燕麥孢囊線蟲生防真菌TL16發(fā)酵條件優(yōu)化

李軍平，盧智琴，羅寧，倪春輝，李惠霞

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

燕麥?zhǔn)鞘澜绺鞯貜V泛種植的一種糧食、飼草和飼料兼用作物，屬一年生禾本科，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和一定的保健作用［1］。近年來(lái)，燕麥的產(chǎn)量和品質(zhì)因各種病害的發(fā)生受到了嚴(yán)重的影響，其中由燕麥孢囊線蟲引起的孢囊線蟲病是新發(fā)現(xiàn)的一種病害。其病原為燕麥孢囊線蟲（Heterodera avenae），又名禾谷孢囊線蟲，屬于墊刃亞目（Tylenchina）異皮科（Heterode‐ridae）孢囊線蟲屬（Heterodera），主要為害小麥、燕麥、大麥、黑麥等多種禾谷類作物和牧草［2-4］，因最初在燕麥上發(fā)現(xiàn)而命名為燕麥孢囊線蟲。目前該線蟲已在世界5大洲40多個(gè)國(guó)家發(fā)生危害［5-7］，造成小麥產(chǎn)量損失23%~50%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)73%~89%［8］。在我國(guó)16個(gè)省、自治區(qū)、直轄市的小麥田，均有燕麥孢囊線蟲為害，可造成高達(dá)35%的產(chǎn)量損失［9］。甘肅和寧夏燕麥發(fā)病率分別為 68.7%［10］和 47.6%［11］。近年來(lái)，該病害在連作田的發(fā)生呈逐年加重趨勢(shì)，給小麥和燕麥生產(chǎn)造成重大威脅。

孢囊線蟲病屬于典型的土傳病害，一旦傳入，很難防治。目前，對(duì)燕麥孢囊線蟲病的防治，主要采取利用抗病品種、輪作、化學(xué)藥劑防治和種衣劑包衣等措施。我國(guó)現(xiàn)有小麥品種多為中度感病品種［12］，抗性材料缺乏。在一些地區(qū)，輪作等農(nóng)業(yè)防治措施實(shí)施困難，生產(chǎn)中仍以化學(xué)防治為主。然而長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥容易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，且植株易產(chǎn)生抗藥性等。而生物防治對(duì)自然生態(tài)環(huán)境安全、無(wú)污染，能參與生態(tài)環(huán)境的調(diào)控，有利于保持生態(tài)平衡，使農(nóng)田環(huán)境保持良性循環(huán)［13-14］。因此，利用微生物及其衍生物防治小麥孢囊線蟲已成為目前的研究熱點(diǎn)。

木霉菌（Trichodermaspp.）作為一種具有重要開發(fā)價(jià)值的生防因子，正逐漸被挖掘和利用［15］，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物真菌及線蟲病害的生物防治［16-18］。其中，張樹武等［17］報(bào)道長(zhǎng)枝木霉（Tricho?derma longibrachiatum）對(duì)燕麥孢囊線蟲有較好的防治效果，李瑞等［19］報(bào)道長(zhǎng)枝木霉菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲有較好的防治效果。本研究擬對(duì)長(zhǎng)枝木霉菌株TL16固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期推動(dòng)燕麥孢囊線蟲生物防治技術(shù)的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：長(zhǎng)枝木霉菌株TL16，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物線蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化和孢子懸浮液的制備 菌株TL16在 PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng) 7 d，加 1滴 Tween‐80和2 mL無(wú)菌水，搖勻后制取分生孢子懸浮液，將其濃度調(diào)整為5.0×107cfu/mL。

1.2.2 固體培養(yǎng) 將固體發(fā)酵培養(yǎng)基（固水比為1∶1）裝入培養(yǎng)皿（d=9 mm），約15 g/皿，加入1 mL懸浮液，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，3次重復(fù)。

1.2.3 產(chǎn)孢量的測(cè)定 在無(wú)菌條件下準(zhǔn)確稱取1 g帶菌的培養(yǎng)基，在研缽中充分研磨，加99 mL水和一滴吐溫80。攪拌后，振蕩混勻用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，每處理重復(fù)3次，取其平均值。

產(chǎn)孢量（cfu/g）=80小方格內(nèi)孢子個(gè)數(shù)/80×400×10 000×稀釋倍數(shù)

1.2.4 固體發(fā)酵基質(zhì)篩選 1） 單一基質(zhì)篩選 以玉米秸稈粉、玉米芯、玉米粉、麥麩、花生殼和大豆秸稈等6種為單一基質(zhì)進(jìn)行固體發(fā)酵。然后選擇產(chǎn)孢量高的3種基質(zhì)，正交組合后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2）正交試驗(yàn)優(yōu)化 采用正交試驗(yàn)因素水平（表1），將篩選出來(lái)的3種基質(zhì)根據(jù)不同質(zhì)量設(shè)置3個(gè)水平，設(shè)9個(gè)處理，根據(jù)孢子產(chǎn)生量選擇較好的單一培養(yǎng)基質(zhì)。

表1 正交試驗(yàn)L9（33）因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test L9（33）

1.2.5 碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的篩選 1） 碳源篩選在培養(yǎng)基質(zhì)中，分別添加4%的乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖，測(cè)定菌株TL16產(chǎn)孢量。

2） 氮源篩選 在培養(yǎng)基質(zhì)中，分別添加4%的尿素、蛋白胨、硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏和硫酸銨，測(cè)定菌株TL16產(chǎn)孢量。

3） 無(wú)機(jī)鹽篩選 在培養(yǎng)基質(zhì)中，分別添加4%的氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、硫酸銅和硫酸錳，測(cè)定菌株TL16產(chǎn)孢量。

運(yùn)用正交試驗(yàn)，對(duì)不同添加量碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行篩選，確定適宜于菌株TL16產(chǎn)孢的最佳組合。

1.2.5 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化 1） 溫度 參照郭成等的方法［20］，根據(jù) 1.2.4試驗(yàn)結(jié)果，將發(fā)酵溫度設(shè) 22、24、26、28、30、32、34和 36 ℃等 8個(gè)溫度梯度，黑暗培養(yǎng)7 d，3次重復(fù)，篩選適宜菌株TL16產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)溫度。

2） 含水量 上述試驗(yàn)條件下，將固體培養(yǎng)基與水的比例設(shè)為 1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4和1∶1.6等7個(gè)處理，3次重復(fù)，其他培養(yǎng)及檢測(cè)方法同上，篩選適宜菌株TL16產(chǎn)孢的最佳培養(yǎng)基含水量。

3） 接種量 在上述試驗(yàn)條件下，將接種量設(shè)為固料的1%、5%、10%、15%、20%、25%和30%等7個(gè)處理，重復(fù)3次。其他培養(yǎng)及檢測(cè)方法同上，篩選適宜菌株TL16產(chǎn)孢的最佳接種量。

4） 發(fā)酵時(shí)間 上述試驗(yàn)條件下，在接種后4、5、6、7、8、9、10和 11 d，進(jìn)行測(cè)定產(chǎn)孢量，確定菌株最佳發(fā)酵時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量的影響

菌株TL16在玉米粉、玉米秸稈粉、麥麩和花生殼基質(zhì)上產(chǎn)孢量比較高。其中在麥麩上產(chǎn)孢量最高，為20.07×108cfu/g，且與其它處理差異顯著（P<0.05）（圖1）。因此，玉米粉、玉米秸稈粉、麥麩和花生殼基質(zhì)4種基質(zhì)確定為菌株TL16固體發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖1 單一基質(zhì)上菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.1 Sporulation of strain TL16 in single matrix by solidstate fermentation

菌株TL16在麥麩+玉米粉固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多，為8.93×109cfu/g，麥麩+玉米秸稈次之，產(chǎn)孢量為8.44×109cfu/g，且2個(gè)組合間無(wú)顯著差異（P<0.05）。玉米秸稈+花生殼產(chǎn)孢量最少，與麥麩+玉米秸稈和麥麩+玉米粉組合產(chǎn)孢量有顯著差異（P<0.05）（圖2）。因此，培養(yǎng)菌株TL16的最佳組合是麥麩+玉米粉和麥麩+玉米秸稈。

圖2 組合固體基質(zhì)上菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.2 Sporulation of strain TL16 in combined matrixes by solid-state fermentation

在總物料相等的條件下，培養(yǎng)7 d，菌株TL16在復(fù)合基質(zhì)上的產(chǎn)孢量較單一基質(zhì)均有不同程度的提升。根據(jù)R值，菌株TL16產(chǎn)孢量由多到少依次為麥麩、玉米粉和玉米秸稈，最佳發(fā)酵條件為A3B1C2，各組分含量分別為麥麩3 g、玉米粉1 g和玉米秸稈2 g，此時(shí)產(chǎn)孢量最多，為 10.64×109cfu/g（表2）。因此，菌株L16固體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方組合為A3B1C2，即麥麩、玉米粉、玉米秸稈配比是3∶1∶2。

表2 復(fù)合基質(zhì)上菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Tab.2 Sporulation of TL16 in different composite sub?strates by solid-state fermentation

2.2 不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽固體發(fā)酵對(duì)產(chǎn)孢量的影響

菌株TL16在不同培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，其中，以乳糖為碳源、蛋白胨為氮源和硫酸錳為無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基上 產(chǎn) 孢 量 最 高 ，分 別 為 1.29×1010、1.58×1010和1.34×1010cfu/g，且均顯著高于其它碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽（表3）。因此，將乳糖、蛋白胨和硫酸錳確定為菌株TL16最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。

表3 不同碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽下的TL16固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Tab.3 Sporulation of strain TL16 under carbon，nitrogen sources and inorganic salts by solid-state fermentation

當(dāng)乳糖、蛋白胨和硫酸錳的添加量均為4%時(shí)，菌株產(chǎn)孢量最高，且與其他處理差異顯著（P<0.05）（表4）。因此，將乳糖、蛋白胨及硫酸錳的添加量均確定為4%。

表4 菌株TL16固體發(fā)酵最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽添加量的篩選Tab.4 Screening of optimum carbon，nitrogen and inorganic salt additions for solid-state fermentation of strain TL16

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽添對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量影響由高到低依次為：無(wú)機(jī)鹽>碳源>氮源（表5）。經(jīng)配比組合，TL16菌株在處理8（A1B2C3）中的產(chǎn)孢量最大，為1.59×1010cfu/g，即2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸錳配比為產(chǎn)孢最佳的培養(yǎng)基組合。

表5 菌株TL16固體發(fā)酵最佳碳源、氮源以及無(wú)機(jī)鹽最優(yōu)組合的篩選Tab.5 Screening of the best combination of optimal carbon source，nitrogen source and inorganic saltfor for solid-state fermentation of strain TL16

2.3 菌株TL16固體發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 溫度對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量的影響 在22～36 ℃，菌株TL16均能產(chǎn)孢，28 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，為1.68×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P<0.05）（圖3）。因此，將菌株TL16最佳發(fā)酵溫度確定為28 ℃。

圖3 不同溫度下菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.3 Sporulation of strain TL16 under different tempera?tures by solid-state fermentation

2.3.2 含水量對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量的影響 菌株TL16在含水量不同的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，當(dāng)固料∶水為 1∶1時(shí)，產(chǎn)孢量最大，為 1.60×1010cfu/g，且顯著高于其他條件下的產(chǎn)孢量（P<0.05）（圖4）。因此，菌株TL16最佳的固料∶水為1∶1。

圖4 不同含水量下菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.4 Sporulation of strain TL16 in different water content matrixes by solid-state fermentation

2.3.3 接種量對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量的影響 菌株TL16在接種量為15%、20%和25%時(shí)，產(chǎn)孢量比其他處理大，且差異顯著（P<0.05），但三者之間不顯著（P>0.05）（圖5）。綜合分析，將菌株TL16最佳接種量確定為15%。

圖5 不同接種量下菌株TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.5 Sporulation of strain TL16 under different inoculum size by solid-state fermentation

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株TL16產(chǎn)孢量的影響 菌株TL16第8天產(chǎn)孢量最佳，且與其他時(shí)段的產(chǎn)孢量差異顯著（P<0.05）（圖6），因此將菌株 TL16最佳發(fā)酵時(shí)間確定為8 d。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間下TL16的固體發(fā)酵產(chǎn)孢量Fig.6 Sporulation of strain TL16 under different time by solid-state fermentation

3 討論

利用生防真菌固體發(fā)酵物防治植物病害具有明顯的優(yōu)越性，因其成本低廉、操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵產(chǎn)品便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，因而被人們廣泛使用［21］。羅洋等［22］發(fā)現(xiàn)木霉FS10‐C的最佳發(fā)酵基質(zhì)為桔皮麥麩混合物，最佳發(fā)酵條件桔皮∶麥麩=1∶1，固水比 1∶1.2，接種量5%，28 ℃，發(fā)酵 11 d，產(chǎn)孢高達(dá) 2.13×1010cfu/g。魯海菊等［23］研究表明深綠木霉P3.9生防菌株在最佳固體發(fā)酵基質(zhì)和最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后產(chǎn)孢量最高達(dá)7.5×109cfu/g。朱海霞等［24］研究表明，在小麥粉和（NH4）2SO4作為碳源和氮源條件下固態(tài)發(fā)酵，生防菌株多孢木霉HZ‐31產(chǎn)孢量最多，達(dá)4.45×109cfu/mL，其產(chǎn)孢量是無(wú)碳、氮源的7.21倍。郝春英等［25］發(fā)現(xiàn)，生防鏈霉菌Men‐myco‐93‐63固體發(fā)酵基質(zhì)為大米∶高粱∶米糠∶稻殼=2∶2∶3∶3（w/w），初始水料比為1.7∶1.0（v/w，不計(jì)稻殼質(zhì)量），pH值6.2，固料添加量為30 g/L，接種量為7 mL，培養(yǎng)溫度為28 ℃，發(fā)酵10 d時(shí)產(chǎn)孢量最大。以上研究結(jié)果表明，不同菌株固體發(fā)酵時(shí)，對(duì)基質(zhì)、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、溫度和接種量等條件有不同的需求，因此，探尋適宜菌株自身生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和固體發(fā)酵條件很有必要。

本研究對(duì)菌株TL16固體發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加麥麩3 g、玉米粉1 g和玉米秸稈2 g，即麥麩：玉米粉：玉米秸稈粉為3∶1∶2時(shí)產(chǎn)孢量最多，為1.06×1010cfu/g。同時(shí)，對(duì)該菌株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)添加量進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)菌株TL16發(fā)酵所需碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的配比為2%乳糖、4%蛋白胨和4%硫酸錳，產(chǎn)孢量最大為1.59×1010cfu/g。另外對(duì)發(fā)酵條件優(yōu)化篩選發(fā)現(xiàn)，TL16菌株在最適條件下產(chǎn)孢量達(dá)到最大2.48×1010cfu/g。與景芳［26］、盧智琴［27］和羅洋［22］、魯海菊［23］等研究結(jié)果相比較，基質(zhì)配比相對(duì)復(fù)雜，但對(duì)菌株生長(zhǎng)有利，用量少，且菌株產(chǎn)孢量高，所需的培養(yǎng)時(shí)間短。對(duì)于菌株TL16批量生產(chǎn)，上述發(fā)酵參數(shù)成本低且產(chǎn)出高，具有較大的應(yīng)用潛力。目前，本試驗(yàn)只探討了培養(yǎng)基組成，碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵對(duì)產(chǎn)孢量的影響，生產(chǎn)化的大規(guī)模發(fā)酵，及發(fā)酵物貯存期、貨架期和有效期等試驗(yàn)尚未完成。菌株TL16進(jìn)一步規(guī)?；a(chǎn)和使用，除解決上述問(wèn)題外，還需要評(píng)價(jià)田間施用效果、生防菌田間定殖特性和環(huán)境安全性等參數(shù)。

4 結(jié)論

菌株TL16最佳培養(yǎng)基基質(zhì)為麥麩∶玉米粉∶玉米秸稈粉重量比為3∶1∶2，碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽類型及添加量分別為乳糖2%、蛋白胨4%、硫酸錳4%，初始固料∶水為1∶1，發(fā)酵溫度為28 ℃，接種量為15%，黑暗條件下發(fā)酵8 d。