藜麥愈傷組織誘導(dǎo)體系優(yōu)化研究

俞涵譯　蔣玉蓉　毛澤陽等

摘要：以9個藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）品種為材料，對藜麥莖段、子葉不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果進行比較，同時對莖段的愈傷組織誘導(dǎo)以及愈傷組織增殖體系進行優(yōu)化試驗。結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織最佳外植體為莖段，9個品種在培養(yǎng)基MS+0.5mg/L 2，4-D中用莖段誘導(dǎo)愈傷組織的平均誘導(dǎo)率達(dá)90%；在愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化試驗中，處理Ⅵ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5mg/L NAA）和處理Ⅱ（MS+0.5 mg/L 2，4-D）對藜麥愈傷組織的誘導(dǎo)率相近，但是愈傷形態(tài)差別較大，后者誘導(dǎo)形成疏松、有光澤、黃白色愈傷組織，因此MS+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基為最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；2，4-D與KT、NAA搭配使用時，愈傷組織增殖速率明顯上升。

關(guān)鍵詞：藜麥；組織培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)；增殖率

中圖分類號： Q943.1 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0026-04

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）別稱南美藜、藜谷、奎奴亞藜等，是1年生藜科草本作物，在安第斯山脈已有5 000多年的種植歷史，被印加人稱為“谷物之母” “安第斯山的真金”[1-2]。藜麥中蛋白質(zhì)含量為13%～23%，含有人體必需的9種氨基酸且比例平衡，富含不飽和脂肪酸、類黃酮、維生素E等多種有益化合物，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦的唯一的單體植物就可以滿足人體全部基本物質(zhì)需求的完美全營養(yǎng)食品，被譽為“未來的超級谷物”“營養(yǎng)黃金”“有機谷類之王”[3-4]。藜麥喜熱帶、亞熱帶干濕氣候，生長適溫14.0～18.0 ℃，營養(yǎng)生長階段可耐輕度霜凍（-1.0～0 ℃），種子結(jié)實之后可耐-6.0 ℃低溫，對鹽堿、干旱、霜凍、病蟲害等抗性能力都很強[5]。 1987年西藏自治區(qū)農(nóng)牧學(xué)院、西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院開始藜麥引種試驗[6]。目前藜麥在陜西省西安市、山西省、青海省、四川省等地區(qū)均有規(guī)?；N植。目前，關(guān)于藜麥的研究主要集中在生物學(xué)特性[6-7]、化學(xué)成分[8-9]、抗逆性等生理學(xué)特性[10-11]方面。有關(guān)藜麥組織培養(yǎng)研究尚未見報道。本研究對9個藜麥品種進行適宜外植體篩選，研究不同激素處理組合對藜麥莖段愈傷組織誘導(dǎo)、增殖的影響，旨在為藜麥再生體系構(gòu)建，以及通過轉(zhuǎn)基因、體細(xì)胞雜交等手段獲得藜麥新品種奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取大田種植的9個藜麥品種進行試驗，包括TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、CQ-TEMVCC（夭瑪）、Chenopodium quinoa ‘Red、PI596498、Tomico Quinoa、cherry vaniua quinoa、DAVE（FOUR-O-SEVEN） Quinoa、浙藜-49、浙藜-51（表1）。所有品種種子均由浙江農(nóng)林大學(xué)提供。

1.2 藜麥無菌苗的培育

挑選飽滿種子在38 ℃恒溫水浴鍋中加熱3 h，冷卻至室溫，用75%乙醇消毒1 min，用0.2% HgCl2溶液消毒5 min，再用無菌水沖洗4～5次。無菌條件下，將消毒過的種子接種到不含激素的MS培養(yǎng)基中，24 ℃暗培養(yǎng)3～4 d，16 h/8 h 光照周期下培養(yǎng)3 d，獲得無菌苗備用。

1.3 外植體的處理

將無菌苗的莖段剪成長1.0 cm的小段，子葉切成0.5 cm×0.5 cm大小，分別放入培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 2，4-D中進行愈傷組織誘導(dǎo)，重復(fù)3次。在24 ℃、16 h/8 h光照周期下培養(yǎng)28 d，統(tǒng)計每個品種不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率及生長情況。誘導(dǎo)率計算公式如下：誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.4 愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化試驗

選擇TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、浙藜-51、浙藜-49 等3個品種無菌苗莖段，在無菌條件下切成長約 1.0 cm 的片段，接種到MS基本培養(yǎng)基+不同激素處理的培養(yǎng)基上（表2），每個品種接種3個培養(yǎng)基作為重復(fù)。

1.5 愈傷組織增殖優(yōu)化試驗

將TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、浙藜-51、浙藜-49這3個品種培養(yǎng)12 d的初代愈傷組織切成0.3 g的小塊（m1），接種到表3中的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。每處理接種3瓶，每瓶接種4塊愈傷組織，每處理總計12塊。20 d后，取出愈傷組織稱量鮮質(zhì)量（m2），以愈傷組織增殖率為指標(biāo)進行最佳培養(yǎng)基篩選（表3）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用Excel、SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織外植體的選擇

將消毒的莖段、子葉接種到培養(yǎng)基上，2 d后外植體切口處變褐，4～5 d后外植體開始膨脹，7 d左右開始有肉眼可見的乳白色、黏稠狀的愈傷組織出現(xiàn)，外植體開裂伸長，28 d時未誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體不再產(chǎn)生愈傷組織。不同品種之間愈傷組織的誘導(dǎo)率存在差異，相同品種不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率也不同。由圖1可以看出，9個藜麥品種的莖段愈傷誘導(dǎo)率均在78%以上，平均誘導(dǎo)率為90%；子葉愈傷組織誘導(dǎo)率僅在58%以上，平均誘導(dǎo)率為80%。cherry vaniua quinoa、Tomico Quinoa、浙藜-51、chenopodium quinoa ‘Red莖段的愈傷組織出愈率明顯高于子葉。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、CQ-TEMVCC（夭瑪）、chenopodium quinoa ‘Red莖段愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%。由此可見，藜麥愈傷組織誘導(dǎo)敏感性存在品種差異。雖然用莖段、子葉均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但莖段更適合用作誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化分析

在藜麥愈傷組織誘導(dǎo)過程中，激素種類、濃度對愈傷組織誘導(dǎo)起重要作用。由表4可以看出，不同組合處理下同一品種愈傷組織誘導(dǎo)率有很大不同，如TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在處理Ⅱ、Ⅵ中愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%，而在處理Ⅳ、Ⅷ中低于20%。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在各種處理下的愈傷組織誘導(dǎo)率均明顯高于浙藜-49、浙藜-51。隨著2，4-D濃度的升高，3個試驗品種的誘導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)均呈下降趨勢。2.0 mg/L 2，4-D處理下浙藜-49、浙藜-51誘導(dǎo)率下降至0。在2，4-D激素基礎(chǔ)上施加不同濃度的KT、NAA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理下不同藜麥品種的愈傷組織誘導(dǎo)率變化趨勢同2，4-D單激素處理類似。3個品種在處理Ⅱ、Ⅵ的愈傷組織誘導(dǎo)率均值為89%～90%，但在前者處理下，3個品種得到的愈傷組織狀態(tài)均為濕潤、乳白色、疏松的，后者處理下3個不同品種均產(chǎn)生干燥、墨綠色、緊密的愈傷組織（圖2）。因此在愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化試驗中，綜合誘導(dǎo)率與出愈狀態(tài)，處理Ⅱ為最理想的培養(yǎng)基。

2.3 愈傷組織生長增殖優(yōu)化結(jié)果分析

將愈傷組織接種到不同激素處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d，稱量接種前后的愈傷組織質(zhì)量，可以獲得不同激素處理對愈傷組織增殖的影響。從表5可以看出，不同品種愈傷組織增殖率存在很大差異，增殖率為52%～268%，愈傷組織的增殖率不僅與培養(yǎng)基激素組分有關(guān)，也與品種特性有關(guān)。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL的愈傷組織生長較快，不同處理下增殖率較高，均值達(dá)158%。浙藜-51的愈傷組織生長相對較慢，不同處理下增殖率均值僅為76%。浙藜-51愈傷組織誘導(dǎo)能力優(yōu)于浙藜49，增殖能力劣于后者。3個藜麥品種在單激素處理Ⅰ（MS+0.5 mg/L 2，4-D）下平均增殖率為71%，在雙激素處理Ⅱ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA）以及Ⅲ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT）下平均增殖率均提高；3個藜麥品種在處理Ⅳ、Ⅴ下愈傷組織的增殖效果最明顯，均值分別達(dá)161%、134%。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在處理Ⅳ下愈傷組織增殖率達(dá)268.3%，但在處理Ⅴ下增殖率下降到180.8%，可以看出激素濃度的增加對其增殖具有一定抑制作用。因此，相比而言，處理Ⅳ（0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA）較為適宜。

3 結(jié)論與討論

開展組織培養(yǎng)研究對于藜麥優(yōu)良種質(zhì)資源保存、新品種選育以及遺傳學(xué)特征研究等具有十分重要的意義[12]。本試驗中9個藜麥品種均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但不同品種對組培條件的敏感性存在一定差異。因此在構(gòu)建藜麥愈傷組織培養(yǎng)體系時，既要考慮共性問題，又要顧及到各自的基因型特點[13]。藜麥的子葉、莖段均能誘導(dǎo)出愈傷組織，相比而言，后者的誘導(dǎo)效果優(yōu)于前者，這與安桂花等對高山紅景天[14]、蘆婕等對盾葉薯蕷[15]、莫英等對盾葉薯蕷[16]、張勃等對紫花苜蓿[17]、肖荷霞等對紫花苜蓿[18]的研究結(jié)果一致。植物激素是調(diào)控植物器官產(chǎn)生愈傷組織及其分化最主要的影響因素[19-20]。2，4-D是組織培養(yǎng)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，主要起誘導(dǎo)愈傷組織形成、促進生根等作用，在植物組織培養(yǎng)中廣泛使用[21]。本研究表明，3個藜麥品種在0.5 mg/L 2，4-D處理下，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢。邢小明等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D濃度在0.10～1.00 mg/L時，波葉紅果樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)率隨著激素濃度升高而升高，2，4-D濃度過高對愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的抑制作用[22]。代亮等研究發(fā)現(xiàn)，3 mg/L 2，4-D處理下，12個草地早熟禾品種愈傷組織誘導(dǎo)率均值達(dá)86%[23]。許明子等在NB培養(yǎng)基上添加2 mg/L 2，4-D，發(fā)現(xiàn)水稻愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)80%以上[24]。由此可以看出，不同濃度2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)率影響很大。朱祝英等研究發(fā)現(xiàn)，MS+2，4-D培養(yǎng)基處理下，香蕉葉片誘導(dǎo)率高達(dá)100%，加入其他生長素或細(xì)胞分裂素如NAA、KT、6-BA等香蕉葉片誘導(dǎo)率均有所降低[25]。本研究結(jié)果表明，處理Ⅵ（MS+05 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5mg/LNAA）和處理Ⅱ（MS+0.5 mg/L 2，4-D）對藜麥愈傷組織的誘導(dǎo)率相近，但是愈傷形態(tài)差別較大，后者誘導(dǎo)形成疏松、有光澤、黃白色愈傷組織，因此MS+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基是最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。這與前人研究結(jié)果[26-27]不一致，可能是由于不同植物愈傷組織形成所需要的激素種類不同。組培體系中，愈傷組織增殖速度關(guān)系到組培體系效率，在轉(zhuǎn)基因研究中尤其如此[23]。孫瑞明等研究發(fā)現(xiàn)，在增殖階段，香竹愈傷組織對 2，4-D的依賴程度沒有誘導(dǎo)階段強，但仍須維持一定濃度，低濃度KT、NAA對香竹愈傷的增殖有良好的效果[28]。高麗麗等研究表明，秈稻愈傷組織的增殖不僅與愈傷組織的生長狀態(tài)以及培養(yǎng)基組分有關(guān)，還與品種特性有關(guān)[29]。本研究結(jié)果表明，處理Ⅳ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA）下，3個藜麥品種愈傷組織增殖率達(dá)90.8%～268.3%，TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL的愈傷組織增殖率明顯高于浙藜51、浙藜49。

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