衍生化HPLC法測定酒石酸伐尼克蘭中甲醛和乙二醛的含量

管藝同，胡芃薇，鄒文宇，陸宇婷，宋 敏，杭太俊

（中國藥科大學藥物分析系，南京210009）

酒石酸伐尼克蘭（varenicline tartrate）是輝瑞制藥公司研發(fā)的一種成人戒煙藥，商品名為暢沛（Champix）。伐尼克蘭與α4β2尼古丁乙酰膽堿受體具有高度親和力，結(jié)合后產(chǎn)生激動作用，同時阻斷尼古丁與該受體結(jié)合，從而發(fā)揮戒煙作用［1］。酒石酸伐尼克蘭的合成路線見圖1［2］，其中7，8，9，10-四氫-8-（三氟乙酰基）-6，10-甲橋-6H-吡嗪并［2，3-H］［3］苯并氮雜?為合成過程中的重要中間體，以下簡稱中間體（intermediate）。

Figure 1 Synthetic route of vareniclinetartrate

乙二醛為酒石酸伐尼克蘭合成過程中的起始原料之一，主要由乙二醇空氣氧化法制備，同時含有副產(chǎn)物甲醛［3］。因此，在酒石酸伐尼克蘭中同時易有甲醛和乙二醛殘留。由于甲醛和乙二醛均具有神經(jīng)毒性和致突變性［4-5］，屬于基因毒性雜質(zhì)，長期攝入會對人體造成損害。此外它們還會與藥物中的氨基發(fā)生反應，產(chǎn)生降解雜質(zhì)［6］。故需要對酒石酸伐尼克蘭中殘留的甲醛和乙二醛進行嚴格控制。

人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議指南（ICH M7）［7］中甲醛的推薦口服限度為每日0.2 mg/kg。酒石酸伐尼克蘭片的服藥周期為3~6個月，參考歐洲藥品管理局（EMA）［8-9］發(fā)布的基因毒性雜質(zhì)限度指南，應采用毒理學關(guān)注閾值（TTC）每日5μg作為上述雜質(zhì)的可接受限度?？紤]到煙癮復發(fā)的可能性，將每日允許最大攝入量設(shè)定為1.5μg。由于甲醛和乙二醛產(chǎn)生毒性的作用模式一致，故規(guī)定上述雜質(zhì)限度的總和為每日1.5μg。按照酒石酸伐尼克蘭日服用量2 mg計算，規(guī)定甲醛和乙二醛的在原料藥中的限度各自為375μg/g。酒石酸伐尼克蘭中甲醛和乙二醛含量的同時測定方法尚無文獻報道。

藥品中甲醛的測定方法主要有分光光度法［10］604、衍生化-高效液相色譜法［11］、衍生化-頂空氣相色譜法［12］等。乙二醛的測定方法主要有分光光度法［13］和衍生化-高效液相色譜法［14］等。分光光度法靈敏度不高、選擇性較低，且多為半定量方法，無法準確測定甲醛和乙二醛的含量。衍生化-頂空氣相色譜法為操作較繁瑣，且精密度和準確度較差。本研究利用甲醛和乙二醛均可與2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反應的性質(zhì)，選用柱前衍生化-高效液相色譜法，研究建立酒石酸伐尼克蘭中基因毒性雜質(zhì)甲醛和乙二醛含量的同時測定方法。

1 材料

1.1 藥品與試劑

2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH，薩恩化學技術(shù)有限公司）；鹽酸（南京化學試劑股份有限公司）；乙腈（天地化學試劑有限公司）；37%甲醛水溶液、40%乙二醛水溶液（阿拉丁試劑有限公司）；酒石酸 伐 尼 克 蘭（批 號：AFN21701、AFN21702、AFN21703）和中間體（批號：FN21701粗品、FN21702粗品、FN21703粗品、FN21701、FN21702、FN21703）（嘉逸醫(yī)藥有限公司）。

1.2 儀器

1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BS 21S分析天平（德國Satrious公司）；實驗室超純水機（南京妙之儀電子科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制及衍生化方法

2.1.1 衍生化試劑溶液 稱取2，4-DNPH約100 mg，置于50 mL量瓶中，加適量溶劑（乙腈-水，50∶50，下同）溶解后，加鹽酸0.5 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含2，4-DNPH約為2.0 mg和HCl 0.12 mmol的溶液，作為衍生化試劑溶液。

2.1.2 混合雜質(zhì)對照品儲備液 取37%甲醛水溶液和40%乙二醛水溶液各約240 mg，分別精密稱定，置于同一25 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含甲醛和乙二醛均約為3.75 mg的溶液。精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升中含甲醛和乙二醛均約為37.5μg的溶液，作為混合雜質(zhì)對照品儲備液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.1.3 雜質(zhì)限度對照溶液 精密量取混合雜質(zhì)對照品儲備液250μL，置于10 mL量瓶中，加衍生化試劑溶液1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升中含甲醛和乙二醛均約為0.94μg的溶液。置60℃水浴加熱2.0 h，使甲醛和乙二醛與2，4-DNPH反應生成腙，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，作為雜質(zhì)限度對照溶液。

2.1.4 供試品溶液 取供試品約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加適量溶劑溶解，加衍生化試劑溶液1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升中含主成分2.5 mg的溶液。置60℃水浴加熱2.0 h，使供試品中殘留的基因毒性雜質(zhì)甲醛和乙二醛與2，4-DNPH反應生成腙，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜條件

采用C8色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-水（50∶50）為流動相A，乙腈-水（95∶5）為流動相B，線性梯度洗脫（A∶B）：0 min（100∶0）→3 min（100∶0）→10 min（0∶100）→10.1 min（100∶0）→15 min（100∶0），流速1 mL/min，柱溫30℃，進樣盤溫度10℃，自動進樣20μL，檢測波長380 nm。

2.3 條件的選擇與優(yōu)化

2.3.1 檢測波長的選擇 經(jīng)檢測，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙的最大吸收波長分別為356 nm和437 nm，為實現(xiàn)同時測定，需兼顧二者并選擇合理檢測波長。取“2.1.3”項下的雜質(zhì)限度對照溶液，分別在360，380和400 nm條件下進樣測定，記錄色譜圖（圖2）。結(jié)果表明，380 nm條件下甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙均有較好且相近的紫外響應，故選擇380 nm作為檢測波長。

Figure 2 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly?oxal-2,4-DNPH dihydrazone detected at different wavelengthes at limit reference concentration

2.3.2 衍生化反應條件優(yōu)化 醛與肼的反應屬于羰基的親核加成反應，衍生條件對反應程度有重要影響［15］。GB/T 2912.3－2009［16］中規(guī)定甲醛的衍生條件為于60℃水浴加熱30 min。有研究表明，pH為5時，甲醛與2，4-DNPH反應最完全［15］。從酸種類、反應溫度、反應時間、2，4-DNPH加入量、pH等方面探討能夠使甲醛和乙二醛充分、穩(wěn)定且快速衍生化的最佳反應條件。

（1）酸種類的選擇 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液500μL，置于2個10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL，分別加0.12 mol/L鹽酸溶液1 mL和1%乙酸溶液1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻。置70℃水浴加熱1.5 h，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，分別進樣測定，記錄色譜圖。峰面積參數(shù)見表1，結(jié)果表明，表明采用鹽酸能夠顯著提升乙二醛的轉(zhuǎn)化效率，乙二醛全部生成專屬性的衍生產(chǎn)物乙二醛-2，4-DNPH二腙，不生成乙二醛-2，4-DNPH單腙，故選擇鹽酸調(diào)節(jié)衍生化體系的pH。

（2）反應溫度的選擇 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液250μL，置于10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL和0.12 mol/L鹽酸溶液1 mL，加溶劑稀釋至刻度，平行配制5份。分別置40、50、60、70和80℃水浴加熱1.5 h，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，分別進樣測定，記錄色譜圖。峰面積參數(shù)見圖3，結(jié)果表明60℃條件下甲醛和乙二醛均充分反應，且溶劑相對不易揮發(fā)，故選擇60℃作為反應溫度。

Table 1 Peak areas(mAU)of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and glyoxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation acid at limit referenceconcentration

Figure 3 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly?oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation temperatureat limit referenceconcentration

（3）反應時間的選擇 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液250μL，置于10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL和0.12 mol/L鹽酸溶液1 mL，加溶劑稀釋至刻度，平行配制7份。分別置60℃水浴加熱0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 h，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，分別進樣測定，記錄色譜圖。峰面積參數(shù)見圖4，結(jié)果表明2.0 h時甲醛和乙二醛均充分反應，且效率較高，故選擇反應時間為2.0 h。

（4）2,4-DNPH加入量的選擇 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液250μL，置于6個10 mL量瓶中，分別加0.12 mol/L鹽酸溶液1 mL與2 mg/mL 2，4-DNPH溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1和1.5 mL（分別相當于體系中含2，4-DNPH 40、80、120、160、200和300μg/mL），加溶劑稀釋至刻度，搖勻。置60℃水浴加熱2.0 h，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，分別進樣測定，記錄色譜圖。峰面積參數(shù)見圖5，結(jié)果表明，體系中含2，4-DNPH 200μg/mL時足以使1.88μg/mL的甲醛和乙二醛充分反應，故選擇在反應體系中加入2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL。

Figure 4 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly?oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation time at limit reference concentration

Figure 5 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly?oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different concentra?tion of 2,4-DNPH at limit reference concentration

（5）pH的選擇 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液250μL，置于7個10 mL量瓶中，分別加2 mg/mL 2，4-DNPH 1 mL和0.12 mol/L鹽酸溶液50、100、200、500、1 000、2 000和3 000μL（分別相當于體系中含HCl 0.6、1.2、2.4、6、12、24和36 mmol/L），加溶劑稀釋至刻度，搖勻。置60℃水浴加熱2.0 h，放至室溫后，用0.45μm濾膜過濾，分別測定pH并進樣測定，記錄色譜圖。峰面積參數(shù)見圖6，結(jié)果表明，體系中含12 mmol/L HCl，即pH約為1.76時甲醛和乙二醛可充分反應，且主成分自身性質(zhì)引起的pH波動基本不會造成影響，故選擇在反應體系中加入0.12 mol/L鹽酸溶液1 mL。

Figure 6 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly?oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different pH at limit reference concentration

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 在建立的HPLC條件下，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙（經(jīng)ESIQ-TOF加合離子準確質(zhì)量驗證）的保留時間分別為5.67和9.15 min，各雜質(zhì)衍生產(chǎn)物峰形尖銳、分離良好，空白溶劑、衍生化試劑和主成分對各雜質(zhì)衍生產(chǎn)物的測定均無干擾（圖7）。

Figure 7 HPLC chromatograms for simultaneous formaldehyde and glyoxal test

2.4.2 線性范圍 精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液25、50、75、100、125、175、250、375和500μL，分別照“2.1.3”項下方法制備雜質(zhì)對照溶液（分別相當于限度濃度的10%、20%、30%、40%、50%、70%、100%、150%和200%）。照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。以各雜質(zhì)衍生產(chǎn)物的峰面積（A）對其質(zhì)量濃度（c，μg/mL）進行線性回歸，分別得到甲醛的回歸方程為：A=416 783c+15 978（r=0.999 7）；乙二醛的回歸方程為：A=568 473c+1 388.4（r=0.999 9）。結(jié)果表明，甲醛和乙二醛均在0.094~1.88μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用外標法計算供試品中的雜質(zhì)含量。

2.4.3 檢測限和定量限 根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020年版）通則9101［10］482中“響應值標準偏差和標準曲線斜率法”計算，甲醛和乙二醛的檢測限均約為0.047μg/mL，定量限均約為0.094μg/mL。

為進一步驗證，精密量取“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液25μL，照“2.1.3”項下的方法制成反應前各雜質(zhì)質(zhì)量濃度均為0.094μg/mL的對照溶液6份，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面積的RSD分別為0.5%和0.3%，均小于2%，符合靈敏度的要求。

2.4.4 準確度 取已測定甲醛和乙二醛含量的中間體成品（批號：FN21701）約25 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加適量溶劑溶解，分別精密加入“2.1.2”項下的混合雜質(zhì)對照品儲備液125，250，375μL，照“2.1.3”項下的方法制成低（50%）、中（100%）、高（150%）濃度的加樣回收率試驗溶液，每個濃度各3份；同時照“2.1.3”和“2.1.4”項下的方法制備雜質(zhì)限度對照溶液和供試品溶液各2份。取上述各溶液，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度，分別計算加樣回收率。

根據(jù)甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙的峰面積，計算測定甲醛和乙二醛的平均回收率分別為95.0%和99.4%，RSD分別為1.2%和2.6%。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020年版）通則9101［10］482中回收率限度的規(guī)定，100μg/g水平的雜質(zhì)回收率應在85%~110%范圍內(nèi)，表明本法準確度良好。

2.4.5 精密度

（1）進樣精密度 照“2.1.3”項下的方法制備雜質(zhì)限度對照溶液，照“2.2”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果表明，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面積的RSD分別為0.1%和0.2%，均小于2%，表明儀器進樣精密度良好。

（2）重復性 照“2.4.4”項下的方法制備中濃度（100%）的加樣回收率試驗溶液6份，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度，分別計算加樣回收率。結(jié)果表明，甲醛和乙二醛的平均回收率分別為95.4%和101.7%，RSD分別為0.8%和2.7%。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020年版）通則9101［10］482中精密度可接受范圍的規(guī)定，100μg/g水平的雜質(zhì)重復性RSD在4%以內(nèi)，表明本法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性

（1）混合雜質(zhì)對照品儲備液穩(wěn)定性 取照“2.1.2”項下的方法新鮮配制的混合雜質(zhì)對照品儲備液，與在-20℃冰箱儲存10 d的混合雜質(zhì)對照品儲備液適量，照“2.1.3”項下的方法制備成雜質(zhì)限度對照溶液各3份，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，6份雜質(zhì)限度對照溶液中，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面積的RSD分別為0.7%和0.9%，均小于2%，表明在混合雜質(zhì)對照品儲備液-20℃放置10 d穩(wěn)定。

（2）進樣穩(wěn)定性 照“2.4.4”項下的方法制備低（50%）、高（150%）濃度的加樣回收率試驗溶液與不加樣的低（50%）、高（150%）濃度的對照溶液。分別在0，2，4，6.5和10 h，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各溶液中甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙不同時間點峰面積的RSD分別為0.1%~0.2%和0.1%~0.3%，均不超過2%，表明雜質(zhì)限度對照溶液和加樣回收率試驗溶液在10℃放置10 h內(nèi)，均穩(wěn)定。

2.5 樣品測定

照“2.1.3”和“2.1.4”項下的方法配制雜質(zhì)限度對照溶液和供試品溶液，照“2.2”項下條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算各雜質(zhì)的含量。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，酒石酸伐尼克蘭及其中間體成品中甲醛和乙二醛的含量均符合基因毒性雜質(zhì)的限度要求，中間體粗品中乙二醛的含量易超過限度要求。所以，生產(chǎn)過程中的精制工藝對甲醛和乙二醛實現(xiàn)了有效控制。

Table 2 Test results of formaldehyde and glyoxal in different batches of vareniclinetartrate and intermediate

3 結(jié)論

本文建立了一種柱前衍生化-高效液相色譜分析酒石酸伐尼克蘭及其中間體中微量甲醛和乙二醛的含量測定方法，該方法具有樣品處理便捷、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，非常適用于酒石酸伐尼克蘭中微量甲醛和乙二醛的快速準確檢測，對于其他藥品中的醛類雜質(zhì)含量測定也具有一定的參考價值。