醛酮還原酶AKR1C3介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥的作用及其機(jī)制

王凱振，楊婉婉，徐晟瑤，郭青龍，趙 麗

（中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京210009）

乳腺癌（breast cancer，BC）是女性中最常見的腫瘤［1-2］。其治療方案包括手術(shù)切除、化療、放療和聯(lián)合治療［3］?；煹哪退幮砸恢笔抢_BC患者臨床治療的難題［4］。阿霉素（doxorubicin，DOX）是被廣泛使用的一線化療藥物，可以顯著降低乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和病死率［5］。但是，乳腺癌患者在化療過程中會(huì)對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)細(xì)胞暴露于累積劑量的阿霉素時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥表型，而且阿霉素耐藥細(xì)胞通常也會(huì)對(duì)其他化療藥物表現(xiàn)出顯著的交叉耐藥［6］。

AKR1C3是醛酮還原酶家族（aldo-keto reduc?tases，AKRs）的一員，是體內(nèi)類固醇代謝的關(guān)鍵酶，AKR1C3異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致類固醇代謝紊亂，從而引起各種疾病。AKR1C3參與了體內(nèi)性激素的合成，在性激素依賴性的疾病中起著舉足輕重的作用。它可以作用于雄激素受體（AR）、雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）來調(diào)節(jié)雄激素、雌激素和孕激素的含量［7］。近年來，AKR1C3在多種腫瘤中的促癌作用已被證實(shí)［8-9］，但在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展中的作用及作用機(jī)制卻存在爭議［9］。為進(jìn)一步研究AKR1C3在乳腺癌耐藥中的作用和內(nèi)在機(jī)制，本研究構(gòu)建了乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株及AKR1C3高表達(dá)和敲低細(xì)胞株，以此為研究對(duì)象，揭示其對(duì)阿霉素耐藥的介導(dǎo)作用，為臨床乳腺癌的治療提供新思路與方法。

1 材料

1.1 藥品和試劑

阿霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；DMEM培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）及0.25%胰蛋白酶溶液（美國Gibco公司）；β-catenin特異性抑制劑XAV939（上?；偕锟萍加邢薰荆秽堰拭顾兀o錫納奧生物醫(yī)藥有限公司）；AKR1C3過表達(dá)質(zhì)粒OE（北京安諾倫生物科技有限公司）；AKR1C3敲低質(zhì)粒shRNAAKR1C3（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒（上海翊圣生物技術(shù)股份有限公司）；DAPI染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）；核漿分離試劑盒（南京凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Bcl-2，Bax一抗（武漢Abclonal公司）；AKR1C3（英國Abcam公司）；Wnt3a，p-GSK-3β，β-catenin，LaminA/C，β-actin一抗（武漢protein?tech公司）；HRP山羊抗兔IgG和HRP山羊抗鼠IgG（武漢Abclonal公司）。其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

正置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）；多功能酶標(biāo)儀，PCR擴(kuò)增儀（美國Thermo公司）。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7細(xì)胞接種于含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 建立耐藥細(xì)胞系

采用濃度梯度遞增法［10］，建立阿霉素乳腺癌MCF-7耐藥細(xì)胞系并命名為MCF-7/DOX。首先，在無菌避光條件下稱取一定量的阿霉素固體粉末于EP管中，加入無菌水，避光超聲使之充分溶解，使母液濃度為10 mmol/L，過濾除菌后于-20℃避光保存。然后，將接種的MCF-7細(xì)胞在0.5μmol/L阿霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，洗掉死亡細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞后增加阿霉素藥物劑量，逐步篩選，最終得到的耐藥細(xì)胞株命名為MCF-7/DOX。

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)和敲低AKR1C3細(xì)胞株

將AKR1C3過表達(dá)質(zhì)粒OE和AKR1C3敲低質(zhì)粒shRNA-AKR1C3用慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集病毒上清液，過濾分裝于-80℃保存。用病毒上清液侵染MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞，然后用2μmol/L嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選兩周后，選出一個(gè)穩(wěn)定生長的細(xì)胞進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，最終得到穩(wěn)定高表達(dá)AKR1C3的MCF-7細(xì)胞株（MCF-7/AKR1C3）和穩(wěn)定低表達(dá)AKR1C3的MCF-7/DOX的細(xì)胞株（MCF-7/DOX-KD）。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)期生長狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞，消化后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板上，24 h后，加入含有不同濃度的阿霉素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，37℃孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸收度，計(jì)算細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)平行測定3次。耐藥指數(shù)（RI［10］）=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

2.5 DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞，消化后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在提前放置好玻片的6孔板中，待細(xì)胞爬片穩(wěn)定后加入不同濃度含有阿霉素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出細(xì)胞爬片按照DAPI染色試劑盒操作進(jìn)行染色，最后用熒光顯微鏡拍照觀察凋亡情況。

2.6 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖

將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7和MCF-7/DOX細(xì)胞置于6孔板中，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，用阿霉素處理后培養(yǎng)12～14 d。存活細(xì)胞克隆用4%甲醛固定20 min后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，沖洗干凈晾干后進(jìn)行拍照觀察細(xì)胞增殖情況。

2.7 Western blot檢測Wnt/β-catenin通路蛋白及凋亡蛋白的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD的細(xì)胞，消化后以每孔6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板上，培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上，收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量法測定細(xì)胞蛋白濃度，在樣品中加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液使用100℃金屬浴加熱10 min進(jìn)行蛋白變性；進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠：90 V，30 min；分離膠120 V，90 min），電泳后轉(zhuǎn)膜2 h至硝酸纖維素膜（NC膜）上，使用5%脫脂奶粉溶液封閉60 min；一 抗（β-actin、LaminA/C、β-tubulin、AKR1C3、Wnt3a、p-GSK-3β、β-catenin、Bax、Bcl-2，1∶1 000）4℃孵育過夜；使用PBST清洗3次，每次10 min，加入HRP山羊抗兔IgG和HRP山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）搖動(dòng)孵育1 h；PBST清洗3次，使用蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

2.8 QRT-PCR檢測AKR1C3基因的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD的細(xì)胞均勻接種在6孔板上，培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上。收集細(xì)胞，使用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，加入SYBR Green，使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃15 s，60℃1 min，95℃1 min，65℃10 s，一共35個(gè)循環(huán)。采用GAP?DH作為內(nèi)參，所用引物序列如表1。

2.9 核漿分離檢測β-catenin的入核變化

將對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD細(xì)胞，消化后以每孔6×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板上，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率為80%以上。收集細(xì)胞，用核漿分離試劑盒提取與分離核漿蛋白，得到蛋白樣品后按照“2.7”項(xiàng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.10 免疫熒光檢測β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)外的分布

取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的MCF-7、MCF-7/AKR1C3、MCF-7/DOX以及MCF-7/DOX-KD細(xì)胞，接種于提前放置好玻片的6孔板上，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后取出6孔板。用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定5 min后，加入0.3%Triton反應(yīng)5~15 min，PBS洗3次，每次5 min。然后，加入3%BSA封閉2 h；PBS洗3次，每次5 min。加入βcatenin一抗80~100μL（1∶100）后，置于37℃，1 h后，4℃過夜。然后，PBST洗3次，每次5 min。避光，加入HRP山羊抗兔IgG二抗溶液，常溫反應(yīng)30~40 min，PBST洗4次，每次5 min。最后，加入含抗熒光淬滅劑的DAPI封片液進(jìn)行封片；封片后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以xˉ±s表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞株的建立

本研究采用濃度梯度遞增法，成功建立了對(duì)阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/DOX。用CCK-8細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn)，檢測到阿霉素對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為（2.865±0.042 13）μmol/L，而對(duì)MCF-7/DOX細(xì)胞的IC50為（171.0±0.027 23）μmol/L（圖1-A，圖1-B）。MCF-7/DOX細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)（RI）約為60倍。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX對(duì)阿霉素的耐藥性，用DAPI染色檢測凋亡細(xì)胞情況。如圖1-C所示，1.0、2.0μmol/L阿霉素處理對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞24 h后，相比于耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX，敏感株細(xì)胞MCF-7可以明顯觀察到核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，大小不一內(nèi)含核碎片的凋亡小體，表示細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡。

Figure 1 Effects of different concentrations of doxorubicin(DOX)on cell viability and apoptosis in MCF-7 and doxorubicin-resistant cell line MCF-7/DOX（xˉ±s,n=3）

3.2 AKR1C3在耐藥乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)

已有報(bào)道表明，在乳腺癌細(xì)胞中AKR1C3的表達(dá)水平較正常乳腺細(xì)胞中高［8］，而且AKR1C3的上調(diào)常常與不良預(yù)后有關(guān)［11］。在本研究中，Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX中，AKR1C3的表達(dá)水平較敏感株乳腺癌細(xì)胞MCF-7明顯升高（圖2-A）。同時(shí)，QRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，耐藥細(xì)胞株MCF-7/DOX中，AKR1C3水平升高了約251.3倍（圖2-B）。上述結(jié)果表明，在乳腺癌耐藥細(xì)胞中，AKR1C3表達(dá)水平上調(diào)可能與阿霉素耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。

3.3 AKR1C3介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)阿霉素耐藥

為了進(jìn)一步研究AKR1C3在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，本研究在MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)AKR1C3蛋白，構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞株MCF-7/AKR1C3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)細(xì)胞株MCF-7/AKR1C3中AKR1C3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（圖3-A），AKR1C3的mRNA水平提高了157倍（圖3-B）。

本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MCF-7/AKR1C3細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。結(jié)果顯示，阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3和MCF-7細(xì)胞的IC50分別為（14.460±0.043）μmol/L和（2.425±0.034）μmol/L。MCF-7/AKR1C3細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)（RI）約為6（圖3-C）。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1μmol/L和2μmol/L的阿霉素對(duì)于MCF-7/AKR1C3細(xì)胞的集落形成能力幾乎無影響，卻可以顯著地抑制MCF-7細(xì)胞的集落形成（圖3-D）。DAPI染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3細(xì)胞凋亡幾乎無影響，而低濃度的阿霉素卻可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生明顯的核膜核仁破碎，染色質(zhì)固縮成新月形聚集，凋亡小體形成，細(xì)胞發(fā)生更多的凋亡（圖3-E）。

Figure 2 Expression of AKR1C3 in MCF-7 and MCF-7/DOX cells（xˉ±s,n=3）

為了進(jìn)一步確證AKR1C3介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞耐藥的作用，本研究構(gòu)建了敲低MCF-7/DOX的AKR1C3的細(xì)胞株MCF-7/DOX-KD，并檢測了其對(duì)阿霉素的敏感性（圖3-F，3-G），CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素對(duì)MCF-7/DOX和MCF-7/DOX-KD細(xì)胞的IC50分別為（186.5±0.021 17）μmol/L和（95.16±0.036 46）μmol/L，降低了約50%（圖3-H）。

以上結(jié)果表明，過表達(dá)AKR1C3可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性，低表達(dá)AKR1C3會(huì)增加細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，證實(shí)了AKR1C3在乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥中具有介導(dǎo)作用。

3.4 β-catenin通路參與AKR1C3介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥的過程

有報(bào)道稱β-catenin與許多腫瘤的耐藥性密切相關(guān)［12-13］。為了研究AKR1C3介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞阿霉素耐藥與β-catenin的關(guān)聯(lián)性，本研究檢測了在AKR1C3高表達(dá)細(xì)胞MCF-7/AKR1C3中Wnt/βcatenin通路蛋白表達(dá)情況。如圖4-A所示，Wnt3a和p-GSK-3β均高表達(dá)，說明MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中該通路被激活。核漿分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中胞質(zhì)β-catenin含量減少，核內(nèi)表達(dá)增多（圖4-B），同時(shí)免疫熒光結(jié)果也印證MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中β-catenin入核增多（圖4-C）。

在敲低AKR1C3之后，免疫熒光結(jié)果表明胞質(zhì)β-catenin含量增多，核內(nèi)表達(dá)減少（圖4-D），這與Western blot結(jié)果中的Wnt/β-catenin通路受到抑制，核內(nèi)β-catenin含量減少一致（圖4-E，4-F）。以上結(jié)果表明，β-catenin可能參與了AKR1C3對(duì)乳腺癌細(xì)胞阿霉素的介導(dǎo)作用。

3.5 β-catenin抑制劑XAV939能夠逆轉(zhuǎn)AKR1C3介導(dǎo)的阿霉素耐藥

為了進(jìn)一步確證β-catenin在AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥中的作用，本研究使用β-catenin特異性抑制劑XAV939來抑制胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平。結(jié)果表明，XAV939不僅會(huì)抑制β-catenin總蛋白水平，也會(huì)其降低核內(nèi)的表達(dá)水平（圖5-A）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10μmol/L XAV939與阿霉素聯(lián)用能顯著提高阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3乳腺癌細(xì)胞的抑制率（IC50=5.340±0.065μmol/L），與單用阿霉素相比IC50降低了約70%（圖5-B）。同時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白的檢測也發(fā)現(xiàn)XAV939能顯著提高阿霉素對(duì)MCF-7/AKR1C3細(xì)胞中凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并減低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（圖5-C）。以上結(jié)果說明，AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥部分由β-catenin通路介導(dǎo)。

4 討 論

本研究探討了AKR1C3/β-catenin軸在乳腺癌阿霉素耐藥中的作用，證明了AKR1C3可能通過Wnt/β-catenin介導(dǎo)了MCF-7細(xì)胞的阿霉素耐藥。關(guān)于AKR1C3參與乳腺癌阿霉素耐藥雖然已有報(bào)道，但大多數(shù)報(bào)道認(rèn)為，AKR1C3是作為氧化還原酶，將阿霉素還原成低毒性的阿霉素醇，從而降低了阿霉素的毒性作用。本研究主要探討AKR1C3在生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用，旨在闡明其酶活之外的阿霉素耐藥的介導(dǎo)作用。

Figure 3 Effect of AKR1C3 on thesensitivity of DOX in MCF-7 cells（xˉ±s,n=3）

Figure 4 Effect of AKR1C3 on the Wnt/β-catenin pathway in MCF-7 and MCF-7/DOX cells（xˉ±s,n=3）

本研究發(fā)現(xiàn)AKR1C3在阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。AKR1C3基因過表達(dá)或敲低可增強(qiáng)或抑制乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性，這反映在細(xì)胞活力、集落形成能力和凋亡的結(jié)果上。深入研究發(fā)現(xiàn)，AKR1C3誘導(dǎo)的阿霉素耐藥性可能與βcatenin信號(hào)通路相關(guān)。過表達(dá)的AKR1C3促進(jìn)βcatenin的入核，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞集落形成能力，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的阿霉素耐藥性；敲低AKR1C3減少β-catenin的核轉(zhuǎn)位，降低乳腺癌細(xì)胞活力，減弱癌細(xì)胞的耐藥性。然而，相比于敏感株細(xì)胞MCF-7，即使敲低AKR1C3的細(xì)胞株MCF-7/DOX-KD對(duì)阿霉素的敏感性仍然較低，提示在阿霉素耐藥過程中，除AKR1C3之外，還有其他通路影響耐藥細(xì)胞的敏感性，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。XAV939是一種有效的端錨聚合酶（TNKS）1和2小分子抑制劑，通過抑制TNKS活性，增加腫瘤細(xì)胞中Axin-GSK3β復(fù)合物的蛋白水平，并促進(jìn)β-catenin的降解［14］。當(dāng)用XAV939處理MCF-7阿霉素耐藥細(xì)胞之后，β-catenin核內(nèi)含量降低，增強(qiáng)阿霉素對(duì)MCF-7/DOX的凋亡誘導(dǎo)作用。但AKR1C3是如何調(diào)控β-catenin的核內(nèi)表達(dá)水平，以及β-catenin是如何發(fā)揮其耐藥作用仍需進(jìn)一步的研究。已有研究報(bào)道，芳香烴受體（AhR）可增強(qiáng)三陰性乳腺癌中AKR1C3啟動(dòng)子活性，調(diào)控AKR1C3的表達(dá)進(jìn)而影響對(duì)阿霉素的敏感性［11］。也有報(bào)道AhR可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的特征［15］。那么，AhR是否通過影響AKR1C3介導(dǎo)的β-catenin入核來調(diào)控乳腺癌阿霉素耐藥，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在阿霉素耐藥乳腺癌MCF-7細(xì)胞模型中，AKR1C3/β-catenin是阿霉素耐藥的原因之一，靶向AKR1C3/β-catenin在乳腺癌阿霉素耐藥的治療中可能具有良好的應(yīng)用前景。

Figure 5 Effects ofβ-catenin inhibitor XAV939 combined with DOX on the cell viability and apoptosis in MCF-7 and MCF-7/AKR1C3 cells（xˉ±s,n=3）