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    羊棲菜多糖對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及其相關(guān)基因表達(dá)的影響※

    2020-12-09 08:44:54楊旭東楊驕霞王桂云宋高臣
    中醫(yī)藥通報(bào) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:增殖率脂質(zhì)批號(hào)

    ●楊旭東 石 杰 楊驕霞 王桂云 宋高臣 張 杰▲

    脂肪細(xì)胞是人體中重要的能量?jī)?chǔ)存庫(kù),現(xiàn)代研究表明,脂肪細(xì)胞的數(shù)目增加、過(guò)度分化及代謝紊亂,與糖尿病、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等疾病密切相關(guān)[1]。因此,如何控制脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)和分化已成為治療相關(guān)疾病的作用研究靶點(diǎn)。羊棲菜是一種食用海藻,隸屬于褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬。羊棲菜多糖(Sargassum fusiforme polysaccha-ride,SFPS)從海藻羊棲菜中提取,研究發(fā)現(xiàn)其具有降血脂、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等生物活性[2-4],本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),SFPS 具有降低糖尿病大鼠血脂、改善胰島素抵抗等作用[5-6],但SFPS 對(duì)脂肪細(xì)胞的增殖分化的影響及其機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察SFPS對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞是否具有抑制增殖分化的作用,并研究其對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。

    1 材料

    1.1 材料與試劑前脂肪細(xì)胞3T3-L1 購(gòu)自美國(guó)ATCC公司(批號(hào):62996847);DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司(批號(hào):1782825);Trizol 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司(批號(hào):15596-026);MTT 購(gòu)自索萊寶有限公司(批號(hào):303H0524);胰蛋白酶購(gòu)自上海生工(批號(hào):825J041);PPARγ 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司(批號(hào):ab24509);FAS 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司(批號(hào):31080T);β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司(批號(hào):4970T);HRP 標(biāo)記IgG 二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司(批號(hào):ab45966);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器和設(shè)備RCO-3000T-5V CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)G.S.公司);7500 ABI 熒光定量PCR(美國(guó)Bio-Rad公司);UV-5200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);Elx808酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek 公司);DYJ-909 倒置顯微鏡(上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司);Universal HoodII凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 SFPS 的制備經(jīng)200 目粉碎的干燥羊棲菜,先用水煮醇沉法提取[7-8],經(jīng)3次水煮,3倍體積的95%乙醇沉淀,得到羊棲菜粗多糖(深褐色),然后用Sevag法去除羊棲菜粗多糖中的蛋白成分得到初步純化的多糖,通過(guò)SephadexG200凝膠柱用雙蒸水洗脫分離純化SFPS。用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含量,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)得羊棲菜粗多糖中多糖含量為55.13%。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)參考文獻(xiàn)[9],3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(10%新生牛血清、100mg/L鏈霉素、100IU/L青霉素),5%CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng)。

    2.3 MTT 檢測(cè)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的,以1×104/mL 的細(xì)胞濃度,接種于96 孔板,培養(yǎng)12h 后,將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control Group)、SFPS 100 mg/L 組(SFPS 100 mg/L Group)、SFPS 200 mg/L 組(SFPS 200 mg/L Group)和SFPS 400 mg/L 組(SFPS 400mg/L Group),每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h 后,每孔加入20μL MTT(5g/L)(調(diào)零組除外),4h后,棄去上清,加入150μL二甲基亞砜(DMSO),振蕩15min,結(jié)晶物完全溶解。酶標(biāo)儀于570nm處比色,測(cè)定各孔光密度(OD)值。根據(jù)OD 計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(Relative Growth Rate,RGR),按下列公式計(jì)算RGR。RGR=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

    2.4 3T3-L1 細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)及細(xì)胞分化抑制率的測(cè)定3T3-L1 前脂肪細(xì)胞以1×104/mL 的細(xì)胞濃度,接種于96 孔板,將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control Group)、SFPS 100 mg/L 組(SFPS 100 mg/L Group)、SFPS 200 mg/L 組(SFPS 200 mg/L Group)和SFPS 400 mg/L 組(SFPS 400 mg/L Group),每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后48h(開始誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)分化第0天),含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入胰島素(10μg/mL)、IBMX(0.5mmol/L)、地塞米松(1mmol/mL)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)2d。棄上清,然后用加入胰島素(10mg/L)的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2d。更換DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)9d,細(xì)胞分化基本完成,細(xì)胞胞漿中充滿脂滴,形狀接近圓形。另未分化細(xì)胞組(Undifferentiated cell group,UD Group)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(10%FBS),5%CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng),隔天換液,繼續(xù)培養(yǎng)9d。在分化第9d,細(xì)胞用多聚甲醛(4%)固定30min,加入油紅O∶去離子水=3∶2的染料,染色60min,PBS 清洗2 次,顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)有紅染的脂滴,細(xì)胞分化成熟。加入異丁醇250μL,反復(fù)吹打振蕩5min,溶解油紅O 染料,吸取150μL 染料溶解液,酶標(biāo)儀于510nm,測(cè)定各組OD 值,半定量脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)含量并計(jì)算細(xì)胞分化抑制率。細(xì)胞分化抑制率(%)=(OD 對(duì)照組-OD 藥物組)/OD 對(duì)照組×100%。

    2.5 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞TG 的影響在分化第9d,收集分化成熟的細(xì)胞后,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,離心取上清,按照TG 測(cè)定試劑盒說(shuō)明操作,測(cè)定TG含量。于500nm 處測(cè)定吸光度值,吸光度值與TG 濃度呈正比,TG單位為mmol/L。

    2.6 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPARγ、FAS蛋白表達(dá)的影響按照上述方法誘導(dǎo)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化,在誘導(dǎo)分化開始,加入不同濃度的SFPS,每個(gè)劑量設(shè)6 個(gè)平行孔。在分化第9d,收集分化成熟的細(xì)胞,測(cè)定PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量。裂解細(xì)胞提取蛋白:加入100μL細(xì)胞裂解液,冰上裂解細(xì)胞10min,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白,BCA 法定量。電泳:每組取40μg 蛋白,加樣于10%SDS-PAGE 中電泳分離。轉(zhuǎn)膜封閉:電泳結(jié)束后,濕式轉(zhuǎn)膜法280mA 70min 轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜,5%脫脂奶封閉液,室溫封閉2h。特定蛋白測(cè)定:分別加入對(duì)應(yīng)的一抗,4℃孵育12h;TBST 洗膜10min×3 次,加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,孵育2h 后,棄去二抗;TBST 洗膜10min×3 次,加入顯影劑ECL200mL,定影。用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0 軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以()表示,組間差異比較采用ANOVA檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 SFPS 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響不同濃度的SFPS 處理3T3-L1 前脂肪細(xì)胞24h、48h后,與對(duì)照組比較,各劑量組的細(xì)胞相對(duì)增殖率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);而在72h 后,與對(duì)照組比較,400 mg/L 組的細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著下降(P<0.05)。表明SFPS 在100~400 mg/L 的劑量范圍內(nèi),培養(yǎng)72h,對(duì)3T3-L1的增殖有抑制,但抑制作用不顯著。見(jiàn)表1。

    3.2 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞總脂質(zhì)及分化抑制率的影響與對(duì)照組比較,不同濃度SFPS作用后,分化成熟的脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)含量顯著降低(P<0.01),SFPS 400 mg/L組降低最明顯,說(shuō)明SFPS在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中能夠減少細(xì)胞中總脂質(zhì)含量。并通過(guò)測(cè)定的OD值,計(jì)算出脂肪細(xì)胞分化抑制率,SFPS 100 mg/L 組、SFPS 200 mg/L組和SFPS 400 mg/L組的細(xì)胞分化抑制率分別為14.51%、21.82%、44.11%。說(shuō)明不同濃度SFPS 均可抑制脂肪細(xì)胞的分化(P<0.01),SFPS 400 mg/L組抑制效果最顯著(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

    表1 SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響(,n=6)

    表1 SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響(,n=6)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

    3.3 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中TG 含量的影響與對(duì)照組比較,不同濃度SFPS作用后,分化成熟的脂肪細(xì)胞中TG含量顯著降低(P<0.01),SFPS 400 mg/L組TG含量降低最明顯,說(shuō)明SFPS 在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中能夠減少細(xì)胞中TG含量。見(jiàn)圖2。

    3.4 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPARγ、FAS蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,SFPS 各劑量組PPARγ、FAS蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),且PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量隨著SFPS 濃度的增高而逐漸降低。說(shuō)明SFPS 在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,能夠通過(guò)影響細(xì)胞中PPARγ、FAS 蛋白表達(dá)量來(lái)抑制3T3-L1 細(xì)胞分化。見(jiàn)圖3。

    圖1 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)含量的影響

    圖2 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞甘油三酯含量的影響

    圖3 SFPS對(duì)3T3-L1細(xì)胞中PPAR-γ、FAS蛋白表達(dá)的影響

    4 討論

    SFPS 是從褐藻門食用海藻羊棲菜中提取的多糖成分,主要包括褐藻淀粉、褐藻糖膠和褐藻酸。SFPS已被證實(shí)在脂代謝中具有降血脂、抑制脂質(zhì)沉積和保護(hù)脂肪變的肝細(xì)胞等作用[10-11],本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了其在脂代謝中的作用。肥胖、脂肪細(xì)胞的過(guò)度增殖分化及代謝紊亂與多種疾病相關(guān)[12],因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究SFPS對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化是否具有抑制作用,并初步探討其作用機(jī)制。

    前脂肪細(xì)胞要經(jīng)過(guò)融合前增殖、接觸抑制、克隆擴(kuò)增、擴(kuò)增停止四個(gè)階段分化為成熟的脂肪細(xì)胞[13],此過(guò)程中需要多種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)脂滴形成。PPARγ屬于核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族,是眾多脂肪分化因子中最關(guān)鍵的,可直接調(diào)控脂肪細(xì)胞分化,參與脂的代謝[14-15],PPARγ與生理性或藥理性配體結(jié)合后,改變構(gòu)象,結(jié)合相關(guān)DNA上的PPARγ反應(yīng)元件,從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中必須的轉(zhuǎn)錄因子,可進(jìn)一步調(diào)控脂代謝的相關(guān)酶的表達(dá)。為了研究SFPS 對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的影響,誘導(dǎo)分化開始,加入不同濃度的SFPS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在分化第9d,不同濃度的SFPS各組細(xì)胞中PPAR-γ蛋白的表達(dá)量顯著減少。

    FAS 是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[16],以乙酰輔酶A 為原料催化生成長(zhǎng)鏈脂肪酸,并進(jìn)一步形成甘油三酯儲(chǔ)存于細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)研究表明,脂肪組織中FAS 的mRNA 表達(dá)量與肥胖是正相關(guān)的,抑制FAS的量可以減少脂滴的生成[17-18]。PPARγ是前脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,而FAS 出現(xiàn)在分化的中期、后期,屬于PPARγ 下游靶基因之一,調(diào)節(jié)脂類的合成、儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在分化第9d,不同濃度的SFPS各組細(xì)胞中FAS 蛋白的表達(dá)量顯著減少,表明SFPS 可通過(guò)降低FAS蛋白的表達(dá),抑制3T3-L1中脂質(zhì)的生成。

    本研究結(jié)果顯示:①SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化,減少脂肪細(xì)胞中總脂質(zhì)及TG的含量,濃度越大,抑制作用越明顯。②SFPS 可以明顯下調(diào)3T3-L1細(xì)胞PPARγ蛋白的表達(dá),降低FAS蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,SFPS 抑制3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制可能與調(diào)控PPARγ和FAS蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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