先進行了模擬干旱脅迫下內(nèi)參基因的篩選。由圖1可知，以昆侖12號葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用RT-PCR擴增各內(nèi)參基因片段，結(jié)果，15%PEG模擬干旱處理1、24、48、96、120和144 h后各內(nèi)參基因的表達產(chǎn)生了明顯的不同，1～5和8號內(nèi)參基因在48～120 h內(nèi)偶有表達，1～24 h和144 h均不表達；而6和7號內(nèi)參基因在1～144 h內(nèi)均大量表達，且與引物設(shè)計的預(yù)期片段大小一致，說明這兩個基因擴增反應(yīng)具有較高的專一性。Gel-PRO analyzer分析結(jié)果表明7號內(nèi)參基因較6號內(nèi)參基因表達量變化幅度小，故用7號內(nèi)參基因檢測模擬水分脅迫下青稞HVA1和blt4.9基因的熒光定量PCR 分析。

表1 所用引物名稱及序列Table 1 Primers used to determine the expression of different genes using real-time PCR in this study

A～F分別為15%PEG模擬干旱處理1、24、48、96、120和144 h后各內(nèi)參基因的PCR擴增結(jié)果；1～8分別為內(nèi)參基因DHN1、GAPDH、Actin-1、Actin-2、18SrRNA-1、18SrRNA-2、TC139057、PKABA的擴增結(jié)果；M為Marker。

A, B, C, D, E and F stand for the amplification result of internal reference genes under 15% PEG drought stress for 1, 24, 48, 96, 120 and 144 h, respectively.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 stand for the amplification result of housekeeping genesDHN1,GAPDH,Actin-1,Actin-2,18SrRNA-1,18SrRNA-2,TC139057andKABA，respectively.M:Marker.

圖1 15%PEG模擬干旱脅迫下內(nèi)參基因的表達

Fig.1 Expression of housekeeping genes under 15% PEG drought stress

2.2 青稞 HVA1、 blt4.9基因?qū)δM干旱脅迫的響應(yīng)

以TC139057為內(nèi)參基因，檢測了青稞HVA1和blt4.9基因在不同濃度PEG處理及15%PEG模擬水分脅迫1～144 h的表達量。結(jié)果(圖2)表明，在不同濃度PEG模擬水分脅迫下，隨著脅迫濃度的提高，青稞兩基因表達量先提高后降低，其中25% PEG模擬水分脅迫下的基因表達量最高，與對照(1%PEG處理，下同)差異極顯著 (P<0.01)，且HVA1基因在10%～20% PEG脅迫下表達量顯著(P<0.05)高于blt4.9基因，而在25%～30%PEG脅迫下顯著低于blt4.9基因 (P< 0.05)；在15%PEG模擬水分脅迫下，隨著脅迫時間的延長，兩基因的表達量先提高后降低，其中HVA1基因在脅迫48 h時表達量最高，blt4.9基因在脅迫96 h時表達量最高且與對照差異極顯著 (P<0.01)， 96 h后HVA1基因表達量顯著低于blt4.9基因 (P<0.01)?？梢?，青稞HVA1和blt4.9基因?qū)EG模擬水分脅迫均有不同程度的響應(yīng)，但響應(yīng)方式不同，較低濃度脅迫和脅迫處理時間較短時HVA1基因表達量高于blt4.9基因，反之低于blt4.9基因。

圖柱上的大寫字母不同表示同一基因在不同濃度PEG處理之間(圖Ⅰ)或者在不同處理時間之間(圖Ⅱ)有顯著性差異(P<0.01)，＊號表示同一處理下blt4.9基因與HVA1基因間有顯著差異(P<0.05)，下同；分別以1%PEG處理和1 h處理下HVA1基因和blt4.9基因表達量為對照。圖3同。

Capital letters above the column indicate significant differences under different treatments at 0.01 level. * indicates significantly different among the expression levels ofblt4.9andHVA1in a same treatment at 0.05 level.The expression levels ofHVA1andblt4.9genes treated with 1% PEG or 1 h were taken as controls. The same in figure 3.

圖2 青稞HVA1、blt4.9基因在不同 PEG濃度處理下(圖Ⅰ)以及15%PEG處理0～144 h(圖Ⅱ)的表達量

Fig.2Expression levels ofHVA1andblt4.9genes under different PEG concentrations(Fig.Ⅰ) and under different time treated with 15% PEG(Fig.Ⅱ)

2.3 青稞 HVA1、 blt4.9基因?qū)BA的響應(yīng)

有研究表明，干旱脅迫往往引起ABA含量的變化[19]。本實驗測定了1～500 μmol·L-1ABA處理下青稞HVA1和blt4.9基因表達量的變化。結(jié)果(圖3)表明，隨著外源ABA濃度的增加，兩基因的表達量均先增加后降低，其中HVA1基因在10 μmol·L-1ABA處理下的表達量最高，為對照(1 μmol·L-1ABA處理，下同)的7.72倍，且與對照的差異極顯著(P< 0.01)；blt4.9基因在50 μmol·L-1ABA處理下表達量最高，為對照的8.96倍，且與對照的差異極顯著(P<0.01)；在較低濃度的ABA(1～10 μmol·L-1)處理下，HVA1基因表達量顯著高于blt4.9基因，反之低于blt4.9基因(P<0.05)。可見，青稞HVA1和blt4.9基因?qū)Σ煌瑵舛鹊腁BA處理會產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)。

以1 μmol·L-1ABA處理下HVA1和blt4.9基因表達量為對照。

The expression levels ofHVA1andblt4.9genes under 1 μmol·L-1ABA treatment were used as controls.

圖3青稞HVA1和blt4.9基因在不同濃度ABA處理下的表達量

Fig.3Expression level ofHVA1andblt4.9genes under ABA stress

2.4 轉(zhuǎn)青稞 HVA1、 blt4.9基因的擬南芥抗性篩選及分子檢測結(jié)果

在25 mg·L-1的潮霉素抗性培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化成功的擬南芥正常生長，而未轉(zhuǎn)化成功的擬南芥逐漸白化死亡。將抗性培養(yǎng)基篩選得到的T2代幼苗移栽到培養(yǎng)缽中繼續(xù)培養(yǎng)成苗，剪取擬南芥葉片提取基因組DNA，用目的片段引物進行PCR檢測，1%瓊脂糖電泳后出現(xiàn)目的條帶(圖4)，表明HVA1和blt4.9基因已經(jīng)成功整合到擬南芥基因組中。篩選到的陽性植株可以用于抗旱性鑒定實驗。

2.5 轉(zhuǎn)青稞 HVA1、 blt4.9基因的擬南芥抗旱性鑒定結(jié)果

以轉(zhuǎn)青稞HVA1、blt4.9基因的擬南芥株系 (HVA1、blt4.9) 和對照植株 (野生型WT) 的離體葉片為材料，測定了0～20%PEG模擬干旱脅迫處理下可溶性蛋白質(zhì)含量、電解質(zhì)滲透率和丙二醛(MDA)含量，結(jié)果如表2所示。隨著PEG濃度的升高，轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的葉片可溶性蛋白質(zhì)含量都顯著下降，而電導(dǎo)率和丙二醛含量都顯著升高 。在同一PEG濃度處理下，轉(zhuǎn)基因株系的葉片可溶性蛋白質(zhì)含量與對照相差無幾，而相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均顯著低于對照?？梢妰苫蜣D(zhuǎn)入擬南芥中均不同程度的提高了擬南芥的抗旱性。

2.6 青稞 HVA1、 blt4.9基因表達在不同抗旱性品種中的差異

以抗旱性不同的青稞品種為材料，檢測了其在15%和25%PEG模擬水分脅迫處理下青稞HVA1、blt4.9基因的表達量 (表3)。結(jié)果表明，兩種模擬水分脅迫處理下青稞HVA1、blt4.9基因的表達量均顯著高于對照(P<0.01)，且三個青稞品種之間兩基因表達量的差異均達顯著水平(P<0.01)，高低順序均為昆侖17號>昆侖12號>北青1號，與其實際抗旱能力相一致。另外，昆侖17號、昆侖12號和北青1號在15%PEG模擬水分脅迫下HVA1基因表達量的比例為 2.88∶1.76∶1，在25%PEG模擬水分脅迫下HVA1基因表達量的比例為1.63∶1.32∶1；而blt4.9基因表達量的比例分別為1.82∶1.30∶1和 1.95∶1.48∶1?？梢?，利用青稞HVA1基因在較弱水分脅迫下的表達量高低判斷青稞的抗旱性強弱，比用blt4.9基因的效果好，而在較強水分脅迫下用blt4.9基因效果更佳。

H1～H10和B1～B4：轉(zhuǎn)基因擬南芥；WT：野生型擬南芥；NC：提取空白對照；-：PCR空白對照；+：陽性質(zhì)粒；M：marker。

H1-H10 and B1-B4:transgenicArabidopsis; WT:wildArabidopsis;NC:blank control of extraction; -:blank control of PCR;+:positive plasmids; M:marker.

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測結(jié)果

同一列數(shù)據(jù)后的不同大寫字母表示同一實驗材料在不同濃度PEG處理之間有顯著性差異(P<0.01)；同一列數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示同一PEG濃度下不同實驗材料之間有顯著性差異(P<0.05)。

Different capital letters following data indicate significant differences among concentrations of PEG in the same experiment material at 0.01 level; Different lowercase letters indicate significant differences among experiment materials in the same concentrations of PEG at 0.05 level.

表3 模擬水分脅迫處理下抗旱性不同的青稞 HVA1、 blt4.9基因表達量Table 3 Expression of HVA1 and blt4.9 genes in huless barleys with different drough resistance under simulated drought stress

數(shù)據(jù)后的不同大寫字母表示同一品種同一基因的表達量在不同濃度PEG處理之間有顯著性差異(P<0.01)；數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示同一PEG濃度下同一基因在不同品種之間的表達量有顯著性差異(P<0.01)。

Different capital letters following data indicate significant differences among concentrations of PEG in the same variety and the same gene at 0.01 level; Different lowercase letters indicate significant differences among varieties in the same concentrations of PEG and the same gene at 0.01 level.

3 討 論

干旱脅迫是作物面臨的最為常見的非生物脅迫類型，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，干旱基因表達的檢測是干旱脅迫研究的一個重要方面[20]。實時定量PCR技術(shù)是檢測逆境下基因表達量的一個有效手段，在進行實時定量PCR 檢測中，由于樣品的RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄時cDNA合成的效率以及PCR的反應(yīng)條件等都有可能存在差異，因此必須引入拷貝數(shù)高、穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)δ繕嘶虻谋磉_量進行校正[21]。目前在大麥中已經(jīng)有了脅迫條件下內(nèi)參基因篩選的報道，在干旱和鹽脅迫中大麥實時定量PCR內(nèi)參基因的篩選研究結(jié)果表明，在進行實時定量PCR 研究之前需根據(jù)具體的實驗條件先對內(nèi)參基因進行篩選[22]。而且近年來，很多報道表明一些常用的內(nèi)參基因在不同的組織、器官、發(fā)育時期或不同的實驗條件下表達并不穩(wěn)定[23-24]。本實驗對15%PEG模擬干旱脅迫1～144 h下青稞葉片中8個內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性進行了檢測，也得到了類似的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)脅迫時間較短(1～24 h)和較長(144 h)時，除6號內(nèi)參基因和7號內(nèi)參基因外，大部分內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定，可見，在進行實時定量PCR 研究時，篩選表達穩(wěn)定、適宜特定實驗條件的內(nèi)參基因是獲得準確可靠實驗結(jié)果的重要前提[21]。

植株生物量和含水量是評價作物抗旱性的重要指標，作物的抗旱性具有復(fù)雜的機制，不能簡單通過單一性狀或者生理指標基因來評價青稞的抗旱性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了大量與抗旱相關(guān)的基因[25-27]，以HVA1基因和大麥blt基因家族各成員為例，Xu等[25]、Sivamani等[26]和Lai等[27]通過轉(zhuǎn)基因分析表明，HVA1基因過表達后可顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻、小麥和桑樹的抗旱及耐鹽能力，這些研究為支持HVA1基因在植物抗水分和鹽脅迫時起保護作用的假說提供了直接的證據(jù)；近年來研究表明，大麥blt基因家族是一類低溫反應(yīng)基因，但個別基因(如blt4)也同時受干旱和ABA 的誘導(dǎo)[30]。本實驗室克隆了HVA1和blt4.9基因，并初步證明它們與青稞的抗旱性有關(guān)[13-14]。本實驗比較了HVA1和blt4.9基因在模擬干旱脅迫下的表達量，結(jié)果表明，兩基因的表達量呈先增加后下降的趨勢，其原因可能是在受到輕度干旱脅迫或干旱時間較短時，植物體需要較多的LEA蛋白和LTP蛋白來穩(wěn)定和修復(fù)膜系統(tǒng)，以便復(fù)水時可以迅速恢復(fù)細胞膜系統(tǒng)和正常的代謝能力；而在干旱較嚴重或者脅迫時間較長時，植物整個代謝系統(tǒng)因受到嚴重的水分脅迫而制約了兩個基因的表達。是否如此，還需要通過測定其編碼的LEA蛋白和LTP蛋白的含量來進一步驗證。另外，受到輕度干旱脅迫或干旱脅迫時間較短時，HVA1基因表達量顯著高于blt4.9基因；而受到重度干旱脅迫或干旱脅迫時間較長時，HVA1基因表達量顯著低于blt4.9基因。同樣在轉(zhuǎn)基因擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了此規(guī)律，兩基因轉(zhuǎn)入到擬南芥后測定葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量、電解質(zhì)滲透率和丙二醛(MDA)含量值發(fā)現(xiàn)，在較低濃度(15%)PEG脅迫下三個抗旱相關(guān)指標在轉(zhuǎn)HVA1擬南芥中優(yōu)于轉(zhuǎn)blt4.9基因材料；而在較高濃度(25%)PEG脅迫下則相反?？梢奌VA1基因?qū)Ω珊得{迫較敏感，在干旱脅迫早期或輕度干旱即開始響應(yīng)；而blt4.9基因?qū)Ω珊得{迫較遲鈍，在干旱脅迫后期或嚴重干旱時才開始響應(yīng)，原因可能是兩個基因或其編碼的蛋白對干旱脅迫的響應(yīng)機制不同，具體機制需要進一步驗證。

另外, 本研究還發(fā)現(xiàn), 在相同的逆境脅迫下抗逆性強的青稞品種，其HVA1和blt4.9基因表達量顯著高于抗逆性弱的品種，而且較低濃度(15%)PEG脅迫下三個品種HVA1基因表達量的差異比較高濃度(25%)PEG脅迫下的大，而blt4.9基因則正好相反。這提示我們在受到較輕干旱脅迫時可以通過檢測HVA1基因的表達量來比較青稞的抗旱性；在受到較重干旱脅迫時可以通過檢測blt4.9基因的表達量來比較青稞的抗旱性。