中華絨螯蟹致病性弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定及其藥敏特性

黃曉東 周慧華 安健 楊先樂(lè) 曹海鵬

摘要：【目的】明確中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌及其藥敏特性，為該病的臨床診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎脗鹘y(tǒng)方法從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺組織中分離病原菌，通過(guò)人工回歸感染試驗(yàn)確定病原菌的致病性，利用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA序列分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并以K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定其藥敏特性?！窘Y(jié)果】從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株（C1、C2、C3和C4），人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明，僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現(xiàn)死亡，死亡率達(dá)90%，且試驗(yàn)中華絨螯蟹出現(xiàn)黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥，與自然發(fā)病的癥狀基本一致。依據(jù)C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果，可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii），其對(duì)健康中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量（LD50）為2.85×105 CFU/mL。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，C1菌株對(duì)新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感，對(duì)多粘菌素B中度敏感，對(duì)氨芐西林、羧芐青霉素和萬(wàn)古霉素3種抗生素已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）?！窘Y(jié)論】弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力，實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用新霉素、多西環(huán)素等漁用抗生素進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 中華絨螯蟹;黑鰓病;弗氏檸檬酸桿菌;分離鑒定;藥敏特性

0 引言

【研究意義】中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱(chēng)河蟹、大閘蟹，廣泛分布在我國(guó)沿海和湖泊地區(qū)，是江蘇、安徽、湖北、浙江和遼寧等地區(qū)的重要特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種（付龍龍等，2017）。近年來(lái)，隨著中華絨螯蟹市場(chǎng)需求量的不斷增加，其養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，年產(chǎn)量已超過(guò)81萬(wàn)t（農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局，2017）。但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖密度及規(guī)模的不斷擴(kuò)大，加上殺蟲(chóng)劑和除藻劑的大量使用，導(dǎo)致其養(yǎng)殖環(huán)境惡化，各種病害頻發(fā)，尤其是弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）引起的細(xì)菌性病害給中華絨螯蟹養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（唐玉華和胡賓，2015）。因此，加快中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌的鑒定及藥敏特性檢測(cè)，對(duì)確保中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】弗氏檸檬酸桿菌隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病，嚴(yán)重制約水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，如紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）暴發(fā)性死亡（沈錦玉等，2005）、施氏鱘（Acipenser schrenckii）腫嘴?。钜票蟮龋?013）、中華鱉（Pelodiscus sinensis）腮腺炎（毛爍君等，2015）、中華絨螯蟹敗血癥（姜光明等，2016）、棘腹蛙（Paa boulengeri）水腫病（李曉英等，2016）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）暴發(fā)性死亡（肖寧等，2016）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）黑鰓病（馮藝等，2017）等均由弗氏檸檬酸桿菌引起。弗氏檸檬酸桿菌具有鞭毛和菌毛，二者均為細(xì)菌的黏附素，有助于細(xì)菌侵入機(jī)體后黏附于細(xì)胞表面，經(jīng)定居、繁殖及釋放大量?jī)?nèi)毒素而引起宿主發(fā)病甚至死亡（郭志燕等，2014）。關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發(fā)病的研究已有報(bào)道，在遼寧（盤(pán)錦）、河北等地養(yǎng)殖的中華絨螯蟹曾先后暴發(fā)過(guò)弗氏檸檬酸桿菌病，但對(duì)比發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)發(fā)生的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀完全不同，有的患病中華絨螯蟹表現(xiàn)為肝胰腺、鰓和肌肉輕度水腫，且部分肝胰腺和鰓組織呈腐爛狀（李華等，2001）;有的患病中華絨螯蟹則腹腔內(nèi)有積水，其鰓組織呈暗灰色、肝胰腺呈淺黃色（陳翠珍等，2006）。因此，有必要明確弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹發(fā)病但表現(xiàn)出不同臨床癥狀的致病機(jī)理，并制定出科學(xué)的用藥方案及防控措施。【本研究切入點(diǎn)】2017年8月，江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)的中華絨螯蟹出現(xiàn)嚴(yán)重黑鰓病，具體癥狀表現(xiàn)為病蟹行動(dòng)遲緩，攝食減少或不攝食，鰓呈黑色，肝胰腺呈淺黃色，與已報(bào)道的中華絨螯蟹弗氏檸檬酸桿菌病癥狀（李華等，2001;陳翠珍等，2006;姜光明等，2016）有所不同，因此急需鑒定其病原并科學(xué)用藥以減少經(jīng)濟(jì)損失?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹黑鰓病進(jìn)行病原菌分離鑒定，并采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定其藥敏特性，以期為該病的臨床診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

具有典型黑鰓病癥狀的中華絨螯蟹由江蘇省某養(yǎng)殖場(chǎng)提供，平均體重49.8 g/只，共16只;健康中華絨螯蟹由上海崇明某養(yǎng)殖場(chǎng)提供，平均體重28.3 g/只，共150只。藥敏紙片購(gòu)自杭州濱河微生物試劑有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和無(wú)菌生理鹽水由國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)（上海海洋大學(xué)）自制。

1. 2 病原菌分離

選取具有典型發(fā)病癥狀的瀕死中華絨螯蟹，病蟹以75%酒精表面消毒后無(wú)菌采取其肝胰腺組織，再用無(wú)菌接種環(huán)取樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，30 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，待菌落長(zhǎng)出后進(jìn)行菌株純化，最后將純化菌株轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色鏡檢，或4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工回歸感染試驗(yàn)

選取無(wú)病傷、體質(zhì)健壯、規(guī)格均勻的健康中華絨螯蟹進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組10只中華絨螯蟹。試驗(yàn)前用無(wú)菌生理鹽水分別洗下?tīng)I(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上的菌落，采用稀釋涂布平板法測(cè)定并以無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度至5.0×106 CFU/mL。試驗(yàn)組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液（徐海圣等，2002），對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。養(yǎng)殖水溫28 ℃，試驗(yàn)周期7 d，期間每天記錄試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡數(shù)量，觀察其病癥，及時(shí)撈出死蟹并再次進(jìn)行病原菌分離，確定其致病性。

1. 4 病原菌鑒定

參照Underwood和Avsion（2004）的方法采用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)病原菌株進(jìn)行生理生化鑒定，然后參照馮藝等（2017）的方法以16S rRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。分離菌株的16S rRNA序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并通過(guò)鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（肖艷翼等，2015）。

1. 5 病原菌毒力測(cè)定

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組10只中華絨螯蟹。試驗(yàn)前用無(wú)菌生理鹽水將分離菌株制備成2.0×104～2.0×107 CFU/mL的菌懸液，試驗(yàn)組中華絨螯蟹分別在第三步足基部注射0.1 mL菌懸液（徐海圣等，2002），對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)周期7 d，期間每天記錄試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡數(shù)量，及時(shí)撈出死蟹進(jìn)行病原菌分離鑒定，并根據(jù)概率單位圖解法測(cè)定分離菌株對(duì)中華絨螯蟹的半數(shù)致死劑量（LD50）。

1. 6 病原菌藥敏特性測(cè)定

參照陳永亮等（2015）的K-B藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株的藥敏特性，并根據(jù)杭州濱河微生物試劑有限公司的《紙片法藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)》判定其對(duì)各種抗生素的敏感度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離結(jié)果

從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中共分離獲得4株疑似病原菌株，暫命名為C1、C2、C3和C4。人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，僅C1菌株感染中華絨螯蟹后出現(xiàn)死亡，死亡率達(dá)90%，且試驗(yàn)中華絨螯蟹出現(xiàn)黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥（圖1），與自然發(fā)病的癥狀基本一致;從人工感染的發(fā)病中華絨螯蟹肝胰腺中可再次分離獲得與C1菌株生理生化特性一致的菌株，因此判定C1菌株是引起中華絨螯蟹黑鰓病的病原菌。C1菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落呈圓形，灰白色，表面光滑濕潤(rùn)、半透明;革蘭氏染色呈陰性，菌體短桿狀（圖2）。

2. 2 病原菌鑒定結(jié)果

采用API 20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)C1菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果（表2）表明，C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌（C. freundii），其鑒定結(jié)果的可信度為99.3%;與弗氏檸檬酸桿菌參考菌株（楊移斌等，2013）的生理生化特性一致，且C1菌株16S rRNA序列（GenBank登錄號(hào)MK069596）與GenBank中已有弗氏檸檬酸桿菌參考菌株16S rRNA序列的同源性達(dá)99%（表3）。由基于16S rRNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3）也可看出，C1菌株與弗氏檸檬酸桿菌I-T-1-3株（GenBank登錄號(hào)KU570303）的親緣關(guān)系最近。因此，依據(jù)C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析結(jié)果，可確定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌。

2. 3 病原菌毒力檢測(cè)結(jié)果

以不同濃度（2.0×104～2.0×107 CFU/mL）的菌懸液分別對(duì)健康中華絨螯蟹進(jìn)行注射感染，導(dǎo)致中華絨螯蟹的死亡率達(dá)20%～100%（表4）;而注射無(wú)菌生理鹽水的中華絨螯蟹未出現(xiàn)任何病癥及死亡現(xiàn)象，說(shuō)明試驗(yàn)中華絨螯蟹的死亡為C1菌株感染所致。根據(jù)概率單位圖解法建立的死亡概率（y）與懸液菌濃度對(duì)數(shù)（x）關(guān)系曲線方程為y=0.683x+1.274（R2=0.9823），即C1菌株對(duì)健康中華絨螯蟹的LD50為2.85×105 CFU/mL。

2. 4 病原菌的藥敏特性

由表5可知，C1菌株對(duì)新霉素、阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星和恩諾沙星等9種抗生素高度敏感，對(duì)多粘菌素B中度敏感，對(duì)氨芐西林、羧芐青霉素和萬(wàn)古霉素3種抗生素已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）。

3 討論

黑鰓病是中華絨螯蟹常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一，其病原菌有氣單胞菌（曹海鵬，2015）、產(chǎn)吲哚黃金桿菌（鄭世雄，2013）等，但關(guān)于弗氏檸檬酸桿菌引起中華絨螯蟹黑鰓病的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。弗氏檸檬酸桿菌是一種人—畜—水生動(dòng)物共患致病菌（薛巧等，2015），能產(chǎn)生多種毒力因子，不僅具有蛋白酶活性、溶血活性和形成生物膜的能力，還有鞭毛和菌毛等黏附素，有助于侵入機(jī)體后黏附于細(xì)胞表面形成生物膜，通過(guò)定居、繁殖及釋放大量毒素引起溶血和細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體損傷（郭志燕等，2014;Heo et al.，2017），說(shuō)明弗氏檸檬酸桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的致病力與這些毒力因子密切相關(guān)。陳紅蓮等（2014）研究表明克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌X120523株的LD50為3.16×107 CFU/mL，馮藝等（2017）研究發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦源弗氏檸檬酸桿菌CF9527株的LD50為1.68×106 CFU/mL。本研究從患黑鰓病的中華絨螯蟹肝胰腺中分離獲得1株弗氏檸檬酸桿菌（C1菌株），人工感染健康中華絨螯蟹后表現(xiàn)出黑鰓、肝胰腺呈淺黃色的病癥，與自然發(fā)病的癥狀基本一致，對(duì)應(yīng)的LD50為2.85×105 CFU/mL，其毒力高于弗氏檸檬酸桿菌X120523株（陳紅蓮等，2014）和CF9527株（馮藝等，2017），可能與弗氏檸檬酸桿菌不同菌株攜帶的毒力因子種類(lèi)和數(shù)量不同有關(guān)。此外，養(yǎng)殖環(huán)境突變可促使中華絨螯蟹產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，消耗大量能量而降低抵抗力（李華等，2001）。因此，弗氏檸檬酸桿菌對(duì)中華絨螯蟹的致病性與養(yǎng)殖環(huán)境惡化也有一定關(guān)系。

弗氏檸檬酸桿菌不同菌株通常也存在理化特性差異。李華等（2001）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株與陳翠珍等（2006）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在肌醇發(fā)酵特性方面存在明顯差異。因此，弗氏檸檬酸桿菌的鑒定需要以生理生化鑒定結(jié)合16S rRNA序列分析為依據(jù)。本研究依據(jù)C1菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析結(jié)果，最終判定C1菌株為弗氏檸檬酸桿菌，即弗氏檸檬酸桿菌可感染引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)C1菌株與李華等（2001）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株在檸檬酸鹽利用、肌醇發(fā)酵等生化特性方面存在差異，與陳翠珍等（2006）分離獲得的中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌HQ010516B-1株在β-半乳糖苷酶、脲酶等生化特性方面存在差異，可能與地區(qū)、氣候和水質(zhì)條件等因素有關(guān)（李小波和黃文芳，2003），但具體原因有待進(jìn)一步探究。

近年來(lái)，雖然基于中藥、益生菌等新型抗生素替代品的疾病防控技術(shù)研究取得顯著進(jìn)展，但由于這些抗生素替代品尚存在應(yīng)用效果不穩(wěn)定、成本較高、基礎(chǔ)理論研究不完善等問(wèn)題（王熙濤等，2015），因此，合理使用和選擇有效抗生素仍是防控細(xì)菌性疾病的主要手段。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，C1菌株對(duì)多西環(huán)素、新霉素和恩諾沙星等漁用抗生素高度敏感，可作為防治中華絨螯蟹黑鰓病的首選藥物;但C1菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素的敏感性與中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌9773株（李華等，2001）和HQ010516B-1株（陳翠珍等，2006）存在差異，說(shuō)明中華絨螯蟹源弗氏檸檬酸桿菌不同菌株間也存在藥敏特性差異。因此，臨床用藥時(shí)必須依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果有針對(duì)性地選擇最有效的藥物進(jìn)行治療，以減輕病原菌的耐藥性和提高病害防控效果。C1菌株對(duì)氨芐西林和羧芐青霉素等青霉素類(lèi)抗生素已產(chǎn)生耐藥性，與陳翠珍等（2006）、Heo等（2017）對(duì)弗氏檸檬酸桿菌耐藥性的研究結(jié)果相同，可能與弗氏檸檬酸桿菌普遍攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因有關(guān)（吳榮輝等，2013）。

4 結(jié)論

弗氏檸檬酸桿菌感染可引起中華絨螯蟹黑鰓病，且對(duì)中華絨螯蟹具有較強(qiáng)毒力，實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用新霉素、多西環(huán)素等漁用抗生素進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）