小型西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)條件

王玉書　王歡　高美玲等

摘要：以2種基因型小型西瓜為試材進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，研究西瓜花蕾橫徑、不同激素配比、低溫預(yù)處理、熱激處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，西瓜花蕾橫徑為4.6～5.0 mm時(shí)，誘導(dǎo)率最高，平均誘導(dǎo)率達(dá)到32.67%；2個(gè)西瓜品種的花藥在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L上誘導(dǎo)率均最高，分別為45.52%、30.50%；花蕾在4 ℃條件下低溫預(yù)處理48 h可以提高西瓜花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率達(dá)40.67%；將接種的花藥在33 ℃條件下進(jìn)行 1 h 的熱激處理后，愈傷組織褐化率較高，不易長(zhǎng)出綠色致密的愈傷組織。

關(guān)鍵詞：西瓜；花藥；愈傷組織；誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)： Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0030-03

小型西瓜又名迷你西瓜，果型小巧外形美觀，肉質(zhì)鮮嫩多汁，瓜薄皮而少纖維，已成為一種高檔禮品。近年來，隨著人們生活水平的提高以及小型化家庭的發(fā)展，小型西瓜作為一種新興的西瓜優(yōu)良新品種，市場(chǎng)發(fā)展前景十分廣闊，現(xiàn)已經(jīng)成為高效農(nóng)業(yè)項(xiàng)目之一[1]。目前，小西瓜品種主要依賴進(jìn)口，種子價(jià)格很高，選育優(yōu)良小型西瓜新品種是促進(jìn)西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。采用常規(guī)育種手段選育新品種不僅耗時(shí)耗力、效率低，而且難以顯著提高新品種的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性等。通過花藥培養(yǎng)獲得純系材料，是一種行之有效的育種途徑，既可以大大縮短育種時(shí)間，提高育種效率，節(jié)省人力和物力，同時(shí)也可為分子標(biāo)記和基因研究提供材料基礎(chǔ)。薛光榮等研究，獲得西瓜花藥再生植株，但是愈傷組織的誘導(dǎo)率及分化率均較低，且重復(fù)性較差[3-4]。袁萬良等通過改良培養(yǎng)基將愈傷組織誘導(dǎo)率從0.5%提高到94.4%[5]。魏瑛研究表明，低溫預(yù)處理對(duì)西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)有促進(jìn)作用[6]。緱艷霞等在西瓜花藥離體培養(yǎng)影響因子研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)添加激素以及4 ℃條件下低溫預(yù)處理也可提高愈傷組織的誘導(dǎo)率[7]。有關(guān)小型西瓜花藥培養(yǎng)至今未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)研究了花藥橫徑大小、激素濃度組合、低溫預(yù)處理、熱激處理對(duì)西瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，旨在確定西瓜花藥培養(yǎng)的最佳條件，為西瓜花藥培養(yǎng)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為齊齊哈爾園藝研究所西甜瓜研究室提供的2份小型西瓜種子，均為高代自交系，分別編號(hào)G1和G2。材料于 2014年 2 月初催芽播種，4 月初定植于溫室，于開花期取新鮮花蕾進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 取材和消毒

于西瓜盛花期晴天08：00—09：00，選擇健壯植株的花蕾，將G1花蕾按照橫徑不同分為4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3組。首先將花蕾于70%的乙醇中表面消毒30 s，再用0.1% 的 HgCl2 浸泡 8 min，最后用無菌水沖洗 3次，每次 5 min。

1.2.2 激素處理

剝?nèi)1和G2無菌花蕾的花藥接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基（蔗糖40 g/L+瓊脂7.5 g/L），分別添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA，共計(jì)9 個(gè)激素組合處理，以不添加任何激素的培養(yǎng)基為對(duì)照（表1）。利用愈傷組織誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 低溫處理

取供試材料G2花蕾120個(gè)，隨機(jī)分為4組，再用濕紗布包裹好，分別于4 ℃下預(yù)處理0、24、48、72 h，花蕾預(yù)處理完畢后，分別剝出花藥接種于“1.2.2”節(jié)篩選出的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶5枚花藥，每個(gè)處理接種6瓶。

1.2.4 熱激處理

采集G2大小一致的花蕾，剝?nèi)』ㄋ幗臃N于篩選出的誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，先在33 ℃條件下12 h的熱激處理后再轉(zhuǎn)為25 ℃培養(yǎng)，以始終25 ℃培養(yǎng)為對(duì)照，各處理接種50枚花藥，共計(jì)10瓶。25 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

以上處理后均置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的花藥數(shù)量/接種的花藥數(shù)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾大小對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將大小不同花蕾的花藥于MS培養(yǎng)基后，置于25 ℃環(huán)境下暗培養(yǎng)25 d后，愈傷組織誘導(dǎo)率見表2。不同大小的花蕾其花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著差異，橫徑在4.6～5.0 mm的花蕾誘導(dǎo)率最高，達(dá)36.00%，顯著高于其他組；其次是橫徑在5.1～5.5 mm的，為24.00%，最低的是橫徑在4.0～4.5 mm 的，僅為18.00%。橫徑為4.6～5.0 mm時(shí)，外植體的褐變率顯著低于其他2組。本試驗(yàn)中西瓜花蕾直徑處于4.6～5.0 mm時(shí)，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好。

2.2 不同激素配比對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2種基因型材料在9種激素組合的培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)出愈傷組織（表3），且愈傷組織誘導(dǎo)率存在一定的差異，2種基因型材料都在M2 （MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別達(dá)到了4552%和3050%；并且M2號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷質(zhì)量最好，外植體褐化率也較低。在試驗(yàn)中還觀察到，不同花藥形成愈傷組織形態(tài)特征不同，一種愈傷組織質(zhì)地疏松，呈綠色或者白色；另一種愈傷組織質(zhì)地緊密、色嫩綠，有光澤，愈傷組織多由花藥頂端及中部由里及外生長(zhǎng)。當(dāng)NAA激素超過1.0 mg/L時(shí)，生成的愈傷組織比較疏松白化，培養(yǎng)時(shí)外植體容易褐化死亡，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)形成的愈傷組織質(zhì)地致密，色澤亮綠，質(zhì)量較好。

2.3 低溫處理時(shí)間對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

利用M2培養(yǎng)基對(duì)G2花藥進(jìn)行培養(yǎng)，研究不同低溫處理時(shí)間對(duì)花藥誘導(dǎo)率的影響（圖1）。當(dāng)?shù)蜏靥幚頃r(shí)間為48 h時(shí)，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)40.67%，處理時(shí)間為 24 h 時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)35.00%，當(dāng)預(yù)處理時(shí)間延長(zhǎng)至72 h時(shí)，誘導(dǎo)率僅有32.33%，但均高于對(duì)照21.00%的誘導(dǎo)率。

2.4 熱激處理對(duì)西瓜花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將G2花藥接種在M2培養(yǎng)基上，將部分培養(yǎng)基于33 ℃下進(jìn)行12 h的熱激處理，之后置于25 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率結(jié)果見表4。進(jìn)行熱激處理的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率顯著低于未經(jīng)處理的對(duì)照，花藥褐化率也明顯高于未進(jìn)行熱激處理的。

3 討論

花粉發(fā)育階段對(duì)誘導(dǎo)雄性單性生殖至關(guān)重要，是能否誘導(dǎo)成功及誘導(dǎo)頻率高低的內(nèi)在因素之一，關(guān)系到是否能產(chǎn)生胚性愈傷組織，進(jìn)而也關(guān)系到培養(yǎng)效果。在大多數(shù)作物花藥培養(yǎng)中，花粉發(fā)育時(shí)期選用的都是單核靠邊期[8]。但在試驗(yàn)中對(duì)每個(gè)花蕾進(jìn)行鏡檢過于麻煩，如果找到適宜誘導(dǎo)愈傷組織形成的花蕾大小，可讓培養(yǎng)過程更加簡(jiǎn)單。本試驗(yàn)中將花蕾按照橫徑不同分為4.0～4.5 mm、4.6～5.0 mm、5.1～5.5 mm 3組，分別進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)果橫徑在4.6～5.0 mm的花蕾誘導(dǎo)率最高，達(dá)36.00%，顯著高于其他組，在后期試驗(yàn)中可以根據(jù)花蕾橫徑進(jìn)行挑選試材。

不同培養(yǎng)基對(duì)植物花藥的培養(yǎng)效果不同。王玉英等在甜椒花藥培養(yǎng)中對(duì)N6、MS、NTH 3種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS和NTH培養(yǎng)基既能很好地產(chǎn)生愈傷組織，也能形成胚狀體[9]。陳肖師將MS、H、B5、Nitsch和NTH 5種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的效果最好[10]。本試驗(yàn)中以MS為基本培養(yǎng)基，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因型材料在9種激素組合的培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但是不同激素組合誘導(dǎo)頻率存在一定的差異。G1基因型花藥愈傷組織誘導(dǎo)率總體要高于G2基因型，但是M2培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L）上2個(gè)基因型的愈傷組織誘導(dǎo)頻率均最高而且質(zhì)量最好，外植體褐化率也較低。后期試驗(yàn)中就可以在MS基本培養(yǎng)基中添加上述激素濃度進(jìn)行誘導(dǎo)。

誘導(dǎo)花藥形成愈傷組織的質(zhì)量受低溫預(yù)處理的時(shí)間長(zhǎng)短影響[11-12]。Sunderland認(rèn)為，低溫作用機(jī)理不在于改變紡錘體的軸向，而在于使花粉保持生活力，使其不在數(shù)天內(nèi)死亡[13]。徐武等推測(cè)低溫處理作用是改變了花藥中內(nèi)源激素的含量，阻斷了花粉正常發(fā)育途徑，使其由配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變[14]。黃斌也認(rèn)為，低溫致使花藥內(nèi)源激素發(fā)生變化，進(jìn)而愈傷組織形成；低溫處理使花藥的壁細(xì)胞及絨氈層逐漸解體，導(dǎo)致小孢子孤立化，使絕大部分小孢子保持其生活力[15]。基于以上研究，本試驗(yàn)對(duì)花藥進(jìn)行了不同時(shí)間的低溫預(yù)處理，結(jié)果表明，低溫處理 48 h時(shí)，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)40.67%，其次是處理時(shí)間為24 h時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)3000%，最低的是處理72 h，僅有32.33%，但均高于對(duì)照處理21.00%的誘導(dǎo)率。表明適宜的低溫預(yù)處理可以提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。

組織褐變的主要原因是由多酚氧化酶催化多酚類物質(zhì)氧化生成褐色物質(zhì)所致，褐變與多酚氧化酶的活性及酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)[16]。夏銘等采用45 ℃處理紅豆杉外植體，發(fā)現(xiàn)熱激處理對(duì)克服褐變是有效的[17]。Martin等研究認(rèn)為熱激處理抑制了多酚氧化酶的合成[18]。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果相反，前期熱激處理的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率明顯偏低，而且褐化率高于未進(jìn)行熱激處理的花藥。本結(jié)果與 Fukumoto 等在冰山萵苣組織培養(yǎng)中的研究結(jié)果[19]一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐滿君，蔣有條. 小西瓜的生育特性及其栽培技術(shù)[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（6）：294-296.

[2]李步勛，陶抵輝，阮萬輝. 西瓜離體組織細(xì)胞染色體加倍技術(shù)的研究和應(yīng)用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（3）：22-24.

[3]薛光榮，余文炎，費(fèi)開偉，等. 西瓜花藥離體培養(yǎng)獲得花粉植株[J]. 植物生理學(xué)通訊，1983（4）：40-42.

[4]薛光榮，余文炎，楊振英，等. 西瓜花粉植株的誘導(dǎo)及其后代初步觀察[J]. 遺傳，1988，10（2）：5-8，49.

[5]袁萬良，付潤(rùn)民，雷保林，等. 西瓜花培試驗(yàn)初報(bào)[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995（1）：29-30.

[6]魏 瑛. 低溫預(yù)處理對(duì)西瓜花藥誘導(dǎo)愈傷組織的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，1999（9）：3.

[7]緱艷霞，張明方. 西瓜花藥離體培養(yǎng)影響因子研究[J]. 北方園藝，2013（10）：117-120.

[8]李 娟，張 麗，李煥秀，等. 西瓜花藥培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 中國瓜菜，2008，21（4）：8-10.

[9]王玉英，郭仲琛，李春玲，等. 甜椒花藥培養(yǎng)的初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1980（1）：33-38，65.

[10]陳肖師. 甜椒花藥培養(yǎng)及‘塞花一號(hào)的育成[J]. 中國蔬菜，1988（3）：5-7.

[11]段 青，吳麗芳，李金澤，等. 洋桔梗花藥培養(yǎng)的影響因素[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：28-31.

[12]陳永勝，邵志敏，李國瑞，等. 蓖麻花藥愈傷組織誘導(dǎo)及防褐化研究[J]，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：39-40.

[13]Sunderland N. Anther culture as a means of haploid production[M]//Kasha K J. Haploids in higher plant：advances and potential. Guelph，Canada：University of Guelph，1974：91-122.

[14]徐 武，李 鳴，張 敬，等. 低溫預(yù)處理過程中大麥花藥內(nèi)源激素的變化[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，1997，24（2）：67-71.

[15]黃 斌. 大麥花藥培養(yǎng)中低溫預(yù)處理對(duì)花粉愈傷組織形成的影響[J]. 植物學(xué)報(bào)，1985，27（4）：439-443.

[16]崔堂兵，郭 勇，張長(zhǎng)遠(yuǎn). 植物組織培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)理及克服方法[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（3）：16-18.

[17]夏 銘，吳絳云，張麗梅. 紅豆杉組織培養(yǎng)中褐變問題的研究[J]. 生物技術(shù)，1996，6（3）：18-20.

[18]Martin-Diana A B，Rico D，Barry-Ryan C，et al. Effect of heat shock on browning-related enzymes in minimally processed Iceberg lettuce and crude extracts[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2005，69（9）：1677-1685.

[19]Fukumoto L R. Toivonen P M A，Delaquis P J. Effect of wash water temperature and chlorination on phenolic metabolism and browning of stored iceberg lettuce photosynthetic and vascular tissues[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（16）：4503-4511.