基于羥基自由基高級氧化快速殺滅錐狀斯氏藻孢囊的研究

郭楓，李超，白敏冬*，林艷強(qiáng)，賀霄，鄭琦琳

(1. 廈門大學(xué) 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心 濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102)

基于羥基自由基高級氧化快速殺滅錐狀斯氏藻孢囊的研究

郭楓1，李超2，白敏冬1*，林艷強(qiáng)1，賀霄1，鄭琦琳1

(1. 廈門大學(xué) 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心 濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102； 2. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102)

隨著船舶壓載水的轉(zhuǎn)運(yùn)，我國面臨嚴(yán)重的外來入侵生物風(fēng)險，其中部分赤潮藻形成的孢囊可成為赤潮的“種源”，嚴(yán)重危害近岸海洋環(huán)境，因而快速有效地殺滅赤潮藻孢囊至關(guān)重要。本文利用大氣壓強(qiáng)電離放電高效生成的羥基自由基(·OH)，對典型赤潮藻錐狀斯氏藻孢囊進(jìn)行殺滅研究。采用萌發(fā)實驗、SYTOX Green熒光染色法確定·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的閾值和時間，掃描電子顯微鏡觀察孢囊的形態(tài)變化。結(jié)果表明，·OH殺滅孢囊的CT閾值為0.49 mg·min/L，時間為10 s，·OH氧化降解孢囊體內(nèi)葉綠素，破壞DNA，抑制萌發(fā)，具有其他方法無法比擬的優(yōu)勢。因此，·OH快速殺滅赤潮藻孢囊的新方法，對防控外來入侵生物引發(fā)的海洋赤潮災(zāi)害具有重要的作用。

羥基自由基；強(qiáng)電離放電；赤潮；休眠性孢囊；錐狀斯氏藻

1 引言

海洋赤潮的頻繁暴發(fā)、范圍擴(kuò)大，加劇了海洋災(zāi)害，影響了海洋生物的生存，對我國近岸海域環(huán)境質(zhì)量亮出了紅牌。部分海洋赤潮暴發(fā)的主要成因之一是累積于海底沉積物的處于休眠狀態(tài)的赤潮藻孢囊，也被稱為赤潮的“種源”，在合適條件下萌發(fā)并且大量繁殖，形成大規(guī)模赤潮[1]。此外，遠(yuǎn)洋船舶壓艙水中的外來赤潮藻在極端特有的無光、缺氧條件下“鈍化”或“休眠”產(chǎn)生具有保護(hù)機(jī)制的孢囊，隨壓載水排放入侵到中國海域，若要從源頭上阻斷海洋生物入侵，最關(guān)鍵的是殺滅壓載水中的孢囊。錐狀斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)是分布于世界各地的典型赤潮藻，其有性生殖形成的休眠性孢囊廣泛存在于我國沿海海域沉積物中，由其引發(fā)的赤潮破壞了海洋生態(tài)環(huán)境，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[2—3]。

基于高級氧化技術(shù)的羥基自由基(·OH)是綠色強(qiáng)氧化劑，能在數(shù)秒內(nèi)完成整個生化反應(yīng)過程，剩余的·OH分解成H2O和O2，無任何殘余藥劑?！H殺滅赤潮藻孢囊的劑量與其比表面積成反比，而藻孢囊與海洋中生物如魚蝦的比表面積相差甚大，殺滅藻孢囊的·OH劑量對魚蝦等海洋生物幾乎無影響。2002年，本課題組在山東龍口天然海域，進(jìn)行了6.0 m3圍隔·OH殺滅海洋赤潮生物試驗研究，圍隔中赤潮生物含量達(dá)到1 380×104cells/mL，含有膝溝藻(Gonyaulax)孢囊及多甲藻(Peridinium)孢囊，·OH海面噴灑殺滅99.8%的赤潮生物及100%的孢囊[8]。本研究利用大氣壓強(qiáng)電離放電高效生成·OH，對典型赤潮藻錐狀斯氏藻孢囊進(jìn)行殺滅研究，采用SYTOX Green熒光染色法確定·OH殺滅的閾值和時間，利用掃描電子顯微鏡觀察孢囊形態(tài)變化。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本文采用氮限制誘導(dǎo)生成錐狀斯氏藻孢囊，獲得孢囊母液[9]。錐狀斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)藻種由廈門大學(xué)海洋微型生物保種中心提供，培養(yǎng)基為缺氮f/2配方，培養(yǎng)溫度為(22±1)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗比為12L∶12D，孢囊濃度為1×103～2×103cells/mL，經(jīng)15 μm網(wǎng)篩過濾后收集母液待用。

2.2 實驗流程

圖1 ·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的實驗系統(tǒng)Fig.1 Schematic of ·OH treatment system for the inactivation of S.trochoidea cysts

2.3 檢測方法

2.3.1 TRO檢測

其三，農(nóng)村中學(xué)生語文底子薄，基礎(chǔ)不扎實。大多農(nóng)村孩子，童年時代的啟蒙教育幾乎是缺失的，他們無法享受到城市兒童那樣的社會文化和家庭文化的熏陶，即使是跨進(jìn)了小學(xué)的校門，也只能獲得教材上有限的知識內(nèi)容。

TRO濃度采用DPD(N，N-二乙基對苯二胺)分光光度法進(jìn)行測定，依據(jù)USEPA標(biāo)準(zhǔn)330.5建立，使用BioQuest CE2501型紫外-可見分光光度計測定，本研究TRO在0.88～2.42 mg/L。

2.3.2 錐狀斯氏藻孢囊死活判定

采用熒光計數(shù)法判斷錐狀斯氏藻孢囊死活，SYTOX Green核酸染料可進(jìn)入死亡細(xì)胞結(jié)合DNA發(fā)出綠色熒光[11]。本實驗中染料濃度1 μmol/mL，染色時間10 min，使用Leica DM6000B型熒光顯微鏡觀察孢囊，活孢囊在488 nm波長激發(fā)后發(fā)出紅色葉綠素?zé)晒?，死孢囊?88 nm波長激發(fā)后發(fā)出綠色熒光。

2.3.3 萌發(fā)實驗

經(jīng)過20 d強(qiáng)制休眠期后，對殺滅前后孢囊的萌發(fā)率進(jìn)行檢測，在正置顯微鏡下，利用特制細(xì)胞針挑選30個孢囊放入裝有f/2培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)皿中，每孔1個孢囊，培養(yǎng)溫度為(22±1)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗比為12L∶12D，每天觀察孢囊萌發(fā)情況，計算萌發(fā)率。

2.3.4 錐狀斯氏藻孢囊形態(tài)變化

利用掃描電子顯微鏡觀察錐狀斯氏藻孢囊的形態(tài)變化，殺滅前后的孢囊經(jīng)過固定-脫水-冷凍干燥-噴金，使用LEO 1530型掃描電鏡系統(tǒng)觀察。

3 結(jié)果與討論

3.1 ·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的閾值

采用不同TRO濃度殺滅560 cells/mL的錐狀斯氏藻孢囊，殺滅時間為10 s，熒光染色判斷孢囊死活，·OH殺滅孢囊的CT值如圖2所示，其中C為TRO濃度，T為殺滅時間。結(jié)果表明，隨著CT值的增加，活孢囊數(shù)量顯著下降；當(dāng)CT值達(dá)到0.40 mg·min/L時，活孢囊從560 cells/mL下降為20 cells/mL；當(dāng)·OH殺滅閾值為0.49 mg·min/L時，孢囊被全部殺滅。

據(jù)查閱文獻(xiàn)所知，過氧化氫法CT值達(dá)到144×104mg·min/L時，殺滅了32%的鏈狀裸甲藻孢囊[4]，其CT值是·OH法的293×104倍；甲萘醌法CT值達(dá)到240.0 mg·min/L時，對鏈狀亞歷山大藻孢囊殺滅率達(dá)到70%[6]，其CT值是·OH法的490倍；蛋白酶抑制劑法殺滅鏈狀亞歷山大藻孢囊的CT閾值高達(dá)300 mg·min/L[7]，其CT值是·OH法的610倍。大氣壓強(qiáng)電離放電產(chǎn)生·OH，殺滅錐狀斯氏藻孢囊的CT閾值僅為0.49 mg·min/L，是基于·OH氧化還原電位高達(dá)2.80 V，能破壞具有堅硬外壁的孢囊，·OH化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)高達(dá)109M-1·s-1[12]，可在數(shù)秒內(nèi)快速殺滅，與其他方法相比具有無可比擬的優(yōu)勢。

圖2 ·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的CT閾值Fig.2 Effect of CT value on the inactivation of S.trochoidea cysts孢囊濃度為560 cells/mL，殺滅時間為10 sThe content of cysts was 560 cells/mL and the contact time was 10 s

3.2 ·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的時間效應(yīng)

·OH殺滅赤潮藻孢囊的時間效應(yīng)如圖3所示，錐狀斯氏藻孢囊濃度分別為340 cells/mL和560 cells/mL，殺滅TRO濃度為2.42 mg/L，在3 s、6 s、10 s、12 s及15 s時分別取樣加入過量飽和硫代硫酸鈉中止反應(yīng)，采用熒光染色判定藻孢囊死活。當(dāng)殺滅時間為3 s時，340 cells/mL的活孢囊降到95 cells/mL，560 cells/mL的活孢囊降到190 cells/mL；當(dāng)殺滅時間為10 s時，340 cells/mL的活孢囊被全部殺死，560 cells/mL的活孢囊僅剩3 cells/mL。因此，·OH殺滅赤潮藻孢囊的時間為10 s。

據(jù)查閱文獻(xiàn)所知，在殺滅時間上，蛋白酶抑制劑法殺滅鏈狀亞歷山大藻孢囊的時間為1 h[7]，是·OH法的360倍；二氯異氰尿酸鈉法殺滅鏈狀裸甲藻孢囊的時間為24 h[4]，是·OH法的8 640倍；過氧化氫法殺滅斯氏多溝藻孢囊的時間為48 h[5]，是·OH法的1.7×104倍。因而，·OH法可在壓載水排放過程中實現(xiàn)對孢囊的快速殺滅，阻斷海洋外來生物入侵；在爆發(fā)海洋赤潮的海面噴灑高濃度·OH，不僅可快速殺滅赤潮藻，還可以快速殺滅孢囊。

圖3 ·OH致死錐狀斯氏藻孢囊的時間效應(yīng)Fig.3 Time effect of ·OH inactivation on S.trochoidea cysts TRO濃度為2.42 mg/L，孢囊濃度分別為560和340 cells/mLTRO content was 2.42 mg/L， cyst concents were 340 cells/mL and 560 cells/mL， respectively

3.3 ·OH處理后錐狀斯氏藻孢囊的萌發(fā)率

外界環(huán)境適宜時，孢囊可萌發(fā)為營養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)入上層水體大量繁殖，進(jìn)而爆發(fā)赤潮。不同CT值下錐狀斯氏藻孢囊的萌發(fā)率如表1所示，未經(jīng)·OH處理孢囊的萌發(fā)率達(dá)到93.3%，具有極高的爆發(fā)赤潮潛力，而隨著CT值的增加，萌發(fā)率逐漸降低，當(dāng)施加到·OH閾值濃度時，萌發(fā)率降為0，孢囊被殺滅，失去赤潮“種源”的功能。因此，·OH法能夠完全抑制孢囊的萌發(fā)，能很好地適用于船舶外排壓載水中赤潮藻孢囊的殺滅。

表1 ·OH殺滅閾值CT對錐狀斯氏藻孢囊萌發(fā)率的影響

3.4 ·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的形態(tài)觀察

采用熒光顯微鏡觀察·OH殺滅錐狀斯氏藻孢囊的形態(tài)變化如圖4所示，A為藻孢囊的明場照片，B、C及D為注入不同CT值時藻孢囊的明場照片。原孢囊大小為20～30 μm，呈橢圓形，具有較厚的鈣質(zhì)孢囊壁，內(nèi)容物飽滿，紅色體明顯；隨著CT值的增加，孢囊整體形狀沒有變化，內(nèi)容物越發(fā)黯淡，原生質(zhì)體發(fā)生一定程度的收縮；當(dāng)CT值達(dá)到0.66 mg·min/L時，紅色體和油滴消失，表明·OH氧化降解了孢囊內(nèi)容物。

如圖4所示，a為藻孢囊的SYTOX Green染色熒光照片，b、c及d為·OH注入不同CT值的熒光照片。原藻孢囊在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出葉綠素自體紅色熒光，表明孢囊具有很好的光合作用能力。隨著注入CT值的提高，·OH改變藻孢囊細(xì)胞膜的通透性，使大分子SYTOX Green染料能進(jìn)入孢囊體內(nèi)與DNA結(jié)合，在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，表明藻孢囊被殺致死[11]。在熒光顯微鏡下觀察到孢囊的葉綠素自體紅色熒光逐漸消失，表明·OH氧化降解了葉綠素，破壞了孢囊的光合作用系統(tǒng)。若CT值提高至0.66 mg·min/L，觀察不到綠色熒光，因為·OH進(jìn)入孢囊體內(nèi)后與DNA發(fā)生加成反應(yīng)，進(jìn)攻嘌呤堿基和嘧啶堿基，使DNA斷鏈，導(dǎo)致SYTOX Green染料無法與DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光[13]。

圖4 ·OH處理錐狀斯氏藻孢囊的明場及熒光染色照片(標(biāo)尺為20 μm)Fig.4 Light and fluorescence microscope images of S.trochoidea cysts (scale bar is 20 μm)A、a分別為·OH殺滅前孢囊的明場及SYTOX Green熒光染色照片；B、C、D分別為不同CT值的·OH殺滅后孢囊的明場照片，b、c、d為對應(yīng)的熒光染色照片A. bright-field image of cyst before ·OH treatment， a.SYTOX Green fluorescence image of cyst before ·OH treatment， B，C，D.bright-field images of cyst after ·OH treatment with different CT values， b，c，d.SYTOX Green fluorescence images of cyst after ·OH treatment with different CT values

圖5 ·OH致死錐狀斯氏藻孢囊的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of S.trochoidea cysts before and after ·OH inactivationA為原藻孢囊的SEM照片；B為·OH致死藻孢囊的SEM照片A. SEM image of cyst before ·OH inactivation; B. SEM image of cyst after ·OH inactivation with CT value of 0.49 mg·min/L

·OH致死錐狀斯氏藻孢囊的掃描電子顯微鏡照片如圖5中所示，A為原藻孢囊表面形貌，完整飽滿，具有較厚的孢囊壁，表面覆蓋有鈣質(zhì)刺。B為·OH閾值濃度致死時，藻孢囊表面(圖c中箭頭處)出現(xiàn)細(xì)小裂紋，導(dǎo)致·OH進(jìn)入孢囊體內(nèi)，氧化降解葉綠素，破壞DNA，致死孢囊，但其外形結(jié)構(gòu)完整。

4 結(jié)論

本文基于大氣壓強(qiáng)電離放電·OH高級氧化方法殺滅錐狀斯氏藻孢囊，殺滅CT閾值為0.49 mg·min/L，殺滅時間僅為10 s。

采用SYTOX Green熒光染色和掃描電子顯微鏡觀察，·OH對錐狀斯氏藻孢囊的作用是由錐狀斯氏藻孢囊外壁上細(xì)小裂紋處進(jìn)入孢囊體內(nèi)，氧化降解葉綠素并破壞DNA，抑制孢囊萌發(fā)。

綜上，采用·OH快速殺滅赤潮藻孢囊的新方法，可有效地防控船舶壓載水導(dǎo)致的海洋外來生物入侵。

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Inactivation ofScrippsiellatrochoideacysts using hydroxyl radials

Guo Feng1， Li Chao2， Bai Mindong1， Lin Yanqiang1， He Xiao1， Zheng Qilin1

(1.CollegeoftheEnvironmentandEcology;FujianCollaborativeInnovationCenterforExploitationandUtilizationofMarineBiologicalResources;KeyLaboratoryofEducationMinistryforCoastalandWetlandEcosystems，XiamenUniversity，Xiamen361102，China; 2.CollegeofOceanandEarthSciences，XiamenUniversity，Xiamen361102，China)

Resting cysts are largely formed during the red tide which may be the “seed bank” of next harmful algal bloom. And the resting cysts are resistant to normal physical and chemical treatments due to their thick cyst walls. In this paper， the resting cysts ofScrippsiellatrochoideawere produced using N-limited medium. The resting cysts were inactivated using hydroxyl radicals based on a strong ionization discharge. The results showed that hydroxyl radicals could inactivate the resting cysts effectively when the CT value was 0.49 mg·min/L with a contact time of 10 s. Morphological changes were observed using scanning electron microscope which showed that hydroxyl radicals could destroy the thick cyst wall. After entering the cell， hydroxyl radicals may damage the chlorophyll and DNA. Also， the germination rate decreased to zero. In general， the ·OH treatment can be applied to inactivate the resting cysts ofS.trochoideaand provide a new method to kill the harmful algal cysts in ballast water．

hydroxyl radicals; a strong ionization discharge; red tide;Scrippsiellatrochoidea; resting cyst

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.04.010

2016-08-24；

2016-12-12。

國家科技支撐計劃項目(2013BAC06B01，2013BAC06B02)；國家重大科研儀器研制項目(61427804)；科技部創(chuàng)新人才推進(jìn)計劃重點領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(2015RA4008)。

郭楓(1991—)，男，四川省成都市人，研究方向為海洋外來入侵生物防控。E-mail:guofeng911017@163.com

*通信作者：白敏冬，教授，長江學(xué)者獎勵計劃特聘教授、國家杰出青年基金獲得者。E-mail:mindong-bai@163.com

U698.7

A

0253-4193(2017)04-0101-06

郭楓，李超，白敏冬，等. 基于羥基自由基高級氧化快速殺滅錐狀斯氏藻孢囊的研究[J].海洋學(xué)報，2017，39(4)：101—106，

Guo Feng， Li Chao， Bai Mindong， et al. Inactivation ofScrippsiellatrochoideacysts using hydroxyl radials[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(4)：101—106， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2017.04.010