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    蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5抑制劑研究進(jìn)展

    2021-07-08 10:24:34詹康寧黃張建趙立文
    關(guān)鍵詞:精氨酸殘基底物

    詹康寧,全 旭,黃張建,趙立文*

    (1中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心,南京210009;2南京圣和藥業(yè)股份有限公司,南京210038)

    蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT)催化的精氨酸胍基甲基化,是一種常見的真核生物細(xì)胞翻譯后修飾,影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、DNA重組和修復(fù)等多種生物學(xué)過程[1-4]。作為PRMT家族的成員,PRMT5介導(dǎo)的甲基化在維持正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡中發(fā)揮重要作用。然而,越來(lái)越多的研究表明,PRMT5的異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生相關(guān),目前已被認(rèn)定為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)[5]。本文介紹了PRMT5的結(jié)構(gòu)、生化功能及其與腫瘤的相關(guān)性,對(duì)目前在研的PRMT5抑制劑進(jìn)行綜述,并討論了PRMT5抑制劑的未來(lái)發(fā)展方向。

    1 PRMT家族

    PRMTs甲基化特定精氨酸胍基氮原子,由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)提供甲基,同時(shí)釋放出一個(gè)分子的S-腺苷-L-同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine,SAH)。根據(jù)修飾形式,將PRMTs分成3類(圖1):第1類(PRMT1、2、3、4、6、8)催化形成ω-NG-單甲基精氨酸(monomethyl?arginines,MMA)和ω-NG,NG-不對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginines,aDMA);第2類(PRMT5、9)催化形成ω-NG-MMA和ω-NG,N'G對(duì)稱二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginines,sD?MA);第3類(PRMT7)只催化ω-NG-MMA的形成[6]。PRMT1和PRMT5分別是主要的aDMA和sDMA形成酶,兩者相較于其他PRMTs底物更多,目前研究表明在多種腫瘤中PRMT5表達(dá)水平升高[5]。

    圖1 3種PRMTs催化精氨酸甲基化反應(yīng)

    2 PRMT5的結(jié)構(gòu)特征

    PRMT5是細(xì)胞中主要的sDMA形成酶,N端為TIM桶狀結(jié)構(gòu)蛋白(TIMbarrel),C端是甲基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(圖2)[7-8]。TIMbarrel與甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體蛋白50(methylosome protein 50,MEP50)結(jié)合形成活性更高的復(fù)合體[9]。甲基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域由底物結(jié)合位點(diǎn)和SAM結(jié)合位點(diǎn)組成,這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)通過一條狹窄的疏水通道(由Leu312、Phe327和Trp579形成)相連,使底物和SAM接近。活性部位有兩個(gè)高度保守的谷氨酸殘基(E435和E444)形成雙E環(huán)。每個(gè)谷氨酸殘基與底物精氨酸的胍基形成一對(duì)鹽橋,從而允許甲基從SAM通過SN2過渡態(tài)轉(zhuǎn)移到精氨酸殘基上[10]。

    圖2 PRMT5:MEP50復(fù)合體的總體結(jié)構(gòu)(PDB:4GQB)(A)和放大的H4R3底物肽結(jié)合槽(B)[11]

    在一項(xiàng)對(duì)線蟲PRMT5的突變研究中,將底物口袋中的保守殘基之一Phe379變?yōu)榈鞍彼?,可以?shí)現(xiàn)H4R3同時(shí)進(jìn)行sDMA和aDMA[7]。同樣的,當(dāng)人PRMT5中相應(yīng)位置的Phe327突變也相應(yīng)導(dǎo)致aDMA活性增強(qiáng)[7]。Phe327是PRMT5特有的殘基,與sDMA功能密切相關(guān),這可能是設(shè)計(jì)PRMT5特異性抑制劑時(shí)要考慮的一個(gè)重要因素。

    3 PRMT5的生化功能

    PRMT5廣泛存在于細(xì)胞核和胞漿中,通過調(diào)控組蛋白及多種非組蛋白的甲基化修飾影響各種細(xì)胞過程。

    PRMT5通過許多核質(zhì)底物的甲基化起作用,包括組蛋白H2A、H3和H4[12],Sm蛋白[13],RAF蛋白[14]等等。組蛋白精氨酸sDMA被認(rèn)為是一種阻遏標(biāo)記,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[12]。也有證據(jù)表明PRMT5通過Sm蛋白甲基化參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物正確的mRNA結(jié)構(gòu)性剪接[15]。PRMT5通過RAF蛋白甲基化調(diào)控RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路[14]。

    部分非組蛋白也被鑒定為PRMT5的底物,在細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16-18]。例如,在DNA損傷時(shí),PRMT5甲基化腫瘤抑制因子p53的3個(gè)精氨酸(Arg333,Arg335,Arg337),改變了p53與DNA的結(jié)合活性,進(jìn)而觸發(fā)p53控制的基因表達(dá)程序改變[17]。此外,PRMT5可甲基化轉(zhuǎn)錄因子E2F-1和NF-κB的P65,從而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)[19-20]。并且PRMT5也可與其他細(xì)胞蛋白結(jié)合,如高爾基體蛋白GM130、核糖體蛋白S10,分為維持高爾基體結(jié)構(gòu)和核糖體正確組裝[21-22]。

    4 PRMT5與腫瘤的關(guān)系

    最近幾年,作為一個(gè)抗腫瘤藥物靶點(diǎn),PRMT5越來(lái)越引起科學(xué)界的關(guān)注。它在多種腫瘤中過表達(dá),包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌、前列腺癌等,并在不同腫瘤中發(fā)生機(jī)制不同[5]。

    例如,在臨床上越來(lái)越多人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病例的發(fā)生與PRMT5過表達(dá)相關(guān)[23]。研究發(fā)現(xiàn),定位于腫瘤細(xì)胞胞漿的長(zhǎng)非編碼RNA,LINC00515與SNHG16,分別通過miR-16與miR-4518調(diào)節(jié)PRMT5高表達(dá),招募并限制腫瘤抑制基因ST7與PTEN的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[24-25]。相同的,PRMT5在人肺癌組織中顯示高表達(dá),在組織培養(yǎng)中,下調(diào)PRMT5的表達(dá)和使用PRMT5選擇性抑制劑可明顯抑制肺癌A549和H1299細(xì)胞的增殖。研究顯示PRMT5是蛋白激酶B的上游調(diào)節(jié)因子,直接與蛋白激酶B共定位并相互作用,從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞增殖[26]。在前列腺癌中,PRMT5通過表觀基因激活前列腺癌細(xì)胞中雄激素受體(androgen receptor,AR)的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[27]。免疫共沉淀結(jié)果顯示PRMT5與負(fù)責(zé)AR轉(zhuǎn)錄的主要轉(zhuǎn)錄因子Sp1、ATP依賴的染色質(zhì)重塑劑BRG相互作用,誘導(dǎo)AR基因啟動(dòng)子區(qū)域的H4R3對(duì)稱甲基化,激活并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。因此敲減PRMT5或用特定的PRMT5抑制劑會(huì)減少AR的表達(dá),從而抑制AR陽(yáng)性(而非陰性)的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[18]。

    此外,由于代謝酶5-甲硫腺苷磷酸化酶(5'-methylthioadenonine phosphorylase,MTAP)基因與人類染色體9p21上的抑癌基因CDKN2A非常接近,因此在CDKN2A基因缺失的腫瘤中經(jīng)常伴隨MTAP缺失,是腫瘤中突變頻率最高的基因之一。MTAP缺失使其底物甲硫腺苷(methylthio?adenosine,MTA)積累,MTA能選擇性抑制PRMT5甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,并使其對(duì)進(jìn)一步的PRMT5抑制更為敏感[28]。這表明PRMT5抑制劑可以成為MTAP缺失或低表達(dá)腫瘤患者的一種高度選擇性的治療方法。

    5 新型PRMT5抑制劑

    近年來(lái),PRMT5作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)受到特別關(guān)注[11,16,29-34]。目前已有大量PRMT5小分子抑制劑報(bào)道,根據(jù)化合物是否占據(jù)SAM結(jié)合位點(diǎn),可將其分為兩類,SAM非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和SAM競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,其中SAM非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑占據(jù)底物結(jié)合位點(diǎn)與底物競(jìng)爭(zhēng),而SAM競(jìng)爭(zhēng)抑制劑則是占據(jù)SAM的結(jié)合位點(diǎn)。

    5.1 SAM非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

    5.1.1 EPZ015666 EPZ015666是第一個(gè)報(bào)道的具有細(xì)胞增殖抑制活性且可口服的PRMT5抑制劑,其IC50為22 nmol/L[35]。在一組5種髓細(xì)胞白血?。╩yeloid cell leukemia,MCL)細(xì) 胞 系(Z-138,Maver-1,Mino,Granta-519和Jeko-1)中,EPZ015666以濃度依賴的方式降低了SmD3甲基化水平和細(xì)胞增殖效應(yīng),在PRMT5基因敲除細(xì)胞中也觀察到同樣的SmD3降低。利用細(xì)胞熱位移分析進(jìn)一步確認(rèn)EPZ015666與細(xì)胞內(nèi)的PRMT5特異性結(jié)合。該化合物在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性,靜脈給藥2 mg/kg后,AUC0-t為1 110 h·ng/mL,t1/2為1.38 h,分布體積為1.67 L/kg,血漿清除率為30 mL/(kg·min)。小鼠經(jīng)口給予10 mg/kg,cmax為3 500 ng/mL,AUC0-t為3 847 h·ng/mL,t1/2為1.62 h,生物利用度為69%[36]。在一項(xiàng)Z-138皮下異種移植腫瘤小鼠模型的21 d體內(nèi)藥效學(xué)研究試驗(yàn)中,經(jīng)口給予EPZ015666(200 mg/kg,po,bid),腫瘤生長(zhǎng)抑制率接近95%[36]。

    PRMT5:MEP50-SAM-EPZ015666共晶結(jié)構(gòu)顯示(圖3),在SAM存在下,EPZ015666結(jié)合在肽結(jié)合部位,提示它是與肽底物(Ki=5±0.3 nmol/L)而非輔因子SAM發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。為了找到EPZ015666對(duì)PRMT5高選擇性的原因,進(jìn)一步對(duì)晶體結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)EPZ015666與許多殘基相互作用,在sDMA過程中起重要作用。特別是四氫異喹啉(THIQ)結(jié)構(gòu)在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用:(1)THIQ的苯環(huán)與SAM之間存在陽(yáng)離子-π相互作用;(2)THIQ環(huán)與PRMT5特有的殘基Phe327形成潛在的π-π堆積作用,其他PRMTs在該位置的殘基是Met[7];(3)THIQ位于由Leu319、Tyr324、Phe327和Trp579形成的疏水小口袋中,不利于極性官能團(tuán)或體積大的基團(tuán);(4)THIQ的叔胺氮原子在水介導(dǎo)下與E435相互作用,影響整體催化過程。此外,EPZ015666的手性羥基和E444的側(cè)鏈之間可能存在氫鍵相互作用,因此EPZ015666與之對(duì)應(yīng)的立體異構(gòu)體活性會(huì)有較大差異。EPZ015666的末端嘧啶基團(tuán)也和Phe327、Phe580有π-π堆積作用。上述相互作用可能是EPZ015666對(duì)PRMT5的高親和力和高選擇性的原因[36]。

    圖3 EPZ015666與PRMT5:MEP50和SAM的共晶結(jié)構(gòu)(PDB:4X61)[35]

    5.1.2 GSK3326595 化合物GSK3326595保持了THIQ結(jié)構(gòu),PRMT5酶抑制活性IC50為6.2 nmol/L,該化合物分別通過調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中p53與人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Z-138中p21的活性抑制SW480與Z-138增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。在Z-138皮下腫瘤異種移植小鼠模型中,GSK3326595有效抑制腫瘤體積(0.2~100 mg/kg,po,bid或50~200 mg/kg,po,qd)。同時(shí)該化合物呈現(xiàn)良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性,靜脈給藥1 mg/kg后,AUC0-t為415 h·ng/mL,t1/2為1.42 h,分布體積為1.42 L/kg,血漿清除率為39 mL/(kg·min)。小鼠經(jīng)口給予1 mg/kg,cmax為1 050 ng/mL,AUC0-t為3 450 h·ng/mL,t1/2為0.25 h,生物利用度為80.7%[37]。它具有良好的腦通透性和抗腫瘤效果,目前開展的兩項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn),用于評(píng)價(jià)其在治療實(shí)體瘤、非霍奇金淋巴瘤(NCT02783300)和骨髓增生異常綜合征、急性髓性白血?。∟CT03614728)的安全性和臨床療效。

    5.1.3 其他PRMT5非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 為了開發(fā)更有效的PRMT5抑制劑,研究人員將GSK3326595的2位側(cè)鏈移至3位,得到了一系列活性化合物,如化合物1對(duì)PRMT5具有很高的抑制活性(IC50=26 nmol/L)[38]。在此基礎(chǔ)上,默沙東公司利用環(huán)合策略獲得了3,4-二氫-2,6-萘啶-1-酮類抑制劑,結(jié)果提示了手性羥基對(duì)PRMT5的氫鍵作用的重要性。經(jīng)過分離得到了不同構(gòu)型的小分子化合物2和化合物3,其中一個(gè)化合物的活性(IC50=10.84 nmol/L)明顯強(qiáng)于另一個(gè)化合物(IC50=481.5 nmol/L)。有趣的是,在化合物2和化合物3的萘啶酮4位引入兩個(gè)甲基得到了活性更高的化合物4(IC50=1.53 nmol/L)和化合物5(IC50=56.89 nmol/L),提示在這個(gè)位置可能還存在除了能夠與Phe327和Phe580形成π-π堆積之外的其他的作用力,因此值得開展進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化探索[39]。此外,阿古諾公司將THIQ替換成三環(huán)結(jié)構(gòu),得到一系列化合物,其中代表的化合物6與GSK3326595極為類似,PRMT5酶抑制活性IC50為10 nmol/L[40]。

    此外,研究人員在EPZ015666的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了一種新型萘環(huán)抑制劑,經(jīng)過優(yōu)化后得到了DCC01(IC50=2.8μmol/L),它能夠呈劑量依賴地抑制一些腫瘤細(xì)胞(Z-138、Maver-1和Jeko-1)增殖[41]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,DC-C01的2位上苯環(huán)類似于EPZ015666的末端嘧啶,可能與Phe327和Phe580形成π-π堆積,而1位側(cè)鏈上的苯環(huán)則可能與SAM形成陽(yáng)離子-π相互作用,并且有可能與Phe327產(chǎn)生π-π堆積[41]。

    5.2 SAM競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑

    5.2.1 A9145C PRMTs含有高度保守的輔因子SAM甲基轉(zhuǎn)移結(jié)合域,而SAH和天然產(chǎn)物西奈芬凈則是SAM的結(jié)構(gòu)類似物,兩者均顯示出良好的PRMT5抑制活性,但對(duì)其他PRMTs缺乏選擇性。A9145C是早期基于西奈芬凈結(jié)構(gòu)研發(fā)出的SAM競(jìng)爭(zhēng)抑制劑,在與PRMT5:MEP50和H4組蛋白肽段的晶體結(jié)構(gòu)中顯示,A9145C可以和SAM結(jié)合域中的幾個(gè)殘基(如,Asp419、Met420、Glu392和Try324)互相作用,但是它產(chǎn)生相互作用的結(jié)構(gòu)與SAM對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)一致,包括腺苷部分的主體與兩個(gè)氫鍵、尾部的羧基,僅有C5氨基部分可能與組蛋白H4產(chǎn)生額外的相互作用,因此它雖然能很好地結(jié)合在SAM結(jié)合域中,但仍然缺乏對(duì)PRMT5的選擇性[9]。

    5.2.2 LLY-283 在后續(xù)的研究中,MTA被證明是一種有效的、選擇性的PRMT5抑制劑[28]。這一發(fā)現(xiàn)提示模擬SAM結(jié)構(gòu)的核苷類似物有望對(duì)PRMT5產(chǎn)生較好的選擇性抑制活性。為此,2018年,發(fā)現(xiàn)了一種有效的選擇性PRMT5抑制劑LLY-283,具有較強(qiáng)的PRMT5酶抑制活性,IC50為20 nmol/L[42]。LLY-283是SAM的類似物,其中苯基取代了SAM中的蛋氨酸部分,且與核糖的構(gòu)象十分類似。除了與相同殘基的相互作用外,LLY-283的苯基與PRMT5特有的殘基Phe327形成π-π堆積[42]。此外研究發(fā)現(xiàn),將吡咯嘧啶換成其他芳雜環(huán)基團(tuán)時(shí),酶抑制活性下降[43]。在體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中,LLY-283對(duì)在許多血液瘤和實(shí)體腫瘤細(xì)胞系(HCC1937、NUGC3、MV4-11、NCI-HI1930、A375等20余種)中都觀察到了強(qiáng)大的抗增殖作用。在人黑色素瘤A375腫瘤異種移植小鼠模型中,給藥28 d,LLY-283(20 mg/kg,qd)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)[42]。該化合物具有良好的ADME性能,小鼠經(jīng)口給予10 mg/kg,cmax為3 646 ng/mL,AUC0-t為7 943 h·ng/mL,t1/2為3.41 h,生 物 利 用 度 為50%[42]。

    5.2.3 JNJ6461978 JNJ64619178是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的基于SAM結(jié)構(gòu)的模擬核苷類似物(NCT03573310),采用環(huán)戊烷替代了SAM中的四氫呋喃環(huán)。它對(duì)PRMT5酶的抑制活性IC50為6.3 nmol/L,并對(duì) 一 組 肺 癌 細(xì) 胞(A549、NCI-H441、H1048、HCC78)表現(xiàn)良好的增殖抑制活性[44-45]。分子對(duì)接顯示,喹啉環(huán)與Phe327形成π-π堆積,并且可能占據(jù)了組蛋白底物精氨酸的位置,而喹啉上的氨基則與雙E環(huán)中的E444相互作用。這種相互作用方式表明,JNJ64619178對(duì)SAM和底物都有潛在的競(jìng)爭(zhēng)性作用[34]。

    5.2.4 其他SAM競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 LLY-283和JNJ64619178的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了更多研究者對(duì)SAM競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的興趣。鑒于PRMT5的活性位點(diǎn)附近有一個(gè)特有的半胱氨酸C449,人們推測(cè)其可作為潛在的共價(jià)修飾位點(diǎn)[34]。最近,Prelude公司報(bào)道一個(gè)醛類化合物7,它和PRMT5的相互作用與LLY-283類似,所不同的是,該化合物的醛基能額外地與C449巰基產(chǎn)生親核加成反應(yīng),在生理pH條件下,形成的中間體會(huì)自動(dòng)消除一分子水,從而形成乙烯基硫醚(圖4)。該化合物顯示良好的PRMT5選擇性,IC50為19.5 nmol/L[46]。研發(fā)共價(jià)抑制劑不僅有利于提高對(duì)化合物的選擇性,或許還有助于將來(lái)解決PRMT5抑制劑潛在的耐藥性。

    圖4 乙烯基硫醚的形成過程

    6 總結(jié)與展望

    近年來(lái),PRMT5抑制劑已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn),然而目前已報(bào)道的大多數(shù)抑制劑仍局限于類似的骨架結(jié)構(gòu)。在不同腫瘤發(fā)生過程中,PRMT5導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制各有不同且部分尚未明確,為了更好地了解PRMT5的治療潛力,還需要挖掘更多關(guān)于PRMT5功能的生物學(xué)信息。

    對(duì)于SAM非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,諾華公司和Agios公司對(duì)該類抑制劑底物結(jié)合的模式進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)EPZ015666能夠有效地抑制許多細(xì)胞株的體外生長(zhǎng),但缺乏腫瘤細(xì)胞株選擇性,并且它對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力與細(xì)胞中MTAP的狀態(tài)無(wú)關(guān),這就有可能在臨床試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化為潛在的毒性[28,47]。在MTAP缺乏的細(xì)胞中,MTA累積并部分抑制細(xì)胞中的PRMT5,使腫瘤細(xì)胞對(duì)PRMT5抑制劑敏感。這可能提供一個(gè)新的結(jié)合思路,設(shè)計(jì)一種小分子協(xié)同MTA與PRMT5結(jié)合,并特異性結(jié)合MTA:PRMT5復(fù)合物,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

    總之,隨著對(duì)PRMT5生化功能的進(jìn)一步研究,各類化合物與PRMT5結(jié)合的共晶結(jié)構(gòu)的不斷被報(bào)道,安全的PRMT5抑制劑逐漸被人們所發(fā)現(xiàn)并最終應(yīng)用于臨床,使腫瘤患者獲益。

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    精氨酸、可樂定、精氨酸聯(lián)合左旋多巴不同激發(fā)試驗(yàn)對(duì)GH分泌的影響
    精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用
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