球孢白僵菌產(chǎn)孢條件優(yōu)化研究

王加男，趙虹薪，劉洋，姜鴻濤，秦秀麗

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，吉林 132101）

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，蟲(chóng)害是導(dǎo)致果蔬及農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一。目前，防治蟲(chóng)害主要以噴灑化學(xué)農(nóng)藥為主，不僅造成環(huán)境污染，還使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，殺蟲(chóng)效果降低。噴施化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致果蔬及農(nóng)作物農(nóng)藥殘留，用這些原料加工食品，對(duì)人體健康造成危害。因此，使用生物農(nóng)藥已成為綠色農(nóng)業(yè)防治蟲(chóng)害的重要措施。真菌性殺蟲(chóng)劑是生物農(nóng)藥的重要組成部分，球孢白僵菌是研究應(yīng)用最多的昆蟲(chóng)真菌性殺蟲(chóng)劑，具有致病性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、對(duì)環(huán)境無(wú)明顯污染等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。球孢白僵菌對(duì)環(huán)境安全，在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景[4-5]。球孢白僵菌產(chǎn)孢數(shù)量與殺蟲(chóng)效果呈正相關(guān)[6]。目前關(guān)于球孢白僵菌菌劑的產(chǎn)孢條件報(bào)道較少。本研究對(duì)球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢條件進(jìn)行探討，篩選球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，旨在為球孢白僵菌菌劑的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料方

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 趨避試驗(yàn)供試菌株球孢白僵菌JN06由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 菌種活化培養(yǎng)基薩氏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5～6.5，將其配制成斜面試管培養(yǎng)基備用。

1.2 孢子液制備

將球孢白僵菌JN06接種于薩氏斜面試管培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至分生孢子成熟。然后用無(wú)菌水將孢子沖洗至300 mL三角瓶中，用磁力攪拌器均勻打散，將孢子懸浮液孢子濃度調(diào)至107個(gè)/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6-7]。

1.3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基配方優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.1 碳源優(yōu)化試驗(yàn)(1)主要原料優(yōu)化。分別為A：玉米糠97%；B：玉米糠87%+麥麩10%；C：玉米糠87%+玉米粉10%；D：玉米糠87%+10%大麥米；E：玉米糠87%+10%高梁米為主要原料，大麥米及高梁米用水浸泡24 h后撈出，將主料拌勻，分別加入1%蔗糖、蛋白胨、CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調(diào)至60%。(2)速效有機(jī)碳源優(yōu)化。在篩選出的主要原料中，分別加入1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蛋白胨、CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調(diào)至60%。

1.3.2 氮源優(yōu)化試驗(yàn)在篩選出的主要原料中，分別加入1%蛋白胨、酵母粉、魚(yú)粉、尿素、NH4NO3以及優(yōu)化的1%速效有機(jī)碳源、1%CaSO4配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調(diào)至60%。

1.3.3 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)在篩選出的主要原料中，加入優(yōu)化的速效有機(jī)碳源和氮源各1%，再分別添加1%的CaSO4、KH2P O4、MgSO4，以及CaSO40 .5%+KH2P O40 .5%、CaSO40 .5%+MgSO40 .5%、KH2P O40 .5%+MgSO40.5%配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量調(diào)至60%。

1.3.4 培養(yǎng)基適宜配方優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4水平5因素L16（45）正交試驗(yàn)，如表1所示，配制16種培養(yǎng)基，確定最適培養(yǎng)基配方。

1.3.5 培養(yǎng)方法將培養(yǎng)基拌勻后裝入24 cm×12 cm聚丙烯塑料袋中，松緊適度，裝至塑料袋2/3處，用無(wú)棉蓋體將袋封口，每個(gè)水平裝5袋。將裝好的培養(yǎng)基塑料袋經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，在無(wú)菌條件下接入10 mL的球孢白僵菌孢子液，在溫度為25℃、空氣相對(duì)濕度為60%～70%的無(wú)光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。

1.4 產(chǎn)孢條件優(yōu)化

1.4.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，按上述方法裝袋、滅菌、接種后，把菌袋分別放入溫度為18、20、22、25、27、29℃的條件下下，空氣相對(duì)濕度為60%～70%，無(wú)光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。考查孢子形成的最適培養(yǎng)溫度。每個(gè)水平裝5袋。

1.4.2 不同空氣相對(duì)濕度對(duì)產(chǎn)孢量的影響選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，按上述方法裝袋、滅菌、接種后，把菌袋分別放入空氣相對(duì)濕度為65%、75%、80%、85%、90%、95%的條件下，在適宜溫度及無(wú)光條件下培養(yǎng)至孢子成熟。每個(gè)水平裝5袋。

1.5 產(chǎn)孢及孢萌發(fā)測(cè)

從每個(gè)菌袋的袋口處稱取50 g含有孢子的培養(yǎng)基，放入105℃的電熱恒溫干燥箱中烘干1 h，粉碎后制成粉劑。取1 g球孢白僵菌干粉參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T25864-2010[8]測(cè)定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)[9-10]。

2 結(jié)果與析

2.1 產(chǎn)孢養(yǎng)基方優(yōu)

2.1.1 不同主要原料對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響以5種主要原料配制培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，測(cè)定其產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖1可知，在其他營(yíng)養(yǎng)成份和培養(yǎng)條件不變的情況下，主要原料不同的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量不同，5種主要原料配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為B>C>D>E>A，選擇B為主要原料配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達(dá)1.483×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量達(dá)1.429×1011個(gè)/g；其次為主要原料C配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.464×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量為1.389×1011個(gè)/g。可知，以B為主要原料配制的培養(yǎng)基是球孢白僵菌產(chǎn)孢最適的培養(yǎng)基，主要原料為2種以上配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量均高于單一主要原料A配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量。

圖1 不同主要原料產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.2 不同速效有機(jī)碳源對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料配制的培養(yǎng)基，按1.3.1方法進(jìn)行速效有機(jī)碳源優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖2可知，4種速效有機(jī)碳源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為葡萄糖>蔗糖>果糖>麥芽糖>乳糖，以葡萄糖為速效有機(jī)碳源配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達(dá)1.632×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量達(dá)1.589×1011個(gè)/g；其次為以蔗糖為速效有機(jī)碳源配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.483×1011個(gè)/g，分生孢子萌發(fā)量為1.429×1011個(gè)/g。以乳糖為速效有機(jī)碳源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖2 不同速效有機(jī)碳源產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.3 不同氮源對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料，以葡萄糖為速效有機(jī)碳源配制的培養(yǎng)基，按1.3.2方法進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。從圖3可以看出，5種氮源培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為蛋白胨>酵母粉>魚(yú)粉>NH4NO3>尿素。以蛋白胨為氮源配制的營(yíng)養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量達(dá)1.632×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量達(dá)1.589×1011個(gè)/g；其次為酵母粉為氮源配制的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量為1.587×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量為1.536×1011個(gè)/g。以尿素為氮源配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖3 不同氮源產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.1.4 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響選用B為主要原料，以葡萄糖和蛋白胨為速效有機(jī)碳源和氮源，按1.3.3方法進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化試驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。由圖4可知，6種不同無(wú)機(jī)鹽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量依次為CaSO4+KH2PO4>K2HPO4+MgSO4>K2HPO4>CaSO4>CaSO4+MgSO4>MgSO4。以CaSO4+KH2PO4為無(wú)鹽配制的培養(yǎng)基球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量為1.663×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量為1.601×1011個(gè)/g。以MgSO4為無(wú)機(jī)鹽配制的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最低。

圖4 不同無(wú)機(jī)鹽產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.2 培養(yǎng)基適宜配方優(yōu)化試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，培養(yǎng)配方正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，球孢白僵菌培養(yǎng)基最適配方為A3B3C2D2E4，即玉米糠83%+麥麩14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%。從極差R可知，培養(yǎng)基中各組分對(duì)產(chǎn)孢量影響的主次因素依次為A主料>B葡萄糖>ECaSO4>DK2HPO4>C蛋白胨。

表1 L16（45）培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)因素及水平

表2 L16（45）培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)最優(yōu)組合的產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量，以A3B3C2D2E4配制的培養(yǎng)基，含水量調(diào)至60%，裝10袋滅菌后接種培養(yǎng)，測(cè)定產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量。測(cè)得A3B3C2D2E4配方的產(chǎn)孢量為1.784×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量為1.736×1011個(gè)/g，萌發(fā)率為97.3%。

2.4 產(chǎn)孢條件優(yōu)化

2.4.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響由圖5可知，隨著溫度升高，球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量逐漸升高，溫度為26 ℃時(shí)產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)量最高，產(chǎn)孢量為1.781×1011個(gè)/g，孢子萌發(fā)量1.733×1011個(gè)/g；當(dāng)溫度低于22 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量較低；當(dāng)溫度超過(guò)26℃時(shí)，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)量隨溫度升高呈下降的趨勢(shì)。

圖5 不同培養(yǎng)溫度產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

2.4.2 不同空氣相對(duì)濕度對(duì)產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量的影響由圖6可知，隨著空氣相對(duì)濕度升高，球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量逐漸升高，當(dāng)空氣相對(duì)濕度為85%～90%時(shí)，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高；當(dāng)空氣相對(duì)濕度超過(guò)90%時(shí)，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量呈下降的趨勢(shì)。

圖6 不同空氣相對(duì)濕度產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量

3 結(jié)論討

球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量是鑒定球孢白僵菌菌劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。在菌劑生產(chǎn)過(guò)程中球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量受營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件的影響。關(guān)于球孢白僵菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究已有一些報(bào)道，例如陳孟等[11]以大米為培養(yǎng)基對(duì)其產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化；王爽等[12]對(duì)球孢白僵菌菌株固化培養(yǎng)基及產(chǎn)孢條件進(jìn)行研究；張亞平等[13]對(duì)球孢白僵菌液體培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)需求及培養(yǎng)條件進(jìn)行研究可知，球孢白僵菌在不同的培養(yǎng)基質(zhì)上產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量不同。而生產(chǎn)球孢白僵菌菌劑需采用固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)本研究?jī)?yōu)化的球孢白僵菌菌劑適宜的配方為米糠83%+麥麩14%、葡萄糖1.5%、蛋白胨1%、K2HPO40.5%、CaSO41.5%，以此為培養(yǎng)基質(zhì)球孢白僵菌產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量均達(dá)到球孢白僵菌劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并且所用原料來(lái)源廣、易得、成本低。

溫度和空氣相對(duì)濕度是影響球孢白僵菌菌劑產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量重要的環(huán)境因素，通過(guò)本研究確定生產(chǎn)球孢白僵菌的適宜溫度為26℃、空氣相對(duì)濕度為85%～90%時(shí)，產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)量最高。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)空氣相對(duì)濕度超90%時(shí)，容易發(fā)生其他霉菌污染，對(duì)球孢白僵菌菌劑的質(zhì)量有較大影響。本研究?jī)H對(duì)生產(chǎn)白僵菌菌劑的培養(yǎng)基配方及溫度和空氣相對(duì)濕度重要的環(huán)境因素進(jìn)行了研究與探討，而對(duì)生產(chǎn)所獲得的球孢白僵菌孢子粉劑的毒力影響因素并沒(méi)有涉及，對(duì)球孢白僵菌毒力的影響因素還需深入研究和探討。