布依藥野蘇麻的二萜類化學成分研究

李繼新 葉江海 鄒娟 潘爐臺 張敬杰

摘 要 目的：對布依藥野蘇麻的二萜類成分進行研究，為其資源開發(fā)利用提供參考。方法：采用硅膠柱、Sehadex LH-20凝膠柱、MCI柱等對野蘇麻的95%甲醇提取物進行分離純化，通過波譜分析（質(zhì)譜、氫譜、碳譜）技術(shù)鑒定所得化合物的結(jié)構(gòu)，并與民間混用苗藥“喔嘎良”的活性成分進行比對。結(jié)果與結(jié)論：從野蘇麻中分離鑒定出10個二萜類化合物，分別為細錐香茶菜乙素（化合物Ⅰ）、大錐香茶菜乙素（化合物Ⅱ）、細錐香茶菜甲素（化合物Ⅲ）、Enanderianin N（化合物Ⅳ）、細錐香茶菜丁素（化合物Ⅴ）、大錐香茶菜甲素（化合物Ⅵ）、線紋香茶菜酸（化合物Ⅶ）、Rubesanolide D（化合物Ⅷ）、Excisanin D（化合物Ⅸ）、Excisanin K（化合物Ⅹ），其中化合物Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ均為首次從該植物中分離得到;化合物Ⅶ（線紋香茶菜酸）為布依藥野蘇麻與苗藥“喔嘎良”中共同含有的活性成分。

關(guān)鍵詞 布依藥;野蘇麻;二萜類;化學成分;鑒定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the chemical constituents of diterpenoids from Buyi medicine Isodon coetsa， and to provide reference for the development and utilization of the medicinal resources. METHODS： The 95% methanol extract of Buyi medicine I. coetsa were isolated and purified with silica gel column， Sehadex LH-20 gel column and MCI column. The structures of the compounds were obtained by spectral analysis （mass spectrum， hydrogen spectrum and carbon spectrum）， and then compared with active components of Miao medicine “Isodon flavidus”. RESULTS & CONCLUSIONS： Ten diterpenoids were obtained from I. coetsa， including rabdocoetsin B（Ⅰ）， megathgrin B（Ⅱ）， rabdocoetsin A（Ⅲ）， enanderianin N（Ⅳ）， rabdocoetsin D（Ⅴ）， megathyrin A（Ⅵ）， lophanic acid（Ⅶ）， rubesanolide D（Ⅷ）， excisanin D（Ⅸ）， excisanin K（Ⅹ）. The compounds Ⅶ， Ⅸ and Ⅹ were isolated from this specie for the first time. Compound Ⅶ （lophanic acid） is a common active component in the Buyi medicine I. coetsa and Miao medicine “I. flavidus”.

KEYWORDS? ?Buyi medicine; Isodon coetsa; Diterpenoids; Chemical constituents; Identification

布依藥野蘇麻為唇形科香茶菜屬植物細錐香茶菜Isodon coetsa（Buch.-Ham. ex D. Don）Hara.的地上部分，原植物主要分布于我國貴州、廣西、云南、四川等地區(qū)[1]。據(jù)《新華本草綱要》記載，野蘇麻味苦辛，性微溫，具有解表散寒、除風溫的功效[2]。本課題組于2013年8月在黔東南地區(qū)進行苗族傳統(tǒng)醫(yī)藥文化調(diào)研中發(fā)現(xiàn)了一種用于治療腳癬病的苗藥（苗語名：喔嘎良），來源于唇形科香茶菜屬植物淡黃香茶菜Isodon flavidus（Hand.-Mazz.）Hara.，通過成分分析發(fā)現(xiàn)其中含量較高的二萜類成分線紋香茶菜酸（Lophanic acid），并首次明確該成分為喔嘎良治療腳癬病的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。2017年10月，本課題組在隨后的植物資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，貴州開陽地區(qū)的布依族群眾常將淡黃香茶菜與同屬植物細錐香茶菜混用，兩種植物均俗稱為“野蘇麻”，除了將其用于治療腳癬外還用于治療蚊蟲叮咬和無名腫毒。本研究基于民族植物學調(diào)研結(jié)果和香茶菜屬植物研究經(jīng)驗（該屬植物中的貝殼杉烷型、松香烷型、海松烷型二萜類成分是其特征性成分及主要生物活性成分）[4]，運用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)導向分離野蘇麻的特征性二萜類成分，借助核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）等波譜技術(shù)對上述二萜類成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，并與前期對苗藥喔嘎良的成分研究結(jié)果相比對，以期驗證兩種植物在布依族民間同作為“野蘇麻”混用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并為布依藥野蘇麻資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ECX-500 500MHz型超導NMR儀（日本JEOL公司）;Thermo U3000型超高效液相色譜系統(tǒng)，配備二元泵、 自動進樣器、 柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）和在線分析軟件等（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Bruker Compact 型四極桿-飛行時間MS儀（德國Bruker公司）;1100型分析和半制備高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）;WFH-308B型三色紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）;AE240型十萬分之一電子天平（瑞士Metter Toledo公司）;葡聚糖凝膠Sephadex LH-20填料（40～70 ?m，瑞士Pharmacia & Upjohn 公司）;MCI填料（75～150 ?m，日本Mitsubishi Chemical公司）。

1.2 試劑

薄層色譜（GF254）制備用硅膠、柱層析色譜制備用硅膠（100～200、200～300目）均購自青島海洋化工有限公司;氘代試劑（寧波旋光醫(yī)藥科技有限公司）;其余試劑均為分析純和工業(yè)用試劑（天津化學試劑有限公司）;水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 藥材

野蘇麻藥材于2018年9月采自貴陽市開陽縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院趙俊華教授鑒定為唇形科香茶菜屬植物細錐香茶菜I. coetsa（Buch.-Ham.ex D. Don）Hara.的地上部分。植物標本存放于貴州中醫(yī)藥大學貴州省苗醫(yī)藥重點實驗室（憑證標本號：GY20150701）。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物提取分離

取自然干燥野蘇麻藥材8.5 kg，粉碎成粗粉（60～80目），加入8倍量（L/kg）95%甲醇冷浸提取，每次提取4 d，共提取4次;合并提取液，減壓濃縮，得提取物467 g。將該提取物緩慢分散于1.3 L水中使成混懸液，加入3倍量乙酸乙酯萃取，共萃取3次。對水層和萃取層進行溶劑回收，分別得乙酸乙酯部位211 g、水部位238 g。通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UHPLC-Q- TOF-MS2）技術(shù)[4]分析，結(jié)果顯示二萜類成分主要富集于乙酸乙酯部位。

取乙酸乙酯部位與硅膠（100～200目）500 g拌樣，采用硅膠柱（200～300目）層析，以二氯甲烷-乙酸乙酯（10 ∶ 1、8 ∶ 1、4 ∶ 1、6 ∶ 4、1 ∶ 1，V/V）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜法（TLC）以GF254薄層板進行檢測后合并，得Fr.A～F共6組流分。經(jīng)UHPLC-Q-TOF-MS2技術(shù)分析顯示，流分Fr.A（21.3 g）中主要為色素、脂肪酸和酚類等低極性成分（分子量小于200）;流分Fr.F（37.4 g）中主要為三萜和苷類成分（分子量大于500），故未對這2組流分進行系統(tǒng)分離。取流分Fr.B（33.8 g），經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（10 ∶ 1→1 ∶ 1，V/V）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測后合并，用甲醇重結(jié)晶后，得化合物Ⅰ（893.2 g）;將Fr.B余下部分合并入Fr.C（18.7 g），經(jīng)MCI柱脫色后，采用硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（10 ∶ 1→1 ∶ 1，V/V）反復梯度洗脫，用甲醇重結(jié)晶后，得化合物Ⅱ（126.3 mg）、Ⅲ（42.2 mg），經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫并重結(jié)晶后，得化合物Ⅳ（86.7 mg）。取流分Fr.D（43.1 g），經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（10 ∶ 1→7 ∶ 3，V/V）梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫并重結(jié)晶后，得化合物Ⅴ（35.9 mg）、Ⅵ（18.2 mg）。取流分Fr.E（18.1 g），經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水（3 ∶ 7→9 ∶ 1，V/V）梯度洗脫后，經(jīng)TLC檢測后合并，得Fr.E.1～E.3共3個流分，其中Fr.E.2（7.4 g）用甲醇重結(jié)晶得化合物Ⅶ（1.4 g）;剩余母液過濾后與Fr.E.1（6.3 g）合并，通過硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（10 ∶ 1→7 ∶ 3，V/V）梯度洗脫，然后使用Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫，再用石油醚-乙酸乙酯（9 ∶ 1→8 ∶ 2，V/V）梯度洗脫，用甲醇重結(jié)晶得化合物Ⅷ（28.8 mg）;剩余部分與Fr.E.3（4.8 g）合并，經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-乙酸乙酯（20 ∶ 1→4 ∶ 1，V/V）梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫，再經(jīng)半制備高效液相色譜分離（75%甲醇洗脫）、甲醇重結(jié)晶后，得化合物Ⅸ（7.8 mg）、Ⅹ（10.6 mg）。

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：白色塊晶（甲醇）。EI-MS：m/z 391[M+H]+，分子式：C22H30O6。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.27、5.44（each 1H，brs，H2-17），5.28（1H，brs，H-14α），4.78（1H，dd，J=10.8、5.0 Hz，H-1β），4.57、4.47（each 1H，d，J=9.9 Hz，H2-20），1.98（3H，s，OAc），1.12、0.83（each 3H，s，Me-18，19）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：76.0（C-1），25.2（C-2），37.9（C-3），33.7（C-4），48.6（C-5），30.5（C-6），97.9（C-7），58.8（C-8），52.7（C-9），39.3（C-10），18.2（C-11），32.1（C-12），42.5（C-13），73.3（C-14），203.0（C-15），151.2（C-16），118.7（C-17），31.5（C-18），21.7（C-19），63.9（C-20），170.2、20.4（OAc）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[4]基本一致，故鑒定化合物Ⅰ為細錐香茶菜乙素（Rabdocoetsin B）。

化合物Ⅱ：無色塊狀晶體（甲醇）。EI-MS：m/z 351[M+H]+，分子式：C20H30O5。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.05、4.99（each 1H，brs，H2-17），4.24（1H，q，H-11），4.21、4.14（each 1H，dd，J=9.8、5.7 Hz，H-20），3.68（1H，dd，J=11.1、5.9 Hz，H-1β），1.07（3H，s，Me-19），0.81（3H，s，Me-18）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：75.0（C-1），28.4（C-2），40.2（C-3），33.9（C-4），48.6（C-5），34.9（C-6），97.3（C-7），54.2（C-8），51.0（C-9），41.8（C-10），64.1（C-11），42.7（C-12），37.2（C-13），26.5（C-14），75.7（C-15），163.1（C-16），107.8（C-17），32.2（C-18），21.6（C-19），65.1（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[5]基本一致，故鑒定化合物Ⅱ為大錐香茶菜乙素（Megathgrin B）。

化合物Ⅷ：無色晶體（甲醇）。EI-MS：m/z 319[M+H]+，分子式：C20H30O3。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.28（1H，brs，H-14），1.04（3H，d，J=6.8 Hz，H-16），1.03（3H，d，J=6.8 Hz，H-17），0.92（3H，s，H-18），0.91（3H，s，H-19）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：24.7（C-1），18.1（C-2），41.2（C-3），33.4（C-4），41.4（C-5），19.8（C-6），28.8（C-7），81.1（C-8），75.1（C-9），51.8（C-10），26.6（C-11），22.2（C-12），150.7（C-13），117.7（C-14），34.7（C-15），20.2（C-16），20.7（C-17），32.1（C-18），20.0（C-19），178.8（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[11]基本一致，故鑒定化合物Ⅷ為Rubesanolide D。

化合物Ⅸ：白色片狀晶體。EI-MS：m/z 393[M+H]+，分子式：C22H32O6。1H-NMR（CD3OD，600 Hz）δ：6.09（1H，d，J=1.4 Hz，H-17α），5.41（1H，d，J=1.2 Hz，1H，H-17β），4.93（d，J=1.5 Hz，H-14），3.34（1H，p，J=1.6 Hz，H-13），1.55（1H，s，H-OAc），1.24（3H，s，H-20），1.04（3H，s，Me-19）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：81.3（C-1），30.0（C-2），35.0（C-3），37.9（C-4），48.0（C-5），29.9（C-6），75.6（C-7），62.8（C-8），57.4（C-9），46.2（C-10），20.8（C-11），32.5（C-12），53.5（C-13），76.7（C-14），209.3（C-15），150.1（C-16），117.2（C-17），67.9（C-18），20.6（C-19），15.4（C-20），173.0、27.7（OAc）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]基本一致，故鑒定化合物Ⅸ為Excisanin D。

化合物Ⅹ：白色片狀晶體（甲醇）。EI-MS：m/z 373[M+Na]+，分子式：C20H30O5。1H-NMR（CD3OD，600 Hz）δ：6.09（1H，s，H-17），5.40（1H，s，H-17），4.92（1H，s，H-7），3.76～3.63（1H，m，H-18），3.44（1H，d，J=11.1 Hz，H-1），3.32～3.26（1H，m，H-18），2.19～2.00（2H，m，H-2，6），1.91～1.67（2H，m，H-11），1.22（3H，d，J=1.9 Hz，H-20），1.04～1.00（3H，m，Me-19）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：81.6（C-1），30.0（C-2），34.5（C-3），39.5（C-4），48.0（C-5），29.9（C-6），75.8（C-7），62.9（C-8），57.5（C-9），46.3（C-10），27.6（C-11），32.5（C-12），53.5（C-13），76.8（C-14），209.5（C-15），150.2（C-16），117.2（C-17），65.1（C-18），20.7（C-19），15.5（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[13]基本一致，故鑒定化合物Ⅹ為Excisanin K。

3 討論

本研究從野蘇麻藥材中分離鑒定了10個二萜類成分，其中包括8個對映-貝殼杉烷型二萜類化合物，即細錐香茶菜乙素（化合物Ⅰ）、大錐香茶菜乙素（化合物Ⅱ）、細錐香茶菜甲素（化合物Ⅲ）、Enanderianin N（化合物Ⅳ）、細錐香茶菜丁素（化合物Ⅴ）、大錐香茶菜甲素（化合物Ⅵ）、Excisanin D（化合物Ⅸ）、Excisanin K（化合物Ⅹ），其中化合物Ⅸ、Ⅹ為首次從該植物中分離得到的7，20-環(huán)氧對映-貝殼杉烷型二萜生源前體。此外，首次從該植物中分離得到松香烷二萜成分線紋香茶菜酸（化合物Ⅶ），該化合物對腳癬致病菌——紅色毛廯菌（Trichophyton rubrum）的最小抑菌濃度為62.5 ?g/mL[3]。本研究通過化學成分研究證實了布依藥野蘇麻與苗藥喔嘎良均含有相同的抗菌成分——線紋香茶菜酸，初步驗證了其與苗藥喔嘎良在貴州民間被混用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為進一步研究開發(fā)野蘇麻民族藥資源提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2020-03-19 修回日期：2020-09-09）

（編輯：段思怡）